熒光顯微鏡.ppt

熒光顯微鏡 馬明053004 熒光顯微鏡的發(fā)明 1941年coons 昆氏 將抗體加上螢光染劑用以偵測細(xì)胞抗原 這是熒光顯微鏡的最早雛形 熒光顯微鏡的成像原理 熒光顯微鏡是一種較為常用的的光學(xué)顯微鏡 其基本原理是利用一定波長的激發(fā)光對(duì)樣品進(jìn)行激發(fā) 使之產(chǎn)生一定波長的熒光 從而用于對(duì)樣品結(jié)構(gòu)或其組分進(jìn)行定性 定位 定量觀察檢測 什么是熒光 物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài) 再回到低能狀態(tài)時(shí)釋放出的光 即 物質(zhì)吸收短波光 發(fā)射出的長波光 熒光的作用 熒光光源不是作為照明的 而是作為熒光色素產(chǎn)生熒光的激發(fā)光 熒光的性質(zhì) 保持固有的熒光特性熒光波長 激發(fā)波長熒光強(qiáng)度極小于激發(fā)光的強(qiáng)度有不同程度的衰減熒光強(qiáng)度取決于激發(fā)光強(qiáng)度 被檢物濃度 熒光效率 熒光染色分類 自發(fā)熒光二次熒光抗體熒光技術(shù) 自發(fā)熒光 不加染色 有些物質(zhì)不加染色 也能發(fā)出熒光 自發(fā)熒光或原發(fā)熒光 但在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域中 只有很少物質(zhì)具有自發(fā)熒光 二次熒光 用化學(xué)染色 非熒光性的物質(zhì) 蛋白質(zhì) 炭水化合物 用熒光色素染色 由熒光色素產(chǎn)生熒光 二次熒光 以便進(jìn)行觀察 對(duì)特定物體選擇合適的熒光色素 該物體就能和周圍的組織或細(xì)胞區(qū)別出來而可以觀察到 熒光的種類 自發(fā)熒光二次熒光 自發(fā)熒光 物質(zhì)受光激發(fā)產(chǎn)生的固有熒光二次熒光 物質(zhì)借熒光色素受光激發(fā)產(chǎn)生的熒光 染色 不染色 激發(fā)光 發(fā)射光 抗體熒光技術(shù) 用免疫染色 利用特定的抗原必然和特定的抗體相結(jié)合這一個(gè)事實(shí) 有意識(shí)地使帶熒光標(biāo)記的抗體和標(biāo)本中的抗原進(jìn)行抗原 抗體反應(yīng) 這樣兩者的結(jié)合體就能通過抗體的熒光觀察到 熒光顯微鏡的種類透射式落射式 熒光顯微鏡的分類及構(gòu)造 一 透射熒光顯微鏡 光源 高壓汞燈或鹵素?zé)?聚光鏡 使用暗場聚光鏡 使激發(fā)光和熒光分離出來 物鏡 可用任何種類的物鏡 標(biāo)本 因?yàn)槭峭干溆^察 薄的標(biāo)本比較適合 透射熒光顯微鏡 汞燈光源激發(fā)濾色鏡暗場聚光鏡吸收濾色鏡 透射熒光顯微鏡原理 目鏡 吸收濾色鏡 物鏡 暗場聚光鏡 激發(fā)濾色鏡 汞燈 透射熒光顯微鏡的構(gòu)造 吸收濾色鏡 暗場聚光鏡 激發(fā)濾色鏡 汞燈箱 優(yōu)點(diǎn) 由于用了暗場聚光鏡 激發(fā)光不能進(jìn)入物鏡 因此容易形成暗的背景 得到良好的反差 由于上述同樣的原因 任何物鏡都可用于觀察 用低倍物鏡時(shí) 比反射熒光顯微鏡更亮 缺點(diǎn) 必須正確調(diào)整聚光鏡中心和高度 否則不能獲得明亮的熒光像 由于暗視場聚光鏡焦距限制 不能使用厚的載玻片 視場照明區(qū)不能過大 否則容易使熒光標(biāo)本熒光色衰褪 厚的或不透明的標(biāo)本不適用 不過現(xiàn)在透射式顯微鏡幾乎已經(jīng)被淘汰 被更先進(jìn)的反射式 落射式 熒光顯微鏡所代替 熒光顯微鏡 二 反射熒光顯微鏡 光源 高壓汞燈或鹵素?zé)?聚光鏡 因?yàn)槲镧R作為聚光鏡 所以不需要聚光鏡 物鏡 所用的物鏡必須能透過足夠的紫外光 而且本身不產(chǎn)生熒光 對(duì)數(shù)值孔徑?jīng)]有限制 標(biāo)本 厚的標(biāo)本或不透明的標(biāo)本都能觀察 汞燈光源激發(fā)濾色鏡分色鏡吸收濾色鏡 熒光顯微鏡下的絲狀細(xì)菌 反射熒光顯微鏡原理 汞燈 激發(fā)濾色鏡 分色鏡 吸收濾色鏡 物鏡 標(biāo)本 反射熒光顯微鏡的構(gòu)造 吸收濾色鏡激發(fā)濾色鏡 分色鏡 汞燈 紫外線保護(hù)罩 孔徑光欄 fs 視場光欄 as 優(yōu)點(diǎn) 由于物鏡兼作聚光鏡 不需要很多調(diào)節(jié) 物鏡數(shù)值孔徑不受限制 在高放大被率時(shí) 也可以獲得高分辨率的像 厚的或不透明的標(biāo)本也能觀察 厚的蓋玻片也能使用 其它觀察法也能與反射熒光結(jié)合使用 特別和相差法和透射微分干涉差法相結(jié)合 可以避免不必要的熒光色衰褪現(xiàn)象 缺點(diǎn) 在用低倍率物鏡時(shí) 像比較暗 因此必須用大數(shù)值孔徑的物鏡 濾光鏡系統(tǒng)必須有效地分離開激發(fā)光和熒光 熒光顯微鏡照片 微管呈綠色 微絲紅色 核藍(lán)色 激光共聚焦掃描顯微鏡 lsc顯微鏡 lscm的發(fā)展歷史 1955年 marvinminsky利用共焦原理搭建了一臺(tái)共焦顯微鏡 用來在體觀察大腦的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò) 1957年 marvinminsky申請(qǐng)了共聚焦顯微鏡的專利 1970年 第一臺(tái)單光束共聚焦激光掃描顯微鏡問世 1985年 多個(gè)實(shí)驗(yàn)室的多篇報(bào)道顯示共聚焦顯微鏡可以消除焦點(diǎn)模糊 得到清晰的圖像 1987年 bio rad公司推出了第一臺(tái)商業(yè)化的共聚焦顯微鏡 傳統(tǒng)顯微鏡的缺憾 在傳統(tǒng)的熒光顯微鏡中 來自汞燈或者氙燈的激發(fā)光照射視野中的全部樣品 觀察者可以用眼睛直接觀察 也可以用ccd 電荷耦合器件 ccd是一種半導(dǎo)體裝置 能夠把光學(xué)影像轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào) 等設(shè)備直接拍攝熒光圖像 傳統(tǒng)顯微鏡得到的圖片容易受到軸向干擾和側(cè)向干擾的影響而顯得有些模糊 焦點(diǎn)模糊 對(duì)于有一定厚度的樣品 大于2微米 一方面 由于在物鏡聚焦平面上下的平面上也有熒光被激發(fā) 焦平面上的熒光圖像將有一定的模糊 這被稱為軸 z 干擾 另一方面 感興趣區(qū)域的樣品也會(huì)受到同一焦平面上鄰近區(qū)域所激發(fā)的熒光的干擾 使得圖像的對(duì)比度降低 這被稱為側(cè)向 xy 干擾 共聚焦顯微鏡優(yōu)勢 共聚焦顯微鏡很好的解決了傳統(tǒng)熒光顯微鏡中焦面模糊的問題 解決了圖像的軸向和側(cè)向的干擾 共聚焦顯微鏡同時(shí)還提供了光切能力 能對(duì)厚樣品 例如花粉顆粒 果蠅大腦等 進(jìn)行三維層切成像 共聚焦顯微鏡原理簡介 共聚焦與傳統(tǒng)顯微鏡的原理差別 照明方式不同 傳統(tǒng)顯微鏡是一次性照明整個(gè)視野中的樣品 因此可以用眼睛直接觀察或者用ccd獲取圖像 沒有時(shí)間延遲 而共聚焦顯微鏡是逐點(diǎn)成像 無法用眼睛成像 也無法用ccd獲取圖像 只能用探測器收集每個(gè)象素點(diǎn)的信號(hào) 再通過軟件重構(gòu)圖象 有一定的時(shí)間延遲 lscm采用點(diǎn)光源照射標(biāo)本 在焦平面上形成一個(gè)輪廓分明的小的光點(diǎn) 該點(diǎn)被照射后發(fā)出的熒光被物鏡收集 并沿原照射光路回送到由雙向色鏡構(gòu)成的分光器 分光器將熒光直接送到探測器 光源和探測器前方都各有一個(gè)針孔 分別稱為照明針孔和探測針孔 兩者的幾何尺寸一致 約100 200nm 相對(duì)于焦平面上的光點(diǎn) 兩者是共軛的 即光點(diǎn)通過一系列的透鏡 最終可同時(shí)聚焦于照明針孔和探測針孔 這樣 來自焦平面的光 可以會(huì)聚在探測孔范圍之內(nèi) 而來自焦平面上方或下方的散射光都被擋在探測孔之外而不能成像 以激光逐點(diǎn)掃描樣品 探測針孔后的光電倍增管也逐點(diǎn)獲得對(duì)應(yīng)光點(diǎn)的共聚焦圖像 轉(zhuǎn)為數(shù)字信號(hào)傳輸至計(jì)算機(jī) 最終在屏幕上聚合成清晰的整個(gè)焦平面的共聚焦圖像 lcsm照片 藍(lán)色為細(xì)胞核 綠色為微管 lscm的構(gòu)造 倒置熒光顯微鏡激光器掃描頭系統(tǒng)控制塔電腦及顯示器 激光器405nm激光器ar離子激光器 458nm 488nm 514nm he ne綠激光 543nm he ne紅激光 633nm 掃描頭2個(gè)熒光探測器一個(gè)meta探測器一個(gè)透射探測器 系統(tǒng)控制塔掃描頭控制激光控制數(shù)據(jù)通信 lscm的基本特點(diǎn) 觀察方式 以熒光為主光源 激光 紫外 可見光 近紅外 照明方式 點(diǎn)照明 逐點(diǎn)掃描成像方式 共聚焦