氨基酸分析PPT課件.ppt

1,氨基酸分析,2,氨基酸分析在蛋白質(zhì)化學(xué)和生物技術(shù)研究、臨床診斷和細(xì)胞生理學(xué)研究、營(yíng)養(yǎng)學(xué)與衛(wèi)生保健、培育農(nóng)作物優(yōu)良品種、食品、制藥等領(lǐng)域具有非常重要的意義。,3,第一節(jié)氨基酸的基本結(jié)構(gòu)及性質(zhì),一、定義氨基酸是分子中含有氨基和羧基的一類(lèi)化合物。組成蛋白質(zhì)的氨基酸只有二十種。,4,二十種氨基酸中有八種為人體必需氨基酸。人體必需的氨基酸：人體內(nèi)不能合成，只有靠食物供給的氨基酸。各種蛋白質(zhì)含氨基酸的種類(lèi)和數(shù)量都各不相同。,5,二、氨基酸的分類(lèi)和命名,（一）分類(lèi)1、根據(jù)氨基酸的酸堿性,6,酸性氨基酸,二個(gè)羧基一個(gè)氨基,天冬氨酸谷氨酸,堿性氨基酸,一個(gè)羧基二個(gè)或二個(gè)以上氨基,賴(lài)氨酸精氨酸組氨酸,中性氨基酸,一個(gè)羧基一個(gè)氨基,實(shí)際水溶液呈弱酸性：電離能力COOHNH2,7,2、化學(xué)特性,疏水性：AlaValLeuIlePheProMet帶電：ArgLysAspGlu(His)極性：SerThrCysAsnGlnHisTyrTrp特殊：Gly(Pro),8,帶電氨基酸,9,極性氨基酸,10,(二）命名,系統(tǒng)命名法：氨基作為取代基，羧酸為母體稱(chēng)為氨基某酸；習(xí)慣上：氨基的位置用、等表示2.俗名：多按其來(lái)源或某些性質(zhì)而命名如氨基乙酸因其具有甜味而被稱(chēng)命名為甘氨酸,11,（三）氨基酸的立體化學(xué),由蛋白質(zhì)水解的氨基酸都為-氨基酸，除甘氨酸外，所有-C都為手性碳原子。天然的氨基酸均為L(zhǎng)-氨基酸,12,在糖化學(xué)中，D、L構(gòu)型的參照物為甘油醛：,L-甘油醛,D-甘油醛,L-氨基酸,D-氨基酸,13,三、氨基酸的化學(xué)性質(zhì),（一）氨基酸的兩性電離和等電點(diǎn)1.兩性電離：氨基酸分子中含有-NH2和-COOH；為簡(jiǎn)化起見(jiàn)可表示為：,14,它們發(fā)生分子內(nèi)酸堿反應(yīng)：,兩性離子,從平衡式可知，氨基酸在溶液中的荷電狀態(tài)與溶液的pH值有關(guān)。,15,正離子pHpI,兩性離子pH=pI,H+,OH,H+,OH,16,2.等電點(diǎn)：,將氨基酸水溶液的酸堿度加以適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)，使氨基酸的酸性電離程度與堿性電離程度相等。此時(shí)，氨基酸帶有的正電荷數(shù)目和負(fù)電荷數(shù)目相等，此溶液的pH值稱(chēng)為氨基酸的等電點(diǎn)，用pI表示。,氨基酸的帶電狀態(tài)和在電場(chǎng)中的狀況：,pH=pI,凈電荷為零,在電場(chǎng)中不移動(dòng),pHpI,帶負(fù)電荷,等電點(diǎn),17,要使氨基酸達(dá)到等電狀態(tài)：中性氨基酸：pIpH7加堿,18,（二）與HNO2的反應(yīng),除脯氨酸外，其它氨基酸都具有-NH2，可與HNO2反應(yīng)，定量放出氮?dú)猓∟2）。,HNO2,N2,利用此反應(yīng)可以測(cè)定蛋白質(zhì)分子中的自由氨基及其水解氨基酸分子中氨基的含量。,19,（三）脫羧反應(yīng),Ba(OH)2,CO2,脫羧反應(yīng)亦可在某些細(xì)菌的存在下，由于酶的作用發(fā)生，如：,精氨酸或鳥(niǎo)氨酸,腐胺,賴(lài)氨酸,尸胺,20,（四）與茚三酮的顯色反應(yīng),水合茚三酮,CO2,21,藍(lán)紫色化合物,根據(jù)CO2的量或藍(lán)紫色的深淺程度作為-氨基酸定量分析的依據(jù)。,22,（五）氨基酸代謝,23,氨基酸的降解,24,1、脫氨基作用,1）氧化脫氨基作用2）非氧化脫氨基作用3）轉(zhuǎn)氨作用4）聯(lián)合脫氨作用,25,1）氧化脫氨基作用,-氨基酸在酶的作用下氧化脫氫生成-酮酸，并放出游離NH3的過(guò)程。2RCHCOO-+O22RC-COO-+2NH4+NH3+O,26,RRR氨基酸氧化酶H2OCHNH2C=NHC=O+NH3FADFADH2COOHCOOHCOOH-氨基酸-亞氨酸-酮酸FAD起著電子和質(zhì)子的傳遞體作用。FAD+2H=FADH2O2過(guò)氧化氫酶FADH2H2O2H2O+O,27,氧化酶：a)L氨基酸氧化酶FMN（黃素單核苷酸）為輔基或FAD（黃素腺嘌呤二核苷酸）為輔基（最適pH=10，正常條件下活力低）b)D氨基酸氧化酶FAD為輔基（活力強(qiáng)、分布廣、但D氨基酸不多，作用不大）,28,L谷氨酸脫氫酶(不需氧脫氫酶)NAD+或NADP+為輔酶，催化可逆反應(yīng)NH3+OCH2COO-CCOO-+NAD+H2O+NADH+H+(CH2)2NADP+（CH2)2NADPH+H+COO-COO-,29,2）非氧化脫氨基作用,A、還原脫氨RCHNH2COOH+H2RCH2COOH+NH3B、水化脫氨RCHNH2COOH+H2ORCHOHCOOH+NH3,30,C、直接脫氨,31,3）轉(zhuǎn)氨作用,A、概念:氨基酸的NH2轉(zhuǎn)移到酮酸上，生成相應(yīng)的另一種酮酸和氨基酸，這種作用稱(chēng)轉(zhuǎn)氨作用。B、轉(zhuǎn)氨酶50種GOT:谷草轉(zhuǎn)氨酶；GPT：谷丙轉(zhuǎn)氨酶輔酶：磷酸吡哆醛（PLP）C、轉(zhuǎn)氨反應(yīng)是可逆反應(yīng)。,32,谷丙轉(zhuǎn)氨酶,PLP,33,谷草轉(zhuǎn)氨酶,PLP,34,轉(zhuǎn)氨作用是連接糖代謝和氨基酸代謝的橋梁，除Lys、Thr外其余氨基酸均可參與，特別注意下面三種氨基酸的轉(zhuǎn)化。丙酮酸丙氨酸（Ala）-酮戊二酸谷氨酸（Glu）草酰乙酸(OAA)天冬氨酸（Asp）（OAA：OxaloaceticAcid；Asp：AsparticAcid）,35,4）聯(lián)合脫氨作用,轉(zhuǎn)氨作用和L-谷氨酸脫氫酶的氧化脫氨作用聯(lián)合進(jìn)行，稱(chēng)作聯(lián)合脫氨作用。,36,37,嘌呤核苷酸循環(huán),38,2、脫羧基作用,1）直接脫羧脫羧酶RCHNH2COOHCO2+RCH2NH2磷酸吡哆醛,39,Glu-氨基丁酸（對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳導(dǎo)有抑制作用）Asp-丙氨酸（泛酸組分）Trp（脫氨、脫羧、氧化）吲哚乙酸（植物生長(zhǎng)素）His組胺（降血壓作用）Tyr酪胺（升血壓作用）Ser（脫羧）乙醇胺（甲基化）膽堿二者分別合成腦磷脂和卵磷脂，可作為生物膜的成分。,40,2）羥化脫羧,41,酪氨酸（Tyr）多巴多巴胺多巴聚合黑素，它是土豆、梨、蘋(píng)果切開(kāi)后切口變黑的原因，人體毛囊和表皮細(xì)胞也可形成黑素，使毛發(fā)和皮膚變黑。多巴與多巴胺還可合成生物堿（植物）及動(dòng)物中去甲腎上腺素和腎上腺素。,42,Lys尸胺Met亞精胺，精胺多胺Arg鯡精胺，腐胺植物適量吸收，刺激細(xì)胞分裂，生長(zhǎng)和防止衰老等作用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑,43,3、氨基酸分解產(chǎn)物的代謝,NH3酮酸CO2胺（RCH2NH2）,氨基酸分解產(chǎn)物:,44,1)NH3的代謝,合成新的氨基酸及其他含氮化合物酰胺的生成儲(chǔ)存氨的形成尿素的形成鳥(niǎo)氨酸循環(huán)生成銨鹽,45,酰胺的生成儲(chǔ)存氨的形成谷氨酰胺合成酶Glu+ATP+NH3Gln+ADP+Pi谷氨酸酶Gln+H2OGlu+NH3,46,天冬酰胺合成酶Asp+ATP+NH3Asn+ADP+Pi天冬氨酸酶Asn+H2OAsp+NH3,47,尿素的形成鳥(niǎo)氨酸循環(huán),48,a)鳥(niǎo)氨酸+NH3+CO2瓜氨酸b)瓜氨酸+NH3精氨酸精氨酸酶c)Arg尿素+鳥(niǎo)氨酸H2O+2NH3+CO2+3ATPNH2-CO-H2+AMP+PPi+2ADP+Pi,49,2)酮酸的代謝,A、再合成氨基酸B、氧化成CO2+H2O,50,51,C、轉(zhuǎn)變成糖和脂肪,生糖氨基酸：在體內(nèi)可以轉(zhuǎn)化成糖的氨基酸。生酮氨基酸：在體內(nèi)可以轉(zhuǎn)變成酮體的氨基酸。生糖兼生酮氨基酸：既可生糖，又可生酮的氨基酸。,52,第二節(jié)氨基酸的定量斑點(diǎn)分析,大多數(shù)氨基酸不含有特征發(fā)色基團(tuán)。因此，氨基酸的分析依賴(lài)于衍生化反應(yīng)。對(duì)衍生化試劑的要求是反應(yīng)快，并且產(chǎn)物與試劑本身的光譜性質(zhì)有明顯的差異。,53,常用的衍生化試劑有2，4-二硝基氟苯、熒光胺及鄰苯二甲醛等。根據(jù)產(chǎn)物性質(zhì)的不同，衍生化試劑可分為顯色劑及熒光衍生化試劑兩大類(lèi)。,54,一、斑點(diǎn)顯色分析法,茚三酮是氨基酸的斑點(diǎn)顯色分析中非常簡(jiǎn)單的衍生化試劑。它可以與一級(jí)和二級(jí)胺在酸性介質(zhì)中（pH34）加熱反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)生氨、二氧化碳和藍(lán)-紫色的絡(luò)合物。,55,一級(jí)和二級(jí)胺的檢測(cè)波長(zhǎng)分別為570和440nm。若二者同時(shí)存在，一般在500nm處測(cè)定，靈敏度有所降低。另一種常用的顯色反應(yīng)試劑是2，4-二硝基氟苯，它可以與樣品中氨基酸及一級(jí)和二級(jí)胺反應(yīng)，生成黃色絡(luò)合物，檢測(cè)波長(zhǎng)在420nm。該法測(cè)定的是氨基酸的總量。,56,二、斑點(diǎn)熒光分析法,熒光胺是用于氨基酸分析的高靈敏熒光衍生化試劑，可用于氨基酸的表面分析，如薄層色譜。鄰苯二甲醛（OPA）是用于氨基酸熒光分析的另一種常見(jiàn)的衍生化試劑。,57,第三節(jié)色譜方法,氨基酸種類(lèi)較多、結(jié)構(gòu)相近，采用色譜分離時(shí)，由于等電點(diǎn)、極性和分子大小不同，組分洗脫順序不同。,58,（一）離子交換色譜法,離子交換色譜的基本原理是基于帶電荷的陰陽(yáng)離子與帶相反電荷的離子交換基團(tuán)的相互作用。氨基酸、肽和蛋白質(zhì)在溶液中帶電荷，可與離子交換基團(tuán)產(chǎn)生靜電作用而保留。其固定相應(yīng)具有分離效能高、物化性質(zhì)穩(wěn)定、柱容量大、分辨率高、能快速保持生物分子活性和構(gòu)象完好。,59,離子交換色譜的填料及含鹽的緩沖流動(dòng)相系統(tǒng)類(lèi)似于蛋白質(zhì)穩(wěn)定存在的生理?xiàng)l件，有利于生物分子活性的保持；因此它在解決生物學(xué)中許多難于分離且十分重要的課題上所起的重大作用（如氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸組成的分離）,受到了人們的普遍關(guān)注。,60,陽(yáng)離子交換樹(shù)脂：強(qiáng)酸型磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物。陰離子交換樹(shù)脂：只有在特殊情況下用于強(qiáng)酸性氨基酸的分析。,61,1、直接檢測(cè)法,離子交換色譜法用于氨基酸分析時(shí)可在200nm處對(duì)各種氨基酸進(jìn)行直接檢測(cè)，檢出限在110pmol之間。,62,（1）選擇性差：生物樣品中多種內(nèi)源性成分在200nm處均有吸收；（2）背景高：HPIC常用的各種溶劑在200nm處也有吸收。,直接檢測(cè)的缺點(diǎn),63,離子交換色譜-積分脈沖安培法(HPIC-IPAD),該方法是基于陰離子交換分離，積分脈沖安培法檢測(cè)無(wú)需將待測(cè)氨基酸轉(zhuǎn)變成可被檢測(cè)的化合物的衍生反應(yīng)。該方法的靈敏度高，大多數(shù)氨基酸的最小檢測(cè)限均小于1pmol，線(xiàn)性范圍可以達(dá)到3個(gè)數(shù)量級(jí)以上。,64,2、柱后衍生化法,衍生化是將氨基酸衍生為有利于測(cè)定或分離的化合物。大多數(shù)氨基酸不含有芳香環(huán)等生色團(tuán)，無(wú)法直接用紫外法檢測(cè)，需要先將氨基酸衍生為具有較強(qiáng)紫外或熒光吸收的衍生物。,65,為了提高靈敏度及選擇性，一般采用柱后衍生化，再用紫外或熒光法對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。常用衍生化試劑：茚三酮、鄰苯二甲醛、熒光胺。,66,離子色譜法采用柱后衍生化法的優(yōu)點(diǎn),1、幾乎不需要樣品處理步驟，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物可以直接進(jìn)樣分析；2、反應(yīng)產(chǎn)物與副產(chǎn)物的混合物無(wú)需分離；3、離子色譜柱的穩(wěn)定性高，因而樣品間的重現(xiàn)性好；,67,4、反應(yīng)無(wú)需完成，產(chǎn)物也可以是多種。只要混合時(shí)間及反應(yīng)產(chǎn)物的比例是一定的，則分析的重現(xiàn)性就不會(huì)受到影響。5、對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物的穩(wěn)定性要求低，因?yàn)榉磻?yīng)及檢測(cè)幾乎是同時(shí)進(jìn)行的。,68,（二）反相色譜分析法,反相色譜法是以表面非極性載體為固定相，而以比固定相極性強(qiáng)的溶劑為流動(dòng)相的一種液相色譜分離模式。反相色譜固定相大多是硅膠表面鍵合疏水基團(tuán)，基于樣品中的不同組分和疏水基團(tuán)之間疏水作用的不同而分離。,69,在生物大分子分離中，多采用離子強(qiáng)度較低的酸性水溶液，添加一定量乙腈、異丙醇或甲醇等與水互溶的有機(jī)溶劑作流動(dòng)相。反相色譜分析法的效率比離子色譜法高；用于氨基酸分析一般采用柱前衍生化。衍生化不僅可以提高氨基酸被檢測(cè)的信號(hào)強(qiáng)度，而且可以提高氨基酸的疏水性，從而可以用反相色譜法進(jìn)行分離。,70,（三）柱前衍生氣相色譜法,氣相色譜法分析氨基酸具有分離時(shí)間短、柱效高、容易和質(zhì)譜聯(lián)用等優(yōu)點(diǎn)。氨基酸含有羧基、羥基、氨基和硫基等極性基團(tuán)，需要先對(duì)其衍生化。,71,兩步法是先將羧基用短碳鏈脂肪醇酯化，然后再用各種酸酐將N-（O、S）基團(tuán)乙?；?。一步法是用烴基氯甲酰酯在水、醇類(lèi)和吡啶介質(zhì)中將氨基酸一步衍生化生成烴基碳氧酰烴基酯。,衍生化方法有兩種,72,優(yōu)點(diǎn)是可同時(shí)將極性基團(tuán)衍生化，反應(yīng)可以在水溶液中進(jìn)行，反應(yīng)速度快，僅需幾秒，衍生試劑便宜；缺點(diǎn)是不能與胍基、吲哚基、咪唑基和羰基完全反應(yīng)。,一步法的優(yōu)缺點(diǎn),73,毛細(xì)管電泳具有微量、靈敏和柱效高的特點(diǎn)，適合于氨基酸手性分離和復(fù)雜樣品中的氨基酸分析。用于氨基酸分析的毛細(xì)管電泳主要采用兩種分離模式：毛細(xì)管區(qū)帶電泳和膠束電動(dòng)毛細(xì)管電泳。檢測(cè)方式主要有紫外法和熒光法。,（四）衍生化毛細(xì)管電泳法,74,衍生化毛細(xì)管電泳法可以進(jìn)行柱前、柱內(nèi)和柱后衍生化。柱內(nèi)衍生化要求反應(yīng)速度快，一般采用串聯(lián)或“夾心餅”兩種形式，具有試劑和樣品用量少的優(yōu)點(diǎn)。柱后衍生化可以避免柱前或柱內(nèi)衍生化時(shí)其他化合物對(duì)衍生反應(yīng)的干擾，缺點(diǎn)是柱后反應(yīng)裝置體積大，會(huì)引起色譜峰變寬而降低分離效果。,75,第四節(jié)基于氨基酸選擇性反應(yīng)的分析方法,1、顯色分析法有幾種顯色試劑只有當(dāng)干擾物預(yù)先除去后才有定量分析的價(jià)值。在有些情況下可以通過(guò)改變?cè)噭┑慕M成或反應(yīng)條件以便進(jìn)行某一種氨基酸的選擇性測(cè)定。,76,2、熒光法,色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等在紫外光照射下會(huì)產(chǎn)生熒光，其它氨基酸與某些有機(jī)試劑反應(yīng)之后其產(chǎn)物才會(huì)產(chǎn)生熒光。相對(duì)于顯色法，熒光分析法的選擇性和靈敏度要好。,77,3、微生物方法,微生物方法適合于各種生物樣品，可用于大量樣品的批量分析，而且分析耗費(fèi)低。微生物方法用于氨基酸分析的原理是：有些微生物的生長(zhǎng)和復(fù)制需要特定氨基酸的存在。因此，在有限量的