氨基酸分析PPT課件.ppt

1,氨基酸分析,2,氨基酸分析在蛋白質(zhì)化學(xué)和生物技術(shù)研究、臨床診斷和細(xì)胞生理學(xué)研究、營養(yǎng)學(xué)與衛(wèi)生保健、培育農(nóng)作物優(yōu)良品種、食品、制藥等領(lǐng)域具有非常重要的意義。,3,第一節(jié)氨基酸的基本結(jié)構(gòu)及性質(zhì),一、定義氨基酸是分子中含有氨基和羧基的一類化合物。組成蛋白質(zhì)的氨基酸只有二十種。,4,二十種氨基酸中有八種為人體必需氨基酸。人體必需的氨基酸：人體內(nèi)不能合成，只有靠食物供給的氨基酸。各種蛋白質(zhì)含氨基酸的種類和數(shù)量都各不相同。,5,二、氨基酸的分類和命名,（一）分類1、根據(jù)氨基酸的酸堿性,6,酸性氨基酸,二個羧基一個氨基,天冬氨酸谷氨酸,堿性氨基酸,一個羧基二個或二個以上氨基,賴氨酸精氨酸組氨酸,中性氨基酸,一個羧基一個氨基,實(shí)際水溶液呈弱酸性：電離能力COOHNH2,7,2、化學(xué)特性,疏水性：AlaValLeuIlePheProMet帶電：ArgLysAspGlu(His)極性：SerThrCysAsnGlnHisTyrTrp特殊：Gly(Pro),8,帶電氨基酸,9,極性氨基酸,10,(二）命名,系統(tǒng)命名法：氨基作為取代基，羧酸為母體稱為氨基某酸；習(xí)慣上：氨基的位置用、等表示2.俗名：多按其來源或某些性質(zhì)而命名如氨基乙酸因其具有甜味而被稱命名為甘氨酸,11,（三）氨基酸的立體化學(xué),由蛋白質(zhì)水解的氨基酸都為-氨基酸，除甘氨酸外，所有-C都為手性碳原子。天然的氨基酸均為L-氨基酸,12,在糖化學(xué)中，D、L構(gòu)型的參照物為甘油醛：,L-甘油醛,D-甘油醛,L-氨基酸,D-氨基酸,13,三、氨基酸的化學(xué)性質(zhì),（一）氨基酸的兩性電離和等電點(diǎn)1.兩性電離：氨基酸分子中含有-NH2和-COOH；為簡化起見可表示為：,14,它們發(fā)生分子內(nèi)酸堿反應(yīng)：,兩性離子,從平衡式可知，氨基酸在溶液中的荷電狀態(tài)與溶液的pH值有關(guān)。,15,正離子pHpI,兩性離子pH=pI,H+,OH,H+,OH,16,2.等電點(diǎn)：,將氨基酸水溶液的酸堿度加以適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)，使氨基酸的酸性電離程度與堿性電離程度相等。此時，氨基酸帶有的正電荷數(shù)目和負(fù)電荷數(shù)目相等，此溶液的pH值稱為氨基酸的等電點(diǎn)，用pI表示。,氨基酸的帶電狀態(tài)和在電場中的狀況：,pH=pI,凈電荷為零,在電場中不移動,pHpI,帶負(fù)電荷,等電點(diǎn),17,要使氨基酸達(dá)到等電狀態(tài)：中性氨基酸：pIpH7加堿,18,（二）與HNO2的反應(yīng),除脯氨酸外，其它氨基酸都具有-NH2，可與HNO2反應(yīng)，定量放出氮?dú)猓∟2）。,HNO2,N2,利用此反應(yīng)可以測定蛋白質(zhì)分子中的自由氨基及其水解氨基酸分子中氨基的含量。,19,（三）脫羧反應(yīng),Ba(OH)2,CO2,脫羧反應(yīng)亦可在某些細(xì)菌的存在下，由于酶的作用發(fā)生，如：,精氨酸或鳥氨酸,腐胺,賴氨酸,尸胺,20,（四）與茚三酮的顯色反應(yīng),水合茚三酮,CO2,21,藍(lán)紫色化合物,根據(jù)CO2的量或藍(lán)紫色的深淺程度作為-氨基酸定量分析的依據(jù)。,22,（五）氨基酸代謝,23,氨基酸的降解,24,1、脫氨基作用,1）氧化脫氨基作用2）非氧化脫氨基作用3）轉(zhuǎn)氨作用4）聯(lián)合脫氨作用,25,1）氧化脫氨基作用,-氨基酸在酶的作用下氧化脫氫生成-酮酸，并放出游離NH3的過程。2RCHCOO-+O22RC-COO-+2NH4+NH3+O,26,RRR氨基酸氧化酶H2OCHNH2C=NHC=O+NH3FADFADH2COOHCOOHCOOH-氨基酸-亞氨酸-酮酸FAD起著電子和質(zhì)子的傳遞體作用。FAD+2H=FADH2O2過氧化氫酶FADH2H2O2H2O+O,27,氧化酶：a)L氨基酸氧化酶FMN（黃素單核苷酸）為輔基或FAD（黃素腺嘌呤二核苷酸）為輔基（最適pH=10，正常條件下活力低）b)D氨基酸氧化酶FAD為輔基（活力強(qiáng)、分布廣、但D氨基酸不多，作用不大）,28,L谷氨酸脫氫酶(不需氧脫氫酶)NAD+或NADP+為輔酶，催化可逆反應(yīng)NH3+OCH2COO-CCOO-+NAD+H2O+NADH+H+(CH2)2NADP+（CH2)2NADPH+H+COO-COO-,29,2）非氧化脫氨基作用,A、還原脫氨RCHNH2COOH+H2RCH2COOH+NH3B、水化脫氨RCHNH2COOH+H2ORCHOHCOOH+NH3,30,C、直接脫氨,31,3）轉(zhuǎn)氨作用,A、概念:氨基酸的NH2轉(zhuǎn)移到酮酸上，生成相應(yīng)的另一種酮酸和氨基酸，這種作用稱轉(zhuǎn)氨作用。B、轉(zhuǎn)氨酶50種GOT:谷草轉(zhuǎn)氨酶；GPT：谷丙轉(zhuǎn)氨酶輔酶：磷酸吡哆醛（PLP）C、轉(zhuǎn)氨反應(yīng)是可逆反應(yīng)。,32,谷丙轉(zhuǎn)氨酶,PLP,33,谷草轉(zhuǎn)氨酶,PLP,34,轉(zhuǎn)氨作用是連接糖代謝和氨基酸代謝的橋梁，除Lys、Thr外其余氨基酸均可參與，特別注意下面三種氨基酸的轉(zhuǎn)化。丙酮酸丙氨酸（Ala）-酮戊二酸谷氨酸（Glu）草酰乙酸(OAA)天冬氨酸（Asp）（OAA：OxaloaceticAcid；Asp：AsparticAcid）,35,4）聯(lián)合脫氨作用,轉(zhuǎn)氨作用和L-谷氨酸脫氫酶的氧化脫氨作用聯(lián)合進(jìn)行，稱作聯(lián)合脫氨作用。,36,37,嘌呤核苷酸循環(huán),38,2、脫羧基作用,1）直接脫羧脫羧酶RCHNH2COOHCO2+RCH2NH2磷酸吡哆醛,39,Glu-氨基丁酸（對中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳導(dǎo)有抑制作用）Asp-丙氨酸（泛酸組分）Trp（脫氨、脫羧、氧化）吲哚乙酸（植物生長素）His組胺（降血壓作用）Tyr酪胺（升血壓作用）Ser（脫羧）乙醇胺（甲基化）膽堿二者分別合成腦磷脂和卵磷脂，可作為生物膜的成分。,40,2）羥化脫羧,41,酪氨酸（Tyr）多巴多巴胺多巴聚合黑素，它是土豆、梨、蘋果切開后切口變黑的原因，人體毛囊和表皮細(xì)胞也可形成黑素，使毛發(fā)和皮膚變黑。多巴與多巴胺還可合成生物堿（植物）及動物中去甲腎上腺素和腎上腺素。,42,Lys尸胺Met亞精胺，精胺多胺Arg鯡精胺，腐胺植物適量吸收，刺激細(xì)胞分裂，生長和防止衰老等作用植物生長調(diào)節(jié)劑,43,3、氨基酸分解產(chǎn)物的代謝,NH3酮酸CO2胺（RCH2NH2）,氨基酸分解產(chǎn)物:,44,1)NH3的代謝,合成新的氨基酸及其他含氮化合物酰胺的生成儲存氨的形成尿素的形成鳥氨酸循環(huán)生成銨鹽,45,酰胺的生成儲存氨的形成谷氨酰胺合成酶Glu+ATP+NH3Gln+ADP+Pi谷氨酸酶Gln+H2OGlu+NH3,46,天冬酰胺合成酶Asp+ATP+NH3Asn+ADP+Pi天冬氨酸酶Asn+H2OAsp+NH3,47,尿素的形成鳥氨酸循環(huán),48,a)鳥氨酸+NH3+CO2瓜氨酸b)瓜氨酸+NH3精氨酸精氨酸酶c)Arg尿素+鳥氨酸H2O+2NH3+CO2+3ATPNH2-CO-H2+AMP+PPi+2ADP+Pi,49,2)酮酸的代謝,A、再合成氨基酸B、氧化成CO2+H2O,50,51,C、轉(zhuǎn)變成糖和脂肪,生糖氨基酸：在體內(nèi)可以轉(zhuǎn)化成糖的氨基酸。生酮氨基酸：在體內(nèi)可以轉(zhuǎn)變成酮體的氨基酸。生糖兼生酮氨基酸：既可生糖，又可生酮的氨基酸。,52,第二節(jié)氨基酸的定量斑點(diǎn)分析,大多數(shù)氨基酸不含有特征發(fā)色基團(tuán)。因此，氨基酸的分析依賴于衍生化反應(yīng)。對衍生化試劑的要求是反應(yīng)快，并且產(chǎn)物與試劑本身的光譜性質(zhì)有明顯的差異。,53,常用的衍生化試劑有2，4-二硝基氟苯、熒光胺及鄰苯二甲醛等。根據(jù)產(chǎn)物性質(zhì)的不同，衍生化試劑可分為顯色劑及熒光衍生化試劑兩大類。,54,一、斑點(diǎn)顯色分析法,茚三酮是氨基酸的斑點(diǎn)顯色分析中非常簡單的衍生化試劑。它可以與一級和二級胺在酸性介質(zhì)中（pH34）加熱反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)生氨、二氧化碳和藍(lán)-紫色的絡(luò)合物。,55,一級和二級胺的檢測波長分別為570和440nm。若二者同時存在，一般在500nm處測定，靈敏度有所降低。另一種常用的顯色反應(yīng)試劑是2，4-二硝基氟苯，它可以與樣品中氨基酸及一級和二級胺反應(yīng)，生成黃色絡(luò)合物，檢測波長在420nm。該法測定的是氨基酸的總量。,56,二、斑點(diǎn)熒光分析法,熒光胺是用于氨基酸分析的高靈敏熒光衍生化試劑，可用于氨基酸的表面分析，如薄層色譜。鄰苯二甲醛（OPA）是用于氨基酸熒光分析的另一種常見的衍生化試劑。,57,第三節(jié)色譜方法,氨基酸種類較多、結(jié)構(gòu)相近，采用色譜分離時，由于等電點(diǎn)、極性和分子大小不同，組分洗脫順序不同。,58,（一）離子交換色譜法,離子交換色譜的基本原理是基于帶電荷的陰陽離子與帶相反電荷的離子交換基團(tuán)的相互作用。氨基酸、肽和蛋白質(zhì)在溶液中帶電荷，可與離子交換基團(tuán)產(chǎn)生靜電作用而保留。其固定相應(yīng)具有分離效能高、物化性質(zhì)穩(wěn)定、柱容量大、分辨率高、能快速保持生物分子活性和構(gòu)象完好。,59,離子交換色譜的填料及含鹽的緩沖流動相系統(tǒng)類似于蛋白質(zhì)穩(wěn)定存在的生理?xiàng)l件，有利于生物分子活性的保持；因此它在解決生物學(xué)中許多難于分離且十分重要的課題上所起的重大作用（如氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸組成的分離）,受到了人們的普遍關(guān)注。,60,陽離子交換樹脂：強(qiáng)酸型磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物。陰離子交換樹脂：只有在特殊情況下用于強(qiáng)酸性氨基酸的分析。,61,1、直接檢測法,離子交換色譜法用于氨基酸分析時可在200nm處對各種氨基酸進(jìn)行直接檢測，檢出限在110pmol之間。,62,（1）選擇性差：生物樣品中多種內(nèi)源性成分在200nm處均有吸收；（2）背景高：HPIC常用的各種溶劑在200nm處也有吸收。,直接檢測的缺點(diǎn),63,離子交換色譜-積分脈沖安培法(HPIC-IPAD),該方法是基于陰離子交換分離，積分脈沖安培法檢測無需將待測氨基酸轉(zhuǎn)變成可被檢測的化合物的衍生反應(yīng)。該方法的靈敏度高，大多數(shù)氨基酸的最小檢測限均小于1pmol，線性范圍可以達(dá)到3個數(shù)量級以上。,64,2、柱后衍生化法,衍生化是將氨基酸衍生為有利于測定或分離的化合物。大多數(shù)氨基酸不含有芳香環(huán)等生色團(tuán)，無法直接用紫外法檢測，需要先將氨基酸衍生為具有較強(qiáng)紫外或熒光吸收的衍生物。,65,為了提高靈敏度及選擇性，一般采用柱后衍生化，再用紫外或熒光法對產(chǎn)物進(jìn)行檢測。常用衍生化試劑：茚三酮、鄰苯二甲醛、熒光胺。,66,離子色譜法采用柱后衍生化法的優(yōu)點(diǎn),1、幾乎不需要樣品處理步驟，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物可以直接進(jìn)樣分析；2、反應(yīng)產(chǎn)物與副產(chǎn)物的混合物無需分離；3、離子色譜柱的穩(wěn)定性高，因而樣品間的重現(xiàn)性好；,67,4、反應(yīng)無需完成，產(chǎn)物也可以是多種。只要混合時間及反應(yīng)產(chǎn)物的比例是一定的，則分析的重現(xiàn)性就不會受到影響。5、對反應(yīng)產(chǎn)物的穩(wěn)定性要求低，因?yàn)榉磻?yīng)及檢測幾乎是同時進(jìn)行的。,68,（二）反相色譜分析法,反相色譜法是以表面非極性載體為固定相，而以比固定相極性強(qiáng)的溶劑為流動相的一種液相色譜分離模式。反相色譜固定相大多是硅膠表面鍵合疏水基團(tuán)，基于樣品中的不同組分和疏水基團(tuán)之間疏水作用的不同而分離。,69,在生物大分子分離中，多采用離子強(qiáng)度較低的酸性水溶液，添加一定量乙腈、異丙醇或甲醇等與水互溶的有機(jī)溶劑作流動相。反相色譜分析法的效率比離子色譜法高；用于氨基酸分析一般采用柱前衍生化。衍生化不僅可以提高氨基酸被檢測的信號強(qiáng)度，而且可以提高氨基酸的疏水性，從而可以用反相色譜法進(jìn)行分離。,70,（三）柱前衍生氣相色譜法,氣相色譜法分析氨基酸具有分離時間短、柱效高、容易和質(zhì)譜聯(lián)用等優(yōu)點(diǎn)。氨基酸含有羧基、羥基、氨基和硫基等極性基團(tuán)，需要先對其衍生化。,71,兩步法是先將羧基用短碳鏈脂肪醇酯化，然后再用各種酸酐將N-（O、S）基團(tuán)乙?；?。一步法是用烴基氯甲酰酯在水、醇類和吡啶介質(zhì)中將氨基酸一步衍生化生成烴基碳氧酰烴基酯。,衍生化方法有兩種,72,優(yōu)點(diǎn)是可同時將極性基團(tuán)衍生化，反應(yīng)可以在水溶液中進(jìn)行，反應(yīng)速度快，僅需幾秒，衍生試劑便宜；缺點(diǎn)是不能與胍基、吲哚基、咪唑基和羰基完全反應(yīng)。,一步法的優(yōu)缺點(diǎn),73,毛細(xì)管電泳具有微量、靈敏和柱效高的特點(diǎn)，適合于氨基酸手性分離和復(fù)雜樣品中的氨基酸分析。用于氨基酸分析的毛細(xì)管電泳主要采用兩種分離模式：毛細(xì)管區(qū)帶電泳和膠束電動毛細(xì)管電泳。檢測方式主要有紫外法和熒光法。,（四）衍生化毛細(xì)管電泳法,74,衍生化毛細(xì)管電泳法可以進(jìn)行柱前、柱內(nèi)和柱后衍生化。柱內(nèi)衍生化要求反應(yīng)速度快，一般采用串聯(lián)或“夾心餅”兩種形式，具有試劑和樣品用量少的優(yōu)點(diǎn)。柱后衍生化可以避免柱前或柱內(nèi)衍生化時其他化合物對衍生反應(yīng)的干擾，缺點(diǎn)是柱后反應(yīng)裝置體積大，會引起色譜峰變寬而降低分離效果。,75,第四節(jié)基于氨基酸選擇性反應(yīng)的分析方法,1、顯色分析法有幾種顯色試劑只有當(dāng)干擾物預(yù)先除去后才有定量分析的價值。在有些情況下可以通過改變試劑的組成或反應(yīng)條件以便進(jìn)行某一種氨基酸的選擇性測定。,76,2、熒光法,色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等在紫外光照射下會產(chǎn)生熒光，其它氨基酸與某些有機(jī)試劑反應(yīng)之后其產(chǎn)物才會產(chǎn)生熒光。相對于顯色法，熒光分析法的選擇性和靈敏度要好。,77,3、微生物方法,微生物方法適合于各種生物樣品，可用于大量樣品的批量分析，而且分析耗費(fèi)低。微生物方法用于氨基酸分析的原理是：有些微生物的生長和復(fù)制需要特定氨基酸的存在。因此，在有限量的