（臨床獸醫(yī)學(xué)專業(yè)論文）mpf對(duì)精母細(xì)胞減數(shù)分裂調(diào)控作用的研究.pdf

西南大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要 m p f 對(duì)精母細(xì)胞減數(shù)分裂調(diào)控作用的研究 臨床獸醫(yī)專業(yè)碩士研究生白汝嵐 指導(dǎo)教師張家驊教授 中文摘要 p f 即成熟促進(jìn)因子( m a h m t i p 啪t 蚍缸參與了卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂，但對(duì)于其在 精子發(fā)生過程所起的作用及機(jī)制目前還不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在研究m p f 在精母細(xì)胞減數(shù)分裂中的作 用，為精子體外發(fā)生( i i i v i 帥甲燃鯽鼯i s ，s ) ，優(yōu)化體外培養(yǎng)條件提供依據(jù) 為了闡明m p f 在小鼠精于發(fā)生不同階段的表達(dá)規(guī)律，本實(shí)驗(yàn)采用不同發(fā)育時(shí)段小鼠睪丸，經(jīng)消 化離心得到細(xì)胞懸液，通過流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞倍性，同時(shí)利用免疫組化結(jié)合m p f 活性檢測(cè)，分析 了桔子生成的時(shí)相特征以及m f 活性與精子生成之間的相互關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)8 日齡、1 4 日齡小鼠 睪丸沒有單倍體出現(xiàn)，從1 8 日齡開始小鼠生精細(xì)胞單倍體開始出現(xiàn)，但比例很低，而四倍體增加達(dá) 峰值。免疫組化和f 活性檢測(cè)表明1 8 日齡小鼠睪丸f 兩亞基表達(dá)量高，而且m p f 活性也 處于較高水平以上結(jié)果表明：1 8 日齡小鼠睪丸生精細(xì)胞大多處于即將進(jìn)入減數(shù)分裂的初級(jí)精母細(xì) 胞階段，m p f 活性最強(qiáng)，生精細(xì)胞發(fā)育時(shí)程與m p f 表達(dá)及活性情況一致。 為了進(jìn)一步研究m p f 在精于生成中的作用，我們以1 8 d 小鼠睪丸為實(shí)驗(yàn)材料，采用生精細(xì)胞與 支持細(xì)胞共培養(yǎng)體系，通過檢測(cè)細(xì)胞活性和m p f 活性，發(fā)現(xiàn)b li ( 丁酸內(nèi)醋，b u t y m i t ci ) 抑 制m p f 活性的最佳濃度為o 6 8 “m o i ，l b 卜i 使混合培養(yǎng)體系中四倍體和單倍體比例下降，= 倍體 比例則有所提高，這表明m p f 對(duì)精母細(xì)胞第二次減數(shù)分裂有重要作用。 關(guān)鍵詞：m p f 精子發(fā)生減數(shù)分裂b l i 西南大學(xué)碩士學(xué)位論文a b s 婦c t r e s e a r c ho nt h er o l eo fm p f d u r i n gm e i o s i s i n m a l eg e r mc e l l s c l i l l i c a l 、，c t 甜n a up o s t 鏟a d u a t eb a ir u l a i l a d v i s e r z h a n g j i a j l u ap r o f c s s o r a b s t r a c t m p f ( 眥t i l i a 虹p r o m o t i i l gf a c t o r ) ，p a n i c i p a i ei nt i i em c i o s i so f0 0 _ c y t e s ，b u tt l l em l ea n dt h cc 0 咖i m e c h 衄i s mw c 豫n o td i s 如c t e d w ei n t d e dt or 部e a r c ht 1 1 er o l eo fm p f d u r i i i gi m i i si l l m l eg e n n c e l l sl l l o u g l lo 呱e 坤c r j 腓咄w l 正c hw o u l dp r o “d ca 他f e 啪t o s ( i n “咖印啪m t o g e m s i s ) 鋤d o p t i 】n i z et l l ec 講刪o no f c l l l t i i 咒i nv i 帥 ho r d e rt om 衄【l i n g t c 血ec x p 塢鯖i o n 心g i i l a r n yi nd i f r e 塒l tm l a 端o fs p 盯m 咖踟i sj i im i ，w b a q u 硼c e ns m p c n s i o n 衄t c s t e si nd j s t i n c td c v e l 叩m e n tp h a sb yd i g e g 曲g 柚dc 鋤硒如g i n g n 帥 鯽腳y 髓dc c up l o i d yb yf 1 0 wc ”o n 嵋t e i na d d i t i o na 皿l y 孺dt h c 陀l a n o 璐m p 腳i l gt h cp h a f b t u mo f g 帆e p o i e s i s ，n v i t yo fm 】p fa n dg o n 印o i e s i sb yi m m u n o h i s 妣h e i i l i c a lm e l l l o dc 鰍岫d i n gw 妯t l l c 山：t c c o no f h v i 啦t h e 鹋s i l l ts h o w e dt 1 1 a ti nr i l i c ea tt i ea 鏟o f 8d a y s d1 4d a y st i i c r ew n 0h 印l o i 4 w l l i c ha p ：砌丘o m1 8 d 。b u tv e r yf e w w h e nt e 唧i o i di n c 他鵲e dt op e a i c i i l g ，i i la d d i 6 t i i ee 砩嘴s s i o n o f t h e t w os 血礎(chǔ)a n dm c b v i t yo f m p fw e f ea t t i i eh 訕l e v e l o nm cw h o l e m “a t t i i e8 9 eo f l 8 幽y s ，m 儺to f 叩懾m 砷明胃f l i cc e l l sw e r ep r i m a ys p c 刪t o c y t e s t 1 1 e 踮石v i t yo f m p f w 越碡1 l i g i i t 瞄ta l l d t l l c 蛐no f d w c l 叩l m n tp l 粥c so f s p e 咖a t o g e n i c l l sc o i i d c dw i t t it l l ee x p 嗌s i 伽a n d d v i t y 坤s u l t o f m p f f o r a 托hi l l er o l eo fm p fi i is p e 忸t o g c n 髓i s ，w ed i s c o v e 陽dt 1 1 eb e s tb li ( b u t y m i 孔t o e i ) c 蚰c e n t r a t i o nt oi i l l l i b i t 越6 “t yo fm p fi so 6 8 p m o l ，l ，w 油m es u b j e c to f1 8 出y sm i c e ，媯協(xié)b i i i s h 崦 o o c u l n l r es y s 咖a n da m l y z i n gt h e 神b v i t i e so f c e l l s 卸dm p f a tm a tc 徹c e n 訂習(xí)血o n ，b lic 卸s c dt l l em l e d c c 佗器訪go ft e 扛謝o i d 鋤dh a p l o i d ，o nm ec o n 仃a r yt h er a t eo fd i p i o i di n c r e 鷂c d ，w h i c hi n d i c a t e d 咿fi s e s 陽n a it om e c o n dm c i o s i so f s p c r m a 協(xié)c y t e 1 “yw o r d s ：m p fs p e r m a t o g e n s i sm e i o s i sb l i n 獨(dú)創(chuàng)性聲明 本人提交的學(xué)位論文是在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果論文中引用他人已經(jīng) 發(fā)表或出版過的研究成果，文中己加了特別標(biāo)注對(duì)本研究及學(xué)位論文撰寫曾做出貢獻(xiàn)的老師、 朋友、同仁在文中作了明確說明并表示衷心感謝 學(xué)位論文作者：j 討奴磬 簽字日期：叉k 年多月1 日 學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書 本學(xué)位論文作者完全了解西南大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，有權(quán)保留并向國家有關(guān)部 門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)西南大學(xué)研究生院( 籌) 可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索可以采用影印、縮印或掃描等復(fù) 制手段保存、匯編學(xué)位論文 ( 保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書， 本論文：口不保密，口保密期限至年月止) 學(xué)位論文作者簽名：t 沿氙 簽字日期：0 越年月1 日 導(dǎo)師鮐辦坼 簽字日期：倆年；月，日 西南大學(xué)碩士學(xué)位論文 第一章文獻(xiàn)綜述 第一章文獻(xiàn)紼述 動(dòng)物精子發(fā)生( 印m 【t o 鯽$ i s ) 是生命周期中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)也是一個(gè)既有有絲分裂又有減 數(shù)分裂的高度復(fù)雜而有序的特殊細(xì)胞分化過程。輔子發(fā)生過程中減數(shù)分裂調(diào)節(jié)的分子機(jī)制已成為生 物學(xué)領(lǐng)域中一個(gè)重要的研究課題。從分子水平上研究初級(jí)精母細(xì)胞減數(shù)分裂能力的獲得及減數(shù)分裂 調(diào)節(jié)機(jī)制不僅可以豐富發(fā)育生物學(xué)、生殖生理和遺傳學(xué)的理論基礎(chǔ)而且對(duì)于實(shí)現(xiàn)精子體外發(fā)生( 加 v 曲v 叩即n a i o g c s i s s ) 、優(yōu)化體外培養(yǎng)條件具有潛在的指導(dǎo)意義。m p f 作為細(xì)胞增殖重要的調(diào) 控因子，是探求初級(jí)精母細(xì)胞減數(shù)分裂調(diào)節(jié)機(jī)制釣重要環(huán)節(jié)，因此本文將闡述精于發(fā)生及m p f 的研 究現(xiàn)狀，分析各研究取得的進(jìn)步及存在的不足，希望對(duì)相關(guān)領(lǐng)域研究提供一些參考。 l 精子發(fā)生的研究 1 1 精子體外培養(yǎng)的進(jìn)展 1 9 2 0 年首次報(bào)道用血漿培養(yǎng)睪丸組織研究體外精子發(fā)生以來隨著對(duì)睪丸組織結(jié)構(gòu)、各種細(xì)胞 的功能和精子體內(nèi)發(fā)生過程的逐步認(rèn)識(shí)以及體外培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，睪丸未成熟生精細(xì)胞的體外培養(yǎng) 方法和技術(shù)也有了很大改進(jìn) 1 1 1 早期研究成果 2 0 世紀(jì)2 0 年代至6 0 年代末取得了四方面成就：所設(shè)計(jì)的組織培養(yǎng)系能使生殖細(xì)胞進(jìn)入減 數(shù)分裂前期：初級(jí)精母細(xì)胞能從細(xì)線前期向粗線期分化。在器官培養(yǎng)方面甩原始未分化的生殖 腺體外培養(yǎng)能產(chǎn)生性分化。 在含5 c 0 2 ( v ，) 的空氣、p h 值7 2 0 2 、溫度3 2 3 5 培養(yǎng)條件下， 改變培養(yǎng)基營養(yǎng)成分應(yīng)用丙酮酸作為培養(yǎng)基能量底物，加入胎牛血清、氨基酸及維生素等類物質(zhì)， 雄性生殖細(xì)胞體外培養(yǎng)結(jié)果較好【啦渤。用h 3 ( 氚) 胸腺嘧啶脫氧核苷m 3 皿r ) 作為放射性標(biāo)記物， 跟蹤生殖細(xì)胞的分化過程為檢測(cè)生殖細(xì)胞的體外分化階段提供客觀依據(jù)。這些早期研究成果為后 來的研究者提供了可靠的方法即使在現(xiàn)階段仍具有重要意義 1 1 27 0 年代以后共培養(yǎng)( 。u l t u 舊的發(fā)展 2 0 世紀(jì)7 0 年代以后創(chuàng)立了模擬體內(nèi)微環(huán)境的體外培養(yǎng)方法，即雄性生殖細(xì)胞和支持細(xì)胞的體 外共培養(yǎng)。共培養(yǎng)按其對(duì)支持細(xì)胞的營養(yǎng)供給方法分為非滲透性和滲透性支持物共培養(yǎng)兩種；按其 共培養(yǎng)的細(xì)胞種類分為同種支持細(xì)胞和異種非洲綠猴腎上皮細(xì)胞( v e 細(xì)胞) 共培養(yǎng)兩種。另外，對(duì) 生殖細(xì)胞分化的檢測(cè)方法也有很大改進(jìn)。非滲透性支持物培養(yǎng)是將支持細(xì)胞置于非滲透性支持物上， 西南大學(xué)碩士學(xué)位論文 第一章文獻(xiàn)綜述 如塑料、玻璃培養(yǎng)皿等，培養(yǎng)成細(xì)胞單層后，再將生殖細(xì)胞直接種植在這一單層上共同培養(yǎng)。1 9 8 1 年，聒盯m n b a u m 等”】用此托培養(yǎng)方法研究支持細(xì)胞和生殖細(xì)胞間的相互作用，觀察到細(xì)線前期初 級(jí)精母細(xì)胞分化至粗線后期初級(jí)精母細(xì)胞。m a g l l c r 鎬b a 出s t o l l j 等1 5 l 用成年大鼠睪丸粗線期初級(jí)精 母細(xì)胞與2 0 d 齡大鼠的支持細(xì)胞共培養(yǎng)7 d ，約有l(wèi) o 的粗線期初級(jí)精母細(xì)胞能發(fā)育成精子細(xì)胞。滲 透性支持物培養(yǎng)也稱雙室培養(yǎng)在普通培養(yǎng)皿內(nèi)放置一個(gè)套皿套皿底部裝有微孔濾膜或生物材料 構(gòu)成的滲透性薄膜使培養(yǎng)皿分隔為上下兩小室，培養(yǎng)液置于下室，當(dāng)上室培養(yǎng)的支持細(xì)胞形成細(xì) 胞單層后，再將生殖細(xì)胞置于支持細(xì)胞單層上共培養(yǎng)。1 9 9 2 年，1 h s 等【6 1 改進(jìn)了雙室培養(yǎng)的滲透膜， 用透明的細(xì)胞外基質(zhì)( 膠原酶及粘多搪) 構(gòu)成的聚合體作為滲透膜，可以在體外培養(yǎng)過程中觀察細(xì)胞的 形態(tài)變化。他們用此方法觀察到精原細(xì)胞擴(kuò)增并分化至減數(shù)分裂前期；初級(jí)精母細(xì)胞發(fā)生減數(shù)分裂 分化；圓形精子細(xì)胞形成長(zhǎng)形精子細(xì)胞，有結(jié)構(gòu)正常的頂體、可活動(dòng)的鞭毛?，F(xiàn)代取室培養(yǎng)系的滲 透性薄膜采用聚乙烯對(duì)苯二酸o o l y 甜l y l e t c r 印h 1 a l a i c ，p e l r ) 膜，操作簡(jiǎn)便培養(yǎng)的效果更為穩(wěn)定、 可靠。：f o 細(xì)胞是異種的非整倍體細(xì)胞可分泌甘氨酸、丙氨酸、乳酸鹽、生長(zhǎng)因子、可溶性因子 ( 如促有絲分裂因子) 等促進(jìn)生殖細(xì)胞的發(fā)育、分化；同時(shí)去除培養(yǎng)環(huán)境中對(duì)生殖細(xì)胞發(fā)育不利的物質(zhì)， 如重金屬二價(jià)暇i 離子、次黃嘌呤、代謝抑制因子等1 7 。l ，還能分泌體內(nèi)精子發(fā)生所需的部分生長(zhǎng)因子 與白介素。 1 1 3 細(xì)胞在體外存活及分化 c m d e s 等h 1 將人圓形精子細(xì)胞置于v c r o 細(xì)胞條件培養(yǎng)基中共培養(yǎng)5 d ，能使這些細(xì)胞進(jìn)一步 發(fā)育成熟為長(zhǎng)形精于細(xì)胞。s n 等【9 1 用非梗阻性無精子癥患者睪丸活檢的組織分離、純化。獲得初、 次級(jí)精母細(xì)胞與支持細(xì)胞，置于細(xì)胞條件培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2 3 周，結(jié)果初、次級(jí)精母細(xì)胞經(jīng)減 數(shù)分裂分化成圓形精子細(xì)胞這些圓形精子細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)育成熟為具有正常形態(tài)的躍形精于細(xì)胞 他們將這些接近成熟的長(zhǎng)形精于細(xì)胞通過卵胞漿內(nèi)單精子注射術(shù)( i c s i ) 注入人卵內(nèi)，結(jié)果有囊胚形 成。這些精子細(xì)胞的受精率約3 1 3 8 ，但大多數(shù)已受精的胚胎未能發(fā)育到桑椹胚階段且伴有性 染色體異常。w e i s s 等m 川雙室培養(yǎng)取得比較好結(jié)果的同時(shí)，改進(jìn)了生殖細(xì)胞發(fā)育的檢測(cè)方法：用 5 一溴_ 2 - 脫氧尿茁( b r d u ) 替代h 3 - t d r 作為胸苷類似物標(biāo)記，跟蹤觀察生殖細(xì)胞的分化；應(yīng)用p c r 技術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞特異性基岡表達(dá)的變化：編碼磷蛋白1 9 ( p 1 9 ) 和睪丸特異性組蛋白2 b ( t h 2 b ) 的 i i l r n a 特異性表達(dá)丁粗線期初級(jí)精母細(xì)胞編碼過渡蛋白1 f r p l ) 和過渡蛋白2 ( t p 2 ) 的m r n a 特異 性表達(dá)于圓形精子細(xì)胞在培養(yǎng)過程中定期檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞中p 1 9 、t h 2 b 、t p l 、t p 2 的水平，觀察 p 1 9 ，r p l 、t h 2 b ，r p 2 的變化從而確定培養(yǎng)細(xì)胞分化、發(fā)育情況。這樣既可避免放射線對(duì)細(xì)胞發(fā)育 的影響，義能更準(zhǔn)確地確定細(xì)胞分化的各個(gè)階段。 2 西南大學(xué)碩士學(xué)位論文第一章文獻(xiàn)綜述 1 1 4 器官培養(yǎng)和組織培養(yǎng)的發(fā)展 用器官和組織培養(yǎng)的方法研究雄性生殖細(xì)胞體外成熟過程的優(yōu)點(diǎn)是保持睪丸原有的正常腔室結(jié) 構(gòu)和生殖細(xì)胞與體細(xì)胞的相互聯(lián)系。器官培養(yǎng)是研究精原細(xì)胞分裂及其進(jìn)入減數(shù)分裂前期調(diào)控機(jī)制 的很好的培養(yǎng)模型用。1 9 8 3 年，p a r v i n 等用透視微分離技術(shù)他d l l l i q u f 缸硼s i l l u m i m a 豁i s t 酣 l i l i 廿0 d i s s e c t i 徹汾離出某特定階段的生精小管片段，培養(yǎng)2 d 后大多數(shù)初級(jí)精母細(xì)胞完成了2 次減 數(shù)分裂，分化成精子細(xì)胞。2 0 0 0 年s k i u b 等【l w 進(jìn)一步改進(jìn)了組織培養(yǎng)的方法，將生精小管用酶消 化后得到的小管碎片置于雙室培養(yǎng)系中經(jīng)3 周培養(yǎng)，細(xì)線期初級(jí)精母細(xì)胞分化為圓形精子細(xì)胞。 從而完成了完整的減數(shù)分裂階段的分化。同時(shí)，他們除用b r d u 標(biāo)記和檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞的特異性基因 t p l 、t p 2 外，還用光、電鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化，用流式細(xì)胞儀分析培養(yǎng)細(xì)胞的倍體變化 發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)得到的耩子細(xì)胞發(fā)生時(shí)程和形態(tài)與體內(nèi)相應(yīng)生理情況下一致。 1 1 5 未成熟生精細(xì)胞體外培養(yǎng)的研究在輔助生殖上的應(yīng)用 男性不育癥患者中約l 由無精子癥引起。非梗阻性無精子癥的病因主要是發(fā)生在減數(shù)分裂階 段的初級(jí)精母細(xì)胞發(fā)育阻滯，以往臨床對(duì)這類患者缺乏有效治療方法。近年來。i c s i 、圓形精子細(xì) 胞注射術(shù)u i l ds p e m 撕d 蜘e c t i o n ，r o s i ) 、長(zhǎng)形精子細(xì)胞注射術(shù)( c l g a t c ds p e m t i d 嘶t i o n ，e l s d 已獲得成功( 1 4 f 6 】。1 e 謾等用阻滯于初級(jí)精母細(xì)胞階段的生精細(xì)胞在體外培養(yǎng)為精子細(xì)胞，顯微 注射人卵子內(nèi)，獲妊娠成功產(chǎn)卜，發(fā)育正常的雙胞胎嬰兒。為無精子癥和弱精于癥患者的治療提供 了新的方法。 1 1 6 存在的問題與展望 雖然近年來已有精母細(xì)胞實(shí)現(xiàn)體外完成兩次減數(shù)分裂的報(bào)道”。但目前整個(gè)成功率還很低 i i ，”，如體外培養(yǎng)初情期前w i s i a r 人鼠睪丸精曲小管片段3 d ，只有6 2 的減數(shù)分裂前期的初級(jí)精 母細(xì)胞在體外完成兩次減數(shù)分裂到達(dá)精細(xì)胞階段1 2 ”。也有研究表明，體外精于發(fā)生的速度比體內(nèi)快 得多，產(chǎn)生的配子在形態(tài)上也有異常2 ”。而要提高體外精子培養(yǎng)的成功率，還有賴丁從分子水平上 深入了解精子發(fā)生尤其是減數(shù)分裂完成的調(diào)控機(jī)制。 1 2 精子發(fā)生的調(diào)控元件 哺乳動(dòng)物配子發(fā)生是研究細(xì)胞周期調(diào)牡的重要平臺(tái)。哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞周期包括有絲分裂及減 數(shù)分裂，關(guān)于其調(diào)控基因現(xiàn)已被證明，包括激酶復(fù)合物、磷酸酶、調(diào)解蛋白及相應(yīng)的底物。作為生 命周期的重要環(huán)節(jié)，雄性精子發(fā)生過程的分子調(diào)控機(jī)制近年來已成為生物學(xué)領(lǐng)域中一個(gè)重要的研究 課題。因此以卜就雄性哺乳動(dòng)物細(xì)胞周期幾種關(guān)鍵調(diào)控因子進(jìn)行綜述。 西南大學(xué)碩+ 學(xué)位論文第一章文獻(xiàn)綜述 哺乳動(dòng)物配子發(fā)生是個(gè)十分復(fù)雜的過程，既包括有絲分裂義含有減數(shù)分裂，因而是研究細(xì)胞周 期調(diào)節(jié)的重要對(duì)象。已有的研究表明， m 期促進(jìn)因子( m p h a p 塒n o t i n gf k t o f ，m p 即是有絲分裂和 減數(shù)分裂的關(guān)鍵控制因子1 9 7 1 年m 酗u i ，m a r k c n 首次在青蛙中發(fā)現(xiàn)，m p f 作為激活劑引起卵母 細(xì)胞g v b d ( g e n 曲lv e s i c l eb r e a l 【d o w n ) 并恢復(fù)減數(shù)分裂【“，是由催化業(yè)基絲氨酸，蘇氨酸蛋白激酶 c d k l ( 周期蛋白依賴性激酶l c ”l i n _ d e p e n d e n tk i n e b 1 ) 以及調(diào)節(jié)亞基c ”l i nb l ( 周期蛋白b 1 ) 構(gòu)成的異源二聚體【2 4 l ，物種問具有高度保守性。高等真核生物細(xì)胞周期的控制位點(diǎn)在簡(jiǎn)單有機(jī)體中 不存在且細(xì)胞的發(fā)育及組織起源也有差異。例如，哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞存在唯一的細(xì)胞周期控制點(diǎn)： 進(jìn)入減數(shù)分裂的信號(hào)與酵母不同，且在減數(shù)分裂雙線期及mi i 期有停滯。精母細(xì)胞也有些相似的控 制位點(diǎn)，只是沒有明顯的停滯，因此這些控制位點(diǎn)很可能存在與迄今研究的酵母不同的特殊基因調(diào) 控因子。 1 2 1 有絲分裂調(diào)控位點(diǎn)及調(diào)控元件 哺乳動(dòng)物有絲分裂細(xì)胞周期根據(jù)轉(zhuǎn)換順序可以分為四個(gè)階段，包括d n a 合成的s 期、完成有 絲分裂的m 期及兩個(gè)間期g l 和g 2 期。這些階段的進(jìn)行是一系列酶的作用結(jié)果，而這些酶的激活 也是被高度控制的。g 1 ，s 及g 2 ，m 轉(zhuǎn)換期的調(diào)控位點(diǎn)確保了這些階段的適時(shí)發(fā)生。促進(jìn)有絲分裂進(jìn) 程的主要酶包括調(diào)節(jié)弧基周期蛋白c ”l i n 及催化亞基周期依賴蛋白激酶c d l ( ( c y c l i n d 印e n d e m k i l l 髂e ) 。從酵母到人類的多種有機(jī)體中c ”l i m 的氨基酸具有同源性，與酵母細(xì)胞周期蛋白突變體的 功能互補(bǔ)。高等脊椎動(dòng)物的c y c l i n s 至少可以分為八個(gè)等級(jí)，即c ”l i r a c y c l i n h 【”l 。哺乳動(dòng)物系統(tǒng) 的復(fù)雜性不僅是由于c y c l i n s 的等級(jí)多，而且a 一、b 及d 型c y c l i i i 家族成員也很復(fù)雜。盡管它們?cè)?哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞發(fā)育中功能的研究還剛剛開始但是一些實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在雄性、雌性動(dòng)物生殖細(xì) 胞及去勢(shì)動(dòng)物體細(xì)胞層中各種c ”1 i n s 表現(xiàn)了不同的表達(dá)模式，如1 9 9 6 年c h a p m a n 和w o l g e m u 廿1 實(shí)驗(yàn)證明，處于減數(shù)分裂期的生殖細(xì)胞與未分化的體細(xì)胞區(qū)別來源丁兩種b 刪c y c l i m ( c ”l i n b l ，c y c i i n b 2 兩r n a 表達(dá)時(shí)間的籌異怛“。 c d k 是絲氨酸，蘇氨酸激酶家旅的成員這些成員具有相同的保守催化區(qū)及磷酸化位點(diǎn)。在哺乳 動(dòng)物細(xì)胞中的c d k 最少有9 種，并與不同的c ”l i n 配對(duì)。對(duì)c y c l i n 的選擇可能影響復(fù)合物的酶活 性及作f i 底物口”。 有絲分裂細(xì)胞周期中，激活信號(hào)傳導(dǎo)途徑的d n a 一旦籀生結(jié)構(gòu)損壞、復(fù)制錯(cuò)誤或折營錯(cuò)誤均可 引起細(xì)胞g l s 、g 2 m 及中后期阻滯。日 i 研究發(fā)現(xiàn)延長(zhǎng)o l s 轉(zhuǎn)變期有兩個(gè)細(xì)胞周期調(diào)控點(diǎn)這 兩個(gè)調(diào)控點(diǎn)也作用于c d l ( 2 的活化。晟初是由于c d c 2 5 a 的降解引起c d l c 2 的抑制2 ”。而p 2 1 的p ”依 賴產(chǎn)物則使該轉(zhuǎn)變j l l 繼續(xù)拖延該產(chǎn)物可結(jié)臺(tái)并阻i pc d l 【2 ，c y c “n e 復(fù)合物的活化【。g 2 ，m 期阻滯 是由于阻礙了m p f ( c d k l ，c y c l i n b l ) 的去磷酸化阻i r 蛋白激酶c 1 1 l 【l 的活化可引起c d c 2 5 c 的抑制， 在酵母及人體中都證明c l l i c l 是m p f 抑制的土要機(jī)制”m ”j 。紡錘體控制位點(diǎn)的活化發(fā)生在中后轉(zhuǎn)變 期，在該點(diǎn)微管接觸著絲點(diǎn)并拉伸使染色體適當(dāng)排列t | 亓才允許細(xì)胞進(jìn)入后期。在缺乏控制位點(diǎn)活化 4 兩南人學(xué)碩十學(xué)位論文第一章文獻(xiàn)綜述 和蛋白降解的情況f ，紡錘體控制位點(diǎn)的組成部分抑制a p c 活化可使姐妹染色單體分離結(jié)求有絲分 裂o ”。 1 2 2 減數(shù)分裂的調(diào)控 一些實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明減數(shù)分裂細(xì)胞周期也存在著控制點(diǎn)但這些研究主要是在酵母中進(jìn)行的。酵 母由于染色體聯(lián)會(huì)不完全及重組而在減數(shù)分裂前期的粗線期發(fā)生停滯p ”。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)減數(shù)分裂前期一 旦發(fā)生缺陷后細(xì)胞將不能進(jìn)入mi 期，據(jù)此可推測(cè)哺乳動(dòng)物可能存在相似的控制點(diǎn)。缺乏重組基因、 d 1 q a 修復(fù)基因或細(xì)胞周期調(diào)控因子基因的雄性小鼠出現(xiàn)前期染色體聯(lián)會(huì)或重組缺陷，最后與酵母結(jié) 果不同的是這直接導(dǎo)致了細(xì)胞凋亡。而細(xì)胞停滯在前期的不同階段也說明控制點(diǎn)不止一個(gè)。1 9 9 9 年 s c h w a r t zd ，g o l d f m g 日n 等通過低水平輻射使初級(jí)精母細(xì)胞表現(xiàn)為g 2 期延遲而缺乏p ”的初級(jí)精 母細(xì)胞卻沒有發(fā)生，證明了p ”延遲g 2 期的作用1 3 ”。果蠅實(shí)驗(yàn)證明紡錘體控制點(diǎn)可能也在初級(jí)精母 細(xì)胞減數(shù)分裂中活化。用秋水仙素處理或含有不對(duì)稱同源染色體的初級(jí)精母細(xì)胞會(huì)延遲進(jìn)入后期p ”。 由于兩性配子發(fā)生過程存在差異，所以人們推斷雄性哺乳動(dòng)物細(xì)胞周期存在特殊的調(diào)控物質(zhì)。 哺乳動(dòng)物存在兩種a 型c y c “m c y c l i n a l 兒乎只存在于雄性動(dòng)物生殖細(xì)胞中而c y c i i i i a 2 卻廣泛 表達(dá)p q 。實(shí)驗(yàn)證明c y c l i i l a 2 可以促進(jìn)g l s 、g 2 ，l 期轉(zhuǎn)變，c y c l i n a 2 缺乏小鼠導(dǎo)致甲期胚胎死亡。 通過c y c l i n a l 基因突變實(shí)驗(yàn)證明其對(duì)精母細(xì)胞進(jìn)入m l 期有重要作h j 。 通過原位雜交分析及免疫組織化學(xué)分析法人們發(fā)現(xiàn)，c y c h na l 的m r n a 及蛋白質(zhì)表達(dá)在粗線 期后期急劇升高，而當(dāng)?shù)谝淮螠p數(shù)分裂結(jié)束時(shí)義降低到兒乎消失。所以可推測(cè)c y c l i n a l 的表達(dá)可能 調(diào)控細(xì)胞周期p 1 。而c y c l i na 2 的m r n a 與蛋白質(zhì)表達(dá)水平的高峰則出現(xiàn)在處于有絲分裂階段的生 殖千細(xì)胞、精原細(xì)胞、前細(xì)線期精母細(xì)胞及減數(shù)分裂前d n a 合成期的細(xì)胞p 6 l ，此外c y c l i na 2 還在 s e r l o l i 細(xì)胞中表達(dá)。在卵巢和卵母細(xì)胞中均朱發(fā)現(xiàn)c y c l j n a l 的i i l r n a ，不過在成年9 日巢、體細(xì)胞及 生殖細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了c y c l i n a 2 的表達(dá)。似乎可以證明c y c l i n a l 在雄性生殖細(xì)胞中的特異性表達(dá)。 1 9 9 8 年“u n 等將c y c l m a l 基岡定向突變得到c y c i i n a l 缺失小鼠，該鼠精子發(fā)生過程停滯住 第一次減數(shù)分裂前期而導(dǎo)致不育，且生殖細(xì)胞凋亡數(shù)趨增多細(xì)胞聯(lián)會(huì)消失或畸形c d l 【l 及c ”i i nb l 水平正常，但m p f 明顯減少p ”。從而證明了c ”l i n a l 對(duì)精母細(xì)胞進(jìn)入第一次減數(shù)分裂的重要性。 l i u n 等對(duì)c y c i i n a l 缺失小鼠使川o a 結(jié)果m p f 恢復(fù)活性細(xì)胞染色體濃縮并進(jìn)入減數(shù)分裂期， c d c 2 5 蛋白高度磷酸化證明c ”l ma l 是m p f 活化的前提。相反通過釩酸鹽抑制0 a ，從而進(jìn)一步 抑制減數(shù)分裂恢復(fù)。c d c 2 5 a 及c d c 2 5 c 的表達(dá)高峰出現(xiàn)在減數(shù)分裂前期蛋白激酶復(fù)合物包括c v c l i n a l 及c d k l 或c d k 2 可以使c e c 2 5 a 和c d c 2 5 c 發(fā)生磷酸化。上述實(shí)驗(yàn)證明在正常的雄性生殖細(xì)胞中 c y c l i na 1 參與調(diào)控其它蛋白激酶或磷酸酯酶使細(xì)胞完成g 2 m 期轉(zhuǎn)變，此外還可能通過激活c d c 2 5 磷酸酶而直接與m p f 擴(kuò)增相芙聯(lián)。 5 西南人學(xué)碩十學(xué)位論文第一章文獻(xiàn)綜述 2m p f 的研究 2 1m p f 的研究進(jìn)展 m p f 。即成熟促進(jìn)因子( n 壕t u 隨t i o np m m 嘶n gf a c i o r ) 或m 期促進(jìn)因子( m p h a 辯p m m o t i l l g 丘i c t 盯) ， 或細(xì)胞促分裂因子( 嘶t o s i s _ p m m n n g f h c i o r ) 。m p f 晟早發(fā)現(xiàn)并被命名于2 0 世紀(jì)7 0 年代初期。近期的 工作不僅逐步鑒定了m p f 的構(gòu)成，同時(shí)也證明了其在細(xì)胞周期調(diào)控中的重要作用。 1 9 7 0 年，j o h n s o n 和r 將h e l a 細(xì)胞同步化，然后將m 期細(xì)胞與其他間期細(xì)胞在仙臺(tái)病毒介導(dǎo)下 融合，并繼續(xù)培養(yǎng)。他們發(fā)現(xiàn)，與m 期細(xì)胞融合的間期細(xì)胞發(fā)生了形態(tài)各異的染色體凝集。并稱之 為染色體超前凝集0 m t i l r ec t i m m o m ec o n d e m a t i o n ，p c c ) 。此種染色體則稱為超前凝集染色體。 不同時(shí)期的間期細(xì)胞與m 期細(xì)胞融合，產(chǎn)生的p c c 的形態(tài)各不相同。g l 期p c c 為單線狀s 期p c c 為 粉末狀，g 2 期p c c 為雙線染色體狀。p c c 的這種形態(tài)變化可能與d n a 復(fù)制狀態(tài)有關(guān)。染色體超前凝 集在其它細(xì)胞中也被證明。m 期細(xì)胞可以誘導(dǎo)p c c ，提示在m 期細(xì)胞中可能存在一種誘導(dǎo)染色體凝集 的因子，稱為細(xì)胞促分裂因子p ”。 1 9 7 1 年，m a i 和m a r k e r t 用非洲爪蟾卵做試驗(yàn)，明確提出了m p f 這一概念。非洲爪蟾卵細(xì)胞發(fā) 育過程可以分為6 個(gè)階段，即第1 、i l 、i i l 、v 和期。第1 至第期為卵母細(xì)胞生成和生長(zhǎng)階 段。第期卵母細(xì)胞達(dá)到一定體積，停j 卜生長(zhǎng)，等待成熟。此時(shí)的卵母細(xì)胞處于第一次減數(shù)分裂期 前期階段，含有一個(gè)體積較大的細(xì)胞核，稱為( g e m i m lv e s i d e ，g v ) 。卵母細(xì)胞成熟需要雌性激素孕 酮的刺激。在孕酮作用卜- ，卵母細(xì)胞向v 和期轉(zhuǎn)化。生發(fā)泡破裂( g vb m k d o w n ，g v b d ) ，染色 體凝集，進(jìn)行第一次減數(shù)分裂；然后立即進(jìn)行第二次減數(shù)分裂并停留在分裂中期，即成熟的卵細(xì) 胞( 第期卵細(xì)胞) 。卵母細(xì)胞受精厲形成受精卵。很快便開始卵裂。m a s u 諦i m a r i 【e nj ；i 解剖方法 分離第期卵母細(xì)胞，并_ i j 孕酮進(jìn)行體外刺激誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟形成卵細(xì)胞，再將目日細(xì)胞的細(xì) 胞質(zhì)注射到其它卵母細(xì)胞中，可以誘導(dǎo)后者成熟：再將日q 被誘導(dǎo)成熟的卵母細(xì)胞的少量細(xì)胞質(zhì)注射 到另一些新的卵母細(xì)胞中，仍然可以誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟。因而他們認(rèn)為在成熟卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì) 中，必然有一種物質(zhì)可以誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟。他們將這種物質(zhì)稱作促成熟因子即m pf l 。 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)仆j 孕酮誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟卵母細(xì)胞需要進(jìn)行一定群度的蛋白質(zhì)合成。在有 蛋白質(zhì)合成抑制荊存在的情況f ，孕酮不能誘導(dǎo)目目母細(xì)胞成熟。成熟卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)誘導(dǎo)卵母細(xì) 胞成熟，則不需要蛋向質(zhì)合成：在蚩n 質(zhì)合成抑制中m p f 已經(jīng)存住，只是處】：1 f 活性狀態(tài)，被稱 為前體m p f ( p m p f ) 。1 f 活性態(tài)的前體m p f 通過翻譯后修飾，可以轉(zhuǎn)化為活性態(tài)的m p f 【”】。 m p f 被發(fā)現(xiàn)以后不少學(xué)者便著手m p f 的純化j = 作，但一直進(jìn)展緩慢，直到1 9 8 8 年，才取得突 破性進(jìn)展。1 9 8 8 年，m a i l e r 實(shí)驗(yàn)室的l o h k a 等人以非洲爪蟾為材料，分離獲得了微克級(jí)的純化m p 一”1 井證明其主要含有c d l c l ( 周期蛋白依賴性激酶1 ) 手c y c l i nb l ( 周期蛋白b 1 ) 兩種蛋白。這兩種蛋 白結(jié)合后可以使多種蚩向質(zhì)底物磷酸化畢現(xiàn)蛋白激酶活性。 6 兩南大學(xué)碩十學(xué)位論文第一章文獻(xiàn)綜述 土1 1 細(xì)胞周期蛋白c y c s 的特點(diǎn)及作用 細(xì)胞周期蛋白( c y d l i n s ) 的特點(diǎn)包括：周期蛋白具有一段相當(dāng)保守的氨基酸序列介導(dǎo)周期蛋 白與c d k 結(jié)合，稱為周期蛋白框；m 期周期蛋向近n 端含有一個(gè)由9 個(gè)氨基酸構(gòu)成的特殊序列，參 與泛素介導(dǎo)的周期蛋白a 和b 的降解，稱為破壞框 l g l 期周期蛋白不含破壞框，但其c 端有一段特 殊序列與g l 期周期蛋白更新有關(guān)；不同的周期蛋白框識(shí)別不同的c d k ，形成不同的c y c l j l l s d k 復(fù)合物，表現(xiàn)出不同的c d k 活性；周期蛋白濃度隨細(xì)胞周期進(jìn)程變化而變化。周期蛋白的作用包 括：激活c d k ，引導(dǎo)c d k 作用丁不同底物：不同的周期蛋白在細(xì)胞周期的不同時(shí)期表達(dá)，并與 不同的c d k 結(jié)合，調(diào)節(jié)不同的c d k 的活性。 2 1 2 細(xì)胞周期蛋白依贛性激酶c d k 的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及作用 細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶( c y c l i n _ d e p d tp r o l e i nk i n m ，c d k ) 的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)有；靠近蛋白質(zhì)n 端 的氨基酸序列為a r p 結(jié)合所需，其后是一小段p s l ai r e 結(jié)構(gòu)域( 根據(jù)氨基酸單字母代碼命名) ，該結(jié)構(gòu) 域參與結(jié)合細(xì)胞周期蛋白稱為周期蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域：具有柔性結(jié)構(gòu)域也稱t 環(huán)。它可阻擋蚩白質(zhì) 底物結(jié)合位點(diǎn)，抑制蛋白激酶活性也可移到一邊暴露底物結(jié)合位點(diǎn)使底物磷酸化。只有t 環(huán)中某一 特定的蘇氨酸殘基磷酸化以后周期蛋白激酶才能保持活性狀態(tài)。有活性的c d k 唯一的功能是使其 他蛋白磷酸化即起到蛋白激酶的作_ j 。 2 1 3 細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶c d k 活性的調(diào)節(jié) c d k 的活性狀態(tài)直接影響刨細(xì)胞刷期的進(jìn)程，因此影響其活性的岡素對(duì)細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)有1 f 常重 要的影響。 2 1 3 1 細(xì)胞周期蛋白的濃度 細(xì)胞周期的不同時(shí)相中，彳不同的細(xì)胞周期蛋白基因被轉(zhuǎn)錄。當(dāng)細(xì)胞周期蛋白存在丁胞內(nèi)時(shí)， 它與c d k 結(jié)合，導(dǎo)致催化弧基構(gòu)象發(fā)生重人變化。各種c y c l i n s - c d k 復(fù)合體的x 射線晶體衍射結(jié)構(gòu)顯 示當(dāng)細(xì)胞周期蛋白結(jié)合劍c d k 上時(shí)，c d k 多肽鏈易彎曲的環(huán)( t i o o p ) 遠(yuǎn)離酶活性位點(diǎn)的入口，使 c d k 可以活化其它蛋白底物。 2 1 3 2 細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的磷酸化狀態(tài) 細(xì)胞周期蛋白與c d k 的結(jié)臺(tái)對(duì)c d k 的激活是必需的。但c d k 砸基上關(guān)鍵的蘇氨酸殘基也必須被 磷酸化，才能雖終激活c d k 。該磷酸化過樣需要另一蛋向激酶參與，c d k 激活激酶( c a k ) 。在裂殖酵 兩南大學(xué)碩 一學(xué)位論文第一章文獻(xiàn)綜述 母細(xì)胞中c d k 即c d c 2 分子中1 1 i r l 6 l 的磷酸化使c d c 2 被激活，而1 1 5 殘基的磷酸化卻抑制該酶的活 性。同時(shí)，w e e l 激酶和c d c 2 5 磷酸酶參與此調(diào)節(jié)過程。w e e l 激酶通過加強(qiáng)抑制磷酸基團(tuán)使c d c 2 失活。 c d c 2 酶一直保持失活，直到g 2 期末，由c d c 2 5 磷酸酶切除1 1 l r l 5 殘基上的磷酸基，使c d c 2 恢復(fù)活性。驅(qū)動(dòng) 酵母細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂。w 曲l 和c d c 2 5 活性之間的平衡由其他激酶和磷酸酶調(diào)控。一系列酶參與調(diào)節(jié) c d k 的激活和抑制，可以提供許多靶點(diǎn)，以便來自細(xì)胞內(nèi)外的信息能改變細(xì)胞周期的進(jìn)程。 2 1 3 3 細(xì)胞周期蛋白依贛性激酶抑制因子 c d k 的活性可以由各種抑制因子阻斷例如在芽殖酵母中，一種稱為s i c l 的蛋白作為g l 期c d k 抑制因子。s i c l 的降解使細(xì)胞中的c y c y i n s c d k 起動(dòng)d n a 復(fù)制。 2 1 3 4 受調(diào)控的蛋白水解 細(xì)胞周期蛋白的濃度在每一細(xì)胞周期中起伏變化并因此導(dǎo)致c d k 的活性變化。而在細(xì)胞周期的 不同時(shí)刻，細(xì)胞周期蛋白和其它重要蛋白的濃度的變化，是細(xì)胞通過調(diào)節(jié)各種蛋白的合成或分解速 率來完成的。細(xì)胞周期中有兩類多基復(fù)臺(tái)體參與蛋白質(zhì)的降解一類為s 1 ( p l - c u l li n f 盒蛋白 ( s c f ) 復(fù)合體，另一類是后期促進(jìn)復(fù)合體( a p c ) 。s c f 復(fù)臺(tái)體可能作_ i 于整個(gè)細(xì)胞周期，介導(dǎo)0 l 期 細(xì)胞周期蛋白、c d k 抑制因子和其它周期蛋自的降解。這些需要降解的蛋白首先被調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的 激酶磷酸化，為s c f 的結(jié)合提供靶點(diǎn)，使s c f 結(jié)合而降解蛋白質(zhì)。s c f 的突變可抑制s c f 介導(dǎo)重要蛋 白降解使細(xì)胞周期不能正常進(jìn)行。如g l 細(xì)胞周期蛋白和上述的s i c l 抑制因子若不能水解，則阻l t 細(xì)胞復(fù)制d n a 。a p c 復(fù)合體即后期促進(jìn)復(fù)合體，在有絲分裂期即m 期中起作用，降解許多重要的有 絲分裂蛋白如有絲分裂細(xì)胞周期蛋白，使細(xì)胞脫離有絲分裂，進(jìn)入新的細(xì)胞周期。此外，泛素蚩白 一蛋白酶體途徑( u p p ) 也是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白的土要環(huán)竹。首先，泛素是u p p 中介導(dǎo)蛋白質(zhì)水解的物質(zhì)， 是一個(gè)由7 6 個(gè)氨基酸構(gòu)成的保守蛋向。參與蛋白質(zhì)多泛素化的酶土要有三種：e l 稱作泛素蛋白活化 酶，作川是將泛素蛋白的羧基端與e l 的t 胱氪酸殘基通過硫脂鍵相連激活泛素蛋白。e 2 稱為泛素蛋 向綴合酶，作用是將泛素蛋白從e l 轉(zhuǎn)至e 2 。e 3 稱作泛素蛋白連接酶也稱促后期復(fù)合物( a p c ) 作 _ f 是與e 2 一起將泛素蚩白連接劍需要降解的周期蛋白上。使周期蛋白多泛素化，進(jìn)而被蛋白酶快速 降解。其次a p c 激發(fā)e 2 泛素蛋向復(fù)合物與有絲分裂細(xì)胞周期蛋白n 端的破壞框結(jié)合。然后激發(fā)泛素 蛋向質(zhì)同破壞框c 端的賴氨酸殘基結(jié)合，此過程不斷循環(huán)使細(xì)胞周期蛋白多泛素化。通過基因操作構(gòu) 建了不含破壞框的細(xì)胞周期蛋白結(jié)聚這些蛋白質(zhì)不能降解，說明蛋閂質(zhì)的泛素化對(duì)蛋白質(zhì)的降解 是必要的。由于a p c 的作用，m 剮周l l j 】蛋白被降解，使細(xì)胞退出有絲分裂，進(jìn)入卜一個(gè)周期。與細(xì) 胞周期相關(guān)的許多蛋白質(zhì)都是通過泛素調(diào)節(jié)的過程降解使其濃度出現(xiàn)周期性變化，保證在正確的 時(shí)間和空間上執(zhí)行功能，使細(xì)胞周期止常地運(yùn)轉(zhuǎn)。 西南人學(xué)碩十學(xué)位論文第一章文獻(xiàn)綜述 2 2m p f 對(duì)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂調(diào)控作用的研究 卵母細(xì)胞成熟的調(diào)控機(jī)制是近年來國內(nèi)外科學(xué)工作者研究較多的問題，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)基 礎(chǔ)理論和技術(shù)的發(fā)展，對(duì)于卵母細(xì)胞成熟調(diào)控機(jī)制的研究逐步深入，取得了許多重大成果和突破性 進(jìn)展。 m p f 對(duì)卵母細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)機(jī)制在無脊椎動(dòng)物如海星和低等脊椎動(dòng)物如爪蟾中報(bào)道較多，而 在哺乳動(dòng)物中研究較少。將豬和牛的c o c s ( c u m u l u s 0 0 c y t ec 叩1 e x e s ) 細(xì)胞培養(yǎng)于t c m l 9 9 培養(yǎng)基 中，牛卵母細(xì)胞共培養(yǎng)2 4 h ，豬卵母細(xì)胞共培養(yǎng)4 8 h ，每隔l h 從培養(yǎng)基中取出部分卵母細(xì)胞做m p f 和 m a p k 活性檢測(cè)。m p f 的活性水平通過測(cè)定組蛋白h l 激酶的活性來確定，m a p k 的活性水平通過髓 鞘堿性蛋白( m y c l i n b a s i c p r o t e i n ) 來確定。結(jié)果是兩種卵母細(xì)胞在培養(yǎng)過程中m p f 均出現(xiàn)兩次高峰， 這兩次活性高峰是與兩次分裂中期( m e t a p h e s ) 相對(duì)應(yīng)的。豬卵母細(xì)胞m p f 活性高峰出現(xiàn)在培養(yǎng)后 2 7 3 2 h 之間和4 6 h 之后牛卵母細(xì)胞m p f 活性高峰出現(xiàn)在b 9 h 之間和2 2 h 之后。豬卵母細(xì)胞在3 3 - 3 s h 之間、牛卵母細(xì)胞在1 9 h 之后出現(xiàn)了短暫的m p f 活性降低，這與后期i ( a p h a i ) 和末期i ( t e l 印l l a i ) 相對(duì)應(yīng)。m a p k 的活性在整個(gè)培養(yǎng)過程中逐漸升高，豬卵母細(xì)胞在培養(yǎng)4 7 h 后m a p k 活 性達(dá)到晟高水平，牛卵母細(xì)胞中m a p k 活性晟高值出現(xiàn)在培養(yǎng)2 2 h 后i 蚰l 。郭澤坤等人通過w b s c 鋤雜 交檢測(cè)了小鼠卵母細(xì)胞體外成熟過程中c d l c l 磷酸化的變化。h j 抗c d l c l 的c 末端抗體雜交結(jié)果顯示小 鼠卵母細(xì)胞體外成熟過程中c d l 【1 表現(xiàn)為上、中、- 卜二條帶，其中中帶在4 h 出現(xiàn)井持續(xù)增加直到培 養(yǎng)1 6 h ，在2 0 h 有一個(gè)下降趨勢(shì)并在培養(yǎng)2 4 h 義i 亓i 升。用特異性識(shí)別c d l c l 去磷酸化的t y r - 1 5 和n * 1 4 的抗c d l c l n 末端抗體雜交，結(jié)果證明其中帶為c 血l 在b - 1 5 和1 1 * 1 4 上去磷酸化的形式1 4 “。牛卵母細(xì)胞 m p f 澈活和m a p k 的激活幾乎與g v b d 的同時(shí)發(fā)生。而在豬的卵母細(xì)胞中m a p k 的激活出現(xiàn)在m p f 激活和g v b d 之前l(fā) 帥) 。培養(yǎng)朱成年和成年羊卵母細(xì)胞，發(fā)育至mi j 的卵母細(xì)胞比例相似，但未成年 羊發(fā)育至m i i 期的卵母細(xì)胞由于m p f 水平低不能誘發(fā)其它f 日母細(xì)胞發(fā)生g v b d ，而成年羊則可以1 4 “。 通常認(rèn)為c y c l i nb l 降解是m p f 失活的直接原閃，但近年來的研究結(jié)果對(duì)此義提出了一些異議。小鼠 卵母細(xì)胞中m p f 的失活以致丁i 發(fā)生第一次胚胎有縫分裂不僅儀是w 為細(xì)胞周期蛋白b 1 的降解，同 時(shí)也受c d k l 去磷酸化的調(diào)控【4 ”。卵母細(xì)胞離開m 期進(jìn)入間期的影響岡素很多，近期發(fā)現(xiàn)c a m p - p i ( a 通路在周蚶j 蛋白? 降解和向間期轉(zhuǎn)變中發(fā)揮著重要作圳一l 。 2 3m p f 對(duì)精母細(xì)胞減數(shù)分裂調(diào)控作用的研究 在精子發(fā)生過程過程中m p f 的兩個(gè)程基是細(xì)胞生k 的重要調(diào)控閃子。2 0 0 0 年g 0 d c t 等通過實(shí) 驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，小鼠睪丸細(xì)胞減數(shù)分裂g 2 ，m 期的轉(zhuǎn)換與高水平的c y c l i nb l 和c d k l 出現(xiàn)，并進(jìn)步導(dǎo)致 i | i 的m p f 活性直接相關(guān)”。2 0 0 3 年m u r i e l l eg o d e t ，a m ed a m e s f o y 通過使用一種m p f 有效抑制劑 m s c o v i t i n e 第一次實(shí)驗(yàn)證明了c d k 與雄性生殖細(xì)胞第二次減數(shù)分裂的相天性l 拍l 。上述實(shí)驗(yàn)說明生 精細(xì)胞減數(shù)分裂的全過程都離不開m p f 的活化。不過劍現(xiàn)在為l r 還沒有證據(jù)證明直接抑制m p f 9 西南人學(xué)碩士學(xué)位論文第一章文獻(xiàn)綜述 活化會(huì)阻斷精原細(xì)胞g 2 ，m 的轉(zhuǎn)變，囚此不能排除有其他信號(hào)通路存在的可能性。 2 4 卵母細(xì)胞及精母細(xì)胞成熟過程中m p f 與m a p k 的相互關(guān)系 除c y c l i 和c d k 之外，還有其它途徑同樣對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控起重要作用，如m a p k ( m 砧g e n a c t i v a t e dp m t e i i ik i n a ，促分裂原活化蛋白激酶) 。自從1 9 9 3 年關(guān)于其參與哺乳動(dòng)物卵母細(xì) 胞功能性調(diào)節(jié)的第一篇報(bào)道問世以來，越來越多的人把實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)放到了m a p k 對(duì)動(dòng)物生殖細(xì)胞的調(diào) 控作用上。研究證實(shí)，m a p k 在卵母細(xì)胞成熟、m i i 期停滯、受精后精核轉(zhuǎn)化及原核形成等方面均發(fā) 揮重要的作用。在調(diào)節(jié)微管組裝p 去組裝和核膜破裂p 重建方面的作用尤為重要即】。一般認(rèn)為卵母細(xì)胞 成熟過程中微管和染色體的行為是由m a p k 而不是m p f 調(diào)節(jié)的。在小鼠、大鼠和山羊卵母細(xì)胞中 m a p k 的激活要比m p f 的激活晚2 個(gè)小時(shí)，它不參與減數(shù)分裂啟動(dòng)，只與微管和染色體的組織變化 有關(guān)。而對(duì)于一些人動(dòng)物如豬、牛、馬等，m a p k 在g v b d 時(shí)被磷酸化而被激活，證明m a p k 在卵母 細(xì)胞成熟啟動(dòng)時(shí)起著極重要的作用。以前