（分析化學(xué)專業(yè)論文）毛細(xì)管液相色譜高效電脈微分離方法研究.pdf

墨蘭查蘭翌圭蘭竺竺查 一 一 摘要 選擇毛細(xì)管液相色譜 高效電泳微分離方法為本論文的主攻方向 系統(tǒng)深 入地探索了耋 墮量商熬超相一色譜 h p l c 一妻塑曼電鲞 c e 三堂坌妻方迭 以及 相關(guān)的柱制備新技術(shù) 快速膠束電動(dòng)色譜 m e k c 方法 將所發(fā)展的新技術(shù)和方 法應(yīng)用于中藥復(fù)雜體系樣品和蛋白質(zhì)等生物樣咬的岔析 證明了方法的超強(qiáng)分 離能力和潛在的應(yīng)用價(jià)值 f 論文第一章針對(duì)國(guó)際上色譜 電泳等分離技術(shù)研究微型化 高分離能力的 發(fā)展趨勢(shì) 總結(jié)了該領(lǐng)域相關(guān)的研究工作 詳述了高效微分離方法 包括毛細(xì) 管氣相色譜 微柱h p l c c e 及微芯片分離技術(shù)等 介紹了多維分離方法學(xué)的研 究基礎(chǔ) 并重點(diǎn)評(píng)述了h p l c c e 二雛聯(lián)用技術(shù) 第二章全面探討了建立毛細(xì)管高效液相色譜一毛細(xì)管電泳二維分離系統(tǒng)方 法學(xué)的研究及相關(guān)的柱制備技術(shù) 快速膠束電動(dòng)色譜理論等問(wèn)題 研制了一步 溶膠一凝膠法制備毛細(xì)管h p l c 柱上塞子 o n c o l u m nf r i t 新方法 首次制備出 了耐5 0 0 b ar 裝填壓力的塞子 而且通透性好 通過(guò)0 i mh c l 和0 1 mn a o h 的 極端p i 測(cè)試 化學(xué)穩(wěn)定性好 由此制備的毛細(xì)管柱塔板高度在l3 2 0 m 之間 發(fā)展完善了快速膠束電動(dòng)色譜 m e k c 理論 建立了單位時(shí)間內(nèi)的柱效 n t 與 場(chǎng)強(qiáng) 柱長(zhǎng)關(guān)系的理論模型 研究表明 保持一定的柱長(zhǎng) 并提高電壓 是實(shí) 現(xiàn)快速m e k c 的最佳途徑 在上述基礎(chǔ)上 首次建立了接觸式脈沖切換進(jìn)樣二維 分離系統(tǒng) 接口以兩根毛細(xì)管柱的短暫脈沖接觸實(shí)現(xiàn)進(jìn)樣 進(jìn)樣頻率 進(jìn)樣時(shí) 間和時(shí)序經(jīng)選擇優(yōu)化后 進(jìn)樣效率高達(dá)8 1 遷移時(shí)間 峰高的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 r s d 平均值為1 8 3 o 第三章集中探討了高效微分離方法在中藥 蛋白質(zhì) 核酸等復(fù)雜體系樣品 分離中的應(yīng)用 第一次用毛細(xì)管h p l c m e k c 二維聯(lián)用技術(shù)分離了甘草提取物中 的1 10 種紐分 復(fù)方小承氣湯中的2 5 0 余種組分 證明了該方法將有重要的學(xué) 術(shù)價(jià)值和應(yīng)用前景 運(yùn)用毛細(xì)管t l p l c 柱對(duì)蛋白質(zhì)樣品的分離結(jié)果優(yōu)于常規(guī)i t p l c 柱 為蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了強(qiáng)有力的支持 論文最后還探索了線性聚丙烯酰 胺毛細(xì)管凝膠電泳 c g e 方法 分離效能高達(dá)10 6 m 2 0 次重復(fù)進(jìn)樣r s d 小于 4 初步應(yīng)用于人工合成的寡聚核苷酸片段分離 純度鑒定 卜 一 蘭蘭查蘭竺圭蘭蘭蘭查 一 一 一 a b s t r a c t t h et h e s i sa i m sa td e v e l o p i n g ac o m p r e h e n s i v et w o d i m e n s i o n a ls y s t e m i n c o u p l i n gc a p i l l a r yh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y h p l c w i t h c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s c e m e a n w h i l e r e l a t e d m e t h o d sf o r c a p i l l a r y c o l u m n p r e p a r a t i o n s a n d h i g hs p e e d m c e l l a re l c t r o k i n e t i c c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s m e k c w e r ed e v e l o p e d t h e n e wm e t h o d sh a v eb e e n a p p l i e dt ot h ea n a l y s i so fc o m p l e xs a m p l e so ft r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n e s a n d p r o t e i n s a n dp r o v e t ob eo f e x t r e m e l yh i g h e f f i c i e n tr e s o l u t i o n c a p a b i l i t i e s t h et h e s i si sd i v i d e di n t o3s e c t i o n s s i n c em i n a t u r i z a t i o na n dh i g h e f f i c i e n c yi sag e n e r a lt r e n di nc h r o m a t o g r a p h ys c i e n c e s a d v a n c e ds t u d i e si n t h i sf i e l dh a v eb e e ns u m m a r i z e di nt h ef i r s ts e c t i o no ft h et h e s i s m i n a t u r i z e d t e c h n i q e so fc a p i l l a r yg a sc h r o m a t o g r a p h y c a p i l l a r yh p l c c ea n dm i c r o c h i ps e p a r a t i o nw e r e d i s c u s s e di nd e t a i l s t h ep r i n c i p l eo fm u l t i d i m e n s i o n a l s e p a r a t i o nh a s a l s ob e e n i n t r o d u c e d e s p e c i a l l y f o rh p l c c e t e c h n i q u e s i nt h es e c o n d p a r t o ft h et h e s i s s t u d i e s0 1 12 dc a p i l l a r yh p l c c e s y s t e m p r e p a r a t i o no fc a p i l l a r yh p l c c o l u m na n dt h e o r e t i c a lm o d e so fh i g h s p e e d m e k ch a v eb e e ni n t e n s i v e l y e x p l o r e d a s o n eo ft h ek e ys t e p st o i m p l e m e n t t h e2 d s e p a r a t i o ns y s t e m o n e s t e pp r e p a r a t i o no fo i l c o l u m nf l i t f o r c a p i l l a r y c o l u m nu s i n gs o l g e l t e c h n o l o g y w a sd e v e l o p e d t h ef r i ti s c h a r a c t e r i z e db yr e s i s t i n gp a c k i n gp r e s s u r eu pt o5 0 0b a ra n de x t r e m ep h c o n d i t i o n so f0 1 m o l lh c ia n dn a o h p o c e s s i n gg o o d p e r m e a b i l i t y t h e t h e r e t i c a l p l a t eh e i g h t o f c a p i l l a r y c o l u m nm a i n t a i n s 1 3 2 0 m u n d e r c o n s e c u t i v ey e a r so ff r e q u e n t r u n h i g hs p e e dm e k cs e p a r a t i o n sw e r e a l s o i n v e s t i g a t e d t h e t h e o r e t i c a l a s p e c t s o n p l a t e sp e r u n i tt i m ev s e l e c t r i c s t r e n g t ha n dc o l u m nl e n g t hw e r e s t u d i e d t h er e l a t i o n s h i pw a sa l s od e r i v e d i t sc o n c l u d e dt om a i n t a i nc e r t a i n c o l u m n l e n g t h a n di n c r e a s e v o l t a g e 2 墨蘭查蘭竺主蘭竺蘭苧 一 s i m u l t a n e o u s l y b a s e d o n h i g hs p e e d m e k ca n dn o v e l c a p i l l a r y h p l c c o l u m n t e c h n i q u e s t h ec o n t a c tp u l s e i n t e r f a c ef o r2 d s y s t e mw a sd e v e l o p e d b yo p t i m i z i n gs a m p l i n gf r e q e n c ya n dt i m i n go r d e r s t h ei n j e c t i o ne f f i c i e n c y f o rc ei su pt o8 1 r e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o no fm i g r a t i o nt i m e sa n dp e a k h e i g h t sa r e3 0 a n d1 8 r e s p e c t i v e l y t h et h i r ds e c t i o nf o c u s e so nt h ea p p l i c a t i o no fh i g he f f i c i e n c ym i c r o s e p a r a t i o nt e c h n i q u e s m a i n l yf o rt r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n e p r o t e i n d n a s a m p l e s h u n d r e n d so fc o m p o n e n t si n e x t r a c t sf r o ml i c o r i c ea n dc o m p l e x m e d i c i n eh a v eb e e ns e p a r a t e du s i n g2 dc a p i l l a r yh p l c c es y s t e m w h i c h d e m o n s t r a t e si t s p o w e r f u lr e s o l u t i o nc a p i b i l i t i e s i nt h ec a s eo fs e p a r a t i n g p r o t e i ns a m p l e s p e r f o r m a n c e o f c a p i l l a r y h p l cc o l u m n si s s u p e r i o r t o c o n v e n t i o n a lc o l u m n sa n dp r o v i d e s s u p p o r tt op r o t o m es t u d i e s b e s i d e s c a p i l l a r yg e le l e c t r o p h o r e s i s i s a p p l i e d t od n a a n a l y s i s f o rt h ep r e p a r e d l i n e a rp o l y a c r y l a m i d ec ec o l u m n h i g hs e p a r a t i o n e f f i c i e n c 7 o f1 0 6mh a s b e e no b t a i n e d r s d o f2 0c o n s e c u t i v e i n j e c t i o n s i sl e s st h a n 4 t h e t e c h n i q u eh a sb e e na p p l i e dt ot h es e p a r a t i o na n dp u r i t ya n a l y s i so fs y n t h e t i c o l i o n e u c l e d e s 一苧蘭查竺 主蘭竺蘭查 一 一一 第一章 文獻(xiàn)綜述 現(xiàn)代分析化學(xué) 因其可以提供有關(guān)物質(zhì)組成 結(jié)構(gòu)及能量狀態(tài)等信息 而 在生命科學(xué) 醫(yī)藥衛(wèi)生 環(huán)境化學(xué) 材料科學(xué)等領(lǐng)域的發(fā)展中發(fā)揮著極其重要 的作用 對(duì)于生化樣品 天然產(chǎn)物等復(fù)雜體系的分析 已成為現(xiàn)代分析化學(xué)最 重要的研究課題之一 復(fù)雜樣品的分析 一般包括提取制備 分離純化 分析鑒定三個(gè)步驟 其 中分離純化是至關(guān)重要的一環(huán) 因?yàn)橹挥幸欢ㄙ|(zhì)量的純品 才能滿足下一步結(jié) 構(gòu) 物性測(cè)定 活性 毒理實(shí)驗(yàn) 乃至治療 培育的需要 但生物大分子不僅 本身的結(jié)構(gòu) 組成 序列 構(gòu)象 復(fù)雜 而且所處環(huán)境也是各種各樣犬小分子 的混雜體 以中藥為代表的天然產(chǎn)物也是品種繁多 成分多樣 而且據(jù)樣品 來(lái)源不同含量變化不一 中藥復(fù)方成分更是復(fù)雜多樣 1 此外 復(fù)雜體系中還 存在著相當(dāng)數(shù)量的微量組分 可能對(duì)整個(gè)體系的功效起到關(guān)鍵性作用 因 此 對(duì)生物大分子 天然化合物等復(fù)雜體系實(shí)現(xiàn)高效分離 高靈敏檢測(cè)一直是 廣大生物學(xué) 化學(xué) 醫(yī)藥學(xué)工作者關(guān)心并研究的課題 色譜自本世紀(jì)初問(wèn)世以來(lái) 隨著氣相色譜 g c 液相色譜 l c 毛細(xì) 管電泳 c e 等多種分離模式的出現(xiàn) 已成為人類掌握的對(duì)復(fù)雜混合物分離效率 最高的方法 伴隨著分析儀器小型化的發(fā)展趨勢(shì) 色譜微分離技術(shù)也目益引起 關(guān)注并得到廣泛應(yīng)用 與常規(guī)尺寸的色譜分離方法相比 微分離方法使用更 小的分離尺寸 對(duì)樣品 固定相及流動(dòng)相的消耗量都大為減少 特別適合對(duì)于 來(lái)源比較困難的生化 天然產(chǎn)物的分析 同時(shí) 其分離效能 靈敏度都得以大 幅度提高 分離時(shí)間也相應(yīng)縮短 在多組分 低含量的復(fù)雜體系的分析中顯示 出獨(dú)有的優(yōu)勢(shì) 通常一維分離難以完全滿足復(fù)雜體系對(duì)峰容量的要求 多維聯(lián)合分離技 術(shù) 是將幾種基于不同機(jī)理的分離模式聯(lián)用 使系統(tǒng)峰容量有了大幅度的提高 一蘭蘭查蘭 主蘭竺蘭查 一 一 為復(fù)雜體系的高效分離開(kāi)辟出一條嶄新的途徑 l c l c m l c c e 伊 等聯(lián) 用技術(shù)已被成功地應(yīng)用于蛋白 多肽等復(fù)雜生化樣品的分離分析中 因此 發(fā)展高效微分離方法 并借助多維聯(lián)合分離技術(shù) 成為解決復(fù)雜體 系分離分析的最佳途徑 各種微柱制備技術(shù)的成熟及小型化儀器的發(fā)展 必將 為微分離技術(shù)的應(yīng)用開(kāi)辟更為廣闊的前景 2 微分離技術(shù)研究進(jìn)展 毛細(xì)管氣相色譜 微柱高效液相色譜 毛細(xì)管電泳 毛細(xì)管超臨界流體色 譜是目前較為成熟的幾種高效微分離技術(shù) 由于分離機(jī)理不同 而在不同的研 究領(lǐng)域展現(xiàn)著其優(yōu)勢(shì) 微芯片分離作為微分離技術(shù)的又一個(gè)新方向 也日益引 起關(guān)注 2 1 毛細(xì)管氣相色譜 微分離技術(shù)的第一次重大突破是毛細(xì)管氣相色譜 c g c 的出現(xiàn) 色譜動(dòng) 力學(xué)理論認(rèn)為 傳統(tǒng)g c 填充柱相當(dāng)于一束涂有固定液的毛細(xì)管 而毛細(xì)管內(nèi)徑 等于固定相顆粒直徑 由于這束毛細(xì)管是彎曲 多徑的 致使氣流運(yùn)行中渦流 擴(kuò)散嚴(yán)重 傳質(zhì)阻力很大 柱效降低 19 5 7 年 g 0 1 a y 3 川根據(jù)自己的理論推 斷 毛細(xì)管內(nèi)徑既決定毛細(xì)管對(duì)氣流的阻力 也決定理論塔板高度 并以1 m 0 8 m mi d 內(nèi)涂固定液的柱子進(jìn)行了實(shí)驗(yàn) 這種效能極高的色譜柱被稱為c g c 柱 195 8 年 他又提出了涂壁毛細(xì)管色譜速率理論 奠定了c g c 的理論基礎(chǔ) 為高分辨色譜開(kāi)創(chuàng)了一條新路 隨后毛細(xì)管色譜儀和拉制機(jī)裝配成功 在8 0 m 0 25 m mi d 角鯊?fù)橹汐@得了10 萬(wàn)理論塔板數(shù)的柱效 7 0 年代初 研究工作者嘗試對(duì)玻璃毛細(xì)管內(nèi)壁進(jìn)行各種處理 例如 氣態(tài) h c l 腐蝕法 涂載法5 1 氟醚處理法 j 都使得玻璃毛細(xì)管的柱效 惰性及 熱穩(wěn)定性有了極大的提高與改善 1 97 9 年 d a n d e n e a n 等借用拉制光導(dǎo)纖維 的技術(shù) 拉制出石英彈性毛細(xì)管柱 它具有惰性的內(nèi)表面和彈性 為毛細(xì)管柱 增加了新的生命力 在微分離技術(shù)中得以廣泛應(yīng)用 現(xiàn)代c g c 柱每米塔板數(shù)一 復(fù)旦大掌碩士掌位論文 一 一 一 般在2 0 0 0 5 0 0 0 總拄效可達(dá)106 在2 h 內(nèi)分析出3 0 0 個(gè)紐分 它以其快速 高效的特點(diǎn)在人類健康 環(huán)境保護(hù) 生態(tài)平衡 能源供求等領(lǐng)域的研究中發(fā)揮 著重要作用 2 2 微枉高效液相色譜 五十年代開(kāi)始應(yīng)用的l c 由于不受分析對(duì)象揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制 而 特別適宜于分析在生物學(xué) 醫(yī)學(xué)上有重要意義的大分子 不穩(wěn)定的天然產(chǎn)物 以及高分子量的化合物和離子型物質(zhì) 例如 蛋白 核酸 氨基酸 多糖類 植物色素 類酯化合物 藥物 動(dòng)植物的代謝產(chǎn)物等 經(jīng)典l c 是在直徑約10 2 0 m mi d 的玻璃柱內(nèi) 裝填直徑大于10 0 m 的多 孔性吸附劑完成的 速度慢 效率低 靈敏度低 六十年代早期 g i d d i n g s 將 g c 理論用于l c 同時(shí)直徑從幾個(gè)到幾十微米的規(guī)則的高效液相色譜 h p l c 填 料出現(xiàn) 減少了分離過(guò)程的傳質(zhì)阻力 使分離效率和速度都大大提高 h p l c 興起的同時(shí) 少數(shù)研究工作者便開(kāi)始了微柱h p l c 的探索 19 6 6 年 l i p s a y 0 1 等首次使用0 5 m m 1 0 r a mi d l m 的不銹鋼柱 對(duì)核糖核酸進(jìn)行了 分離 7 0 年代中期 is h i i 1 2 5 1 等開(kāi)展了許多以勻漿法裝填t e l l o n 微柱的研究 使微柱h p l c 方法得以重大突破 s c o t t 圳等以i 0 m mi d 的微柱對(duì)實(shí)際樣品 實(shí)現(xiàn)了快速 高效的分離 隨后直徑小于l m m 的毛細(xì)管h p l c 也相繼得以應(yīng)用 293 1j h p l c 微分離方法按柱類型分 可分為開(kāi)管柱 拉制柱和填充柱1 3 2 33 1 見(jiàn)表 1 一l 表1 i 微柱h p l c 分類 類型 柱內(nèi)徑 填充柱 微h p l c 毛細(xì)管h p l c 納級(jí)h p l c 拉制h p l c 柱 開(kāi)管i i p l c 柱 05 1o m m 10 0 5 0 0 u m l0 10 0 p m 5 0 20 0 u i n 5 1o p m 6 蘭苧查蘭竺主竺堡竺苧 一一 從理論上來(lái)看 與常規(guī)h p l c 填充柱相比 開(kāi)管柱由于在管壁上涂漬固定 相而使組分在流動(dòng)相間的傳質(zhì)阻力大為減小 因此單位時(shí)問(wèn)內(nèi)能得到更高的理 論塔板數(shù) 在操作中應(yīng)盡量減小柱內(nèi)徑 降低柱外效應(yīng) 拉制柱是一種介于開(kāi)管柱與填充柱之間的一種柱類型 由于它事先將填料 顆粒裝八玻璃管內(nèi) 而后再拉制成所需尺寸的毛細(xì)管 因此柱制備過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn) 單 但柱內(nèi)壁不均勻 重現(xiàn)性較差 填充柱是使用最廣的一種h p l c 微分離柱 多采用熔融石英毛細(xì)管作為柱 材料 其優(yōu)越性主要體現(xiàn)在 3 6 1 1 樣品 流動(dòng)相 固定相消耗少 對(duì)于較為難得的試樣極為有利 2 降低溶質(zhì)柱上稀釋比 提高檢測(cè)靈敏度高 3 可裝填長(zhǎng)柱以獲得較高的分離效率 4 易于選擇合適的操作條件 5 便于與其他分離模式和檢測(cè)技術(shù)聯(lián)用 h p l c 微填充柱的制備方法與常規(guī)h p l c 柱基本相同 多采用勻漿法 以高 壓或電泳力實(shí)施裝填 隨著h p l c 柱內(nèi)徑的縮小 與之相匹配的h p l c 小型 化儀器裝置也得以發(fā)展 h p l c 微泵可控制5 0 9 m 至10 0 mi d h p l c 柱所要求 的n l 到u l m i n 的流量 內(nèi)置式可替換i o o p 體積可降至2 0n l 各種自動(dòng) 微進(jìn)樣閥也得以發(fā)展m 1 示差 紫外 熒光 電化學(xué) 氣相色譜檢測(cè)器 傅立 葉變換等多種檢測(cè)手段都被用于h p l c 微柱的檢測(cè) 此外 h p l c 微柱還特別適宜于作為第一維 與其它色譜分離技術(shù)聯(lián)用 例 如 薄層色譜 t l c 常規(guī)h p l c g c 超臨界流體色譜 s f c c e 等 峰容量 的大幅度提高為復(fù)雜樣品的分離分析提供了可能 h p l c 與質(zhì)譜 m s 聯(lián)用是蛋白 多肽定量 定性分析最常用的方法 使 用微柱h p l c 不僅提高了分離效率 而且減少了與m s 聯(lián)用時(shí)的樣品稀釋 這 樣便可以提高濃度型檢測(cè)器電噴霧離子源質(zhì)譜 e s i m s 的靈敏度 表1 2 顯 示了常規(guī)l c m s 毛細(xì)管l c m s 納級(jí)l c m s 技術(shù)的比較 從表中可以看出 使 用75 m i d 的納級(jí)l c 質(zhì)譜的靈敏度與常規(guī)的l c m s 相比 可以提高2 8 4 4 倍 e n z e l 等報(bào)道了將二維凝膠電泳上的蛋白斑點(diǎn)酶解 以微柱h p l c m s 聯(lián) 用技術(shù)分析多肽片段 圖1 一1 結(jié)合基體輔助熒光解析離子化 m a l d i 一m s 7 復(fù)蘭查蘭竺主蘭竺蘭查 一一 一一 便可完成對(duì)蛋白的識(shí)別和序列測(cè)定任務(wù) 3 除了蛋白 多肽以外 微柱h p l c 還以其靈敏 高效 而在手性分離 神 經(jīng)科學(xué) 石油化工等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用 t a b l e l 一2c o m p ar is o no fn a n o f l o w c a p i l l a f y a n d c o n v e n t i o n a l e sl c m sb yi n j e 6 i o o f h d g m p f b p a d g ei n v i tr or c a c t i 0 1 21 4 ix t u r e lc l e f s s y s t e m n l 3 r c p o n m sr es p o n sef n g 0132 8 4 4 竺 竺 竺 型竺 一 j 三l 一 辭 一 空 窖 三 三 耋 i e r s c i n n n 一n f i g 1 1 t o t a ii o i lc ur r e n tc h r o m a t o g r a mo b t a i n e df r o mo l l l i n ec a p i l i a r yl c e s i m s a l i a ly s iso fa l li 1 3s i t ud i g e s to fa p r o t e i l ls p o t f r o mat w o d i m e n s i o f l a i g e 8 蘭蘭查蘭竺主蘭苧蘭查 一 一 一一一 2 3 毛細(xì)管電泳 毛細(xì)管電泳 c e 的出現(xiàn) 是現(xiàn)代分離技術(shù)的一次重大變革 電泳作為劃 時(shí)代意義的突破性進(jìn)展是在1 98 1 年 j o r g e n s o n 和l u k a c s 1 用7 5 i j m i d 石 英毛細(xì)管在3 0 k v 高電壓下開(kāi)管電泳 獲得了4 0 萬(wàn)理論塔板數(shù)的效率 并實(shí) 現(xiàn)了正負(fù)離子的同時(shí)分離 c g 可以采用很高的電場(chǎng) 如1 0 0 一10 0 0 伏 厘米 毛 細(xì)管很大的表面積 體積比使產(chǎn)生的熱量有效地?cái)U(kuò)散 克服經(jīng)典電泳的5 9 y 這 些研究奠定了高效 快速毛細(xì)管電泳的基礎(chǔ) 19 8 4 年t e r a b e 6 1 用含十二烷基 硫酸鈉 s d s 的膠束溶液分離了中性分子 開(kāi)辟了c e 的又一重要分支 即膠 柬電動(dòng)毛細(xì)管色譜 m e k c 1 98 7 年h j e r t e n 47 提出了毛細(xì)管等電聚焦 c l e f j 同年 c o h e n 和k a r g e r a s i 發(fā)表了毛細(xì)管凝膠電泳工作 c g e 至此 c e 的幾 種主要分離模式已經(jīng)形成 短短十幾年內(nèi) 由于c e 符合了以生物工程為代表的 生命科學(xué)各領(lǐng)域中對(duì)多肽 蛋白 核苷酸乃至脫氧核苷酸 d n a 分離分析的要 求而得到迅速發(fā)展 c e 的主要優(yōu)點(diǎn)在于1 4 9 1 1 儀器簡(jiǎn)單 便于自動(dòng)化 2 分離模式多樣 化 3 分離效率高 速度快 c e 電滲流的平面塞式流型對(duì)譜帶展寬貢獻(xiàn)很小 使得高柱效的取得有了可能 而高電壓的施加 又使得分析時(shí)間大大縮短 4 j 應(yīng) 用范圍廣 可以分離從離子到中性分子 從小分子到生物大分子的一系列化合 物 現(xiàn)已證明它能用于分離多種化合物 諸如氨基酸 手性藥物 維生素 殺 蟲(chóng)劑 無(wú)機(jī)離子 有機(jī)酸 染料 藥物活性成分 肽和蛋白質(zhì) 糖類 低聚核 苷酸和i i n a 限制性內(nèi)切片段 甚至整個(gè)細(xì)胞和病毒顆粒 5 分析成本低 柱 體積只有幾個(gè)微升 6 樣品 肖耗少 一般樣品進(jìn)樣量都是n g n l 級(jí)的 7 樣 品預(yù)處理簡(jiǎn)單 可以直接進(jìn)樣 毛細(xì)管電色譜 c e c 是c e 的一個(gè)分支 這種以電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)的微柱h p l c 把c e 的高效 理論塔板數(shù)高于5 05 y 米 和t t p l c 的選擇性 大量可供選擇的固定相 有機(jī)結(jié)合 開(kāi)辟了高效微分離的新途徑 p r e t r i o u s l5 0 1 首次示范了c e c k n o x 1 完善了其理論基礎(chǔ) 隨后c e c 也被越來(lái)越多的人所接受 目前 已通過(guò)c e c 實(shí) 現(xiàn)與m s 聯(lián)用 富集樣品 手性分離 此外 它還在免疫學(xué) 藥物分析 富勒烯 化學(xué)等眾多領(lǐng)域發(fā)揮著作用 一 墨蘭查蘭竺主蘭竺蘭苧 一 毛細(xì)管超臨界流體色譜 c s f c 是介于c g c 與微柱h p l c 之間的一種現(xiàn)代 微分離技術(shù) 19 8 1 年 n o v o r n y 和l e e m l 首先報(bào)道了使用具有高分離效能的毛 細(xì)管柱 以超過(guò)其臨界壓力 臨界溫度的流體作為固定相的c s f c 技術(shù) 它在石 油 環(huán)保 醫(yī)藥 生物 聚合物等領(lǐng)域具有廣泛的用途 2 4 微芯片分離 微分離技術(shù)的又一個(gè)研究熱點(diǎn)便是微芯片分離技術(shù) 它將常規(guī)微分離技術(shù) 移植到平方厘米量級(jí)大小的芯片上 示例如表3 所示 3 1 如果再與樣品進(jìn)樣 反應(yīng) 檢測(cè)等過(guò)程集成到一起 便成為多功能化的快速 高效 低耗 微型的 集成分析裝置 即 一t a s m i n i a t u r i z e dt o t a l c h e m i c a l a n a i y s i s s y s t g i l l 由于其體積小 輕便 故實(shí)驗(yàn)過(guò)程不必局限于實(shí)驗(yàn)室 對(duì)需要實(shí)地采樣 分析 在線檢測(cè)等特殊0 7 作都提供了極大的便利 t a b e 1 3 c a i c u l a t e dp a r a m e t e rs e t sf o rag i v e ns e p ar a t i o np e r f o r m a n c eo b t a i n e dw i t h c e l ca n ds f c p a t a m e t e rc e l cs f c m i c e l lar n u m b e ro f th e or e t i c a l p la t e sn10 0 0 0 0 10 0 0 0 010 0 0 0 0 a n a j y s js t j m ct 皿7 5 1ii m i i i l e a tin gp o w e r p z w m j1i c a p i i l ar y i n n e rd ia m e t e r d m 2 428 69 c a p i2 j ar yje n g t h c m 65s i 20 7r essdr o p a p a tn i 一2 6 14 v 0 1 f a g e k v 58 一 p e a k c a p a c it y n l802 20 2 2o s j g n a b a n d w id t h 6 r a m 02 105 6 14 s i g n a lb a n d w id t h6 i n s 4 2 7 070 s i g n a lb a n d w i d th d p 1 9 433 5 2 一 一 0 復(fù)旦大掌碩士掌1 立 x 實(shí)驗(yàn)裝置的微型化得到了儀器加工的支持 8 0 年代興起的光刻蝕微型制造 技術(shù)被成功地用于微分離芯片的加工上 隨后其材料也從硅片擴(kuò)展至石英 玻 璃等 一t a s 裝置形式多樣 其中以集成毛細(xì)管電泳芯片u c e 技術(shù)最為突出 f u r i 等就通過(guò)柱后衍生化分離氨基酸 理論塔板數(shù)達(dá)8 3 o o o 保留時(shí)間在 0 6 51 7s 峰寬約9 0 a l s m l 同時(shí) i c e 在疾病診療 藥物篩選 手性拆分等方 面都取得了很好的效果 并使分析速度大大提高 樣品和溶劑用量消耗減少 檢測(cè)效率也得以提高 h p l c 由于存在著塞子制作 柱裝填等問(wèn)題 而對(duì)微分離芯片提出了較高的 技術(shù)要求 有報(bào)導(dǎo)使用生物膜 1 聚合物 來(lái)實(shí)現(xiàn)納級(jí)柱制備 f e g n l e r 等 最新運(yùn)用微制造技術(shù)同時(shí)完成固定相顆粒和傳質(zhì)孔道的定位 在c e c 分離中 非保留溶質(zhì)柱效達(dá)l 70 0 0 0 0 保留溶質(zhì)達(dá)到7 7 0 0 0 0 3 多維分離技術(shù)研究進(jìn)展 3 1 多維分離技術(shù)簡(jiǎn)介 隨著對(duì)復(fù)雜體系中多組分及痕量組分分析的需要 高分辨便成了對(duì)色譜分 離體系最為迫切的要求 對(duì)于單一的色譜模式 可以通過(guò)改變塔板數(shù) n 選 擇性 d 和容量因子 來(lái)提高分辨率 但是 對(duì)分辨率的影響極為有 限 選擇不同的分離模式雖然可以獲得很高的理論塔板數(shù) 但分辨率并不會(huì)相 應(yīng)得到大副度的提高 增加柱長(zhǎng)由于增加分析時(shí)間 使分辨率的凈增加近乎為 零 相比之下 選擇性因?yàn)閷?duì)分辨率影響最大 而受到越來(lái)越多的關(guān)注 j 為描述色譜分離技術(shù)對(duì)復(fù)雜物質(zhì)中多組分的分離情況 19 6 7 年g i d d i n g s 首次提出了峰容量 n 的概念 1 它被定義為在滿足分離需要的分辨率條件 下及一定的分離范圍內(nèi) 所能容納的最多的峰的個(gè)數(shù) 計(jì)算公式如下 n 1 n 2 r l n 14 七 其中r 為峰寬相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)方差 通常取4 厄 為一系列峰中最后一個(gè)峰 的容量因子 墨呈查蘭竺圭蘭蘭蘭查 現(xiàn)代高分辨色譜分離技術(shù)的峰容量大致在1 o o3 0 0 范圍內(nèi) 如果待測(cè)物 質(zhì)的組分?jǐn)?shù) m 小于色譜分離體系的峰容量 n 則單一的分離模式應(yīng)該可以 滿足分析的需要 但由于復(fù)雜樣品的多組分并未均勻分布 根據(jù)理論推導(dǎo) 其最多可識(shí)別的峰個(gè)數(shù)只等于峰容量的3 7 代表單一組分的峰個(gè)數(shù)也只等于 峰容量的18 結(jié)果表明 一維色譜分離技術(shù)在對(duì)復(fù)雜物質(zhì)的分離中已有所局 限 而將多種基于不同機(jī)理的色譜模式聯(lián)用便成了最佳的選擇 多維分離體系可通過(guò)兩種方式實(shí)現(xiàn) 一種是立體方式 即前一維分離之后 又在與之成9 0o 的方向進(jìn)行后一維分離 比如二維薄層色譜m 二維電泳 另一種便是多柱方式 離線多柱分離 是人工地將前一維的流出紐分收集并送 入下一維進(jìn)行分離 盡管其分離效能優(yōu)于一維分離 但其難以自動(dòng)化 樣品轉(zhuǎn) 移損失量大 且后一維的轉(zhuǎn)移會(huì)損失前一維的分辨率 在線 或聯(lián)合 多柱分 離 是將一維的流出物按照一定的頻率實(shí)時(shí)地切換八第二維進(jìn)行分析 因其自 動(dòng)化程度高 避免了樣品轉(zhuǎn)移損失 而且在多維轉(zhuǎn)移中保留了前一維的分離度 而成為多維分離研究的主要方向 若每一維的分離機(jī)理完全不同 即正交 別系統(tǒng)可獲得最大的峰容量胛 兀 5 9 1 將相匹配的分離模式聯(lián)用 由于 峰容量的大幅度提高 將使二維體系具有了更強(qiáng)的分離能力 也可以降低對(duì)一 維分離峰容量的要求 常見(jiàn)的聯(lián)用模式有g(shù) c g c l c l c l c g c s f c g c s f c s f c l c s f c l c c e 等 其中應(yīng)用最為廣泛的g c g c 雖然可以獲得極高的理論峰容量 但其主要 適用于易揮發(fā)性物質(zhì)的分離 多維l c 技術(shù)自7 0 年代開(kāi)始使用以來(lái) 訓(xùn) 已在 生物醫(yī)學(xué) 7 1 1 醫(yī)藥學(xué) 1 毒物學(xué) 等方面得到應(yīng)用 接口多采用切換閥技術(shù) 聯(lián)用模式有分子排阻色譜 s e c 一反相色譜 r p l c 離子交換色譜 i e c 一反相色 譜 正相色譜 反相色譜 分子排阻色譜一離子交換色譜 親和色譜一反相色譜等 丸十年代以后j o r g e n s o n 等 2 1 開(kāi)始了l c c e 聯(lián)用技術(shù)的探索 為生物樣品 天 然產(chǎn)物等復(fù)雜體系的分離分析開(kāi)辟了新的方向 3 2 i t p l c c e 聯(lián)合二維分離 t t p l c c e 是分離機(jī)理完全正交的兩種模式 前者是基于各紐分在流動(dòng)相與 一 蘭呈查蘭竺主蘭竺竺苧 一 一 固定相之間分配的差異 而后者則是基于各組分荷質(zhì)比的不同 因此 將這兩 種高分辨的色譜技術(shù)聯(lián)用 為峰容量的大幅度提高提供了可能 此外 c e 以其 快速 高效的特性 特別適用于作為二維體系中的第二維 可以頻繁地切割第 一維的流出物并加以分析 而不損失前一維分離的效率和分離度 y a m a n t o 等首先進(jìn)行了蛋白質(zhì)的凝膠滲透色譜一毛細(xì)管等速電泳二維分析 i 1 9 9 0 年 j o r g e n s o n 等 利用六通閥 圖卜2 將反相液相色譜與毛細(xì)管 區(qū)帶電泳 c z e 聯(lián)用 完全實(shí)現(xiàn)了從第一維流出物至第二維分析的切換進(jìn)樣自 動(dòng)化 并對(duì)卵白元的酶解產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)了高效二維分離 1 9 93 年 又利用改進(jìn)的接 口技術(shù)將微柱s e c c z b 聯(lián)用 實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)二維分離 l9 95 年 他們利用光 門(mén)閥接口 圖1 3 實(shí)現(xiàn)了快速r p l c c z e 分離 它利用照射于c z e 進(jìn)樣端的 強(qiáng)激光束對(duì)第一維流出物的光降解作用來(lái)實(shí)現(xiàn)二維接口的切換 并將c z e 分析 時(shí)間縮短至3 s 二維分離在1 0 m i n 內(nèi)得以完成 19 9 7 年 又以流動(dòng)閥接口 圖 1 4 實(shí)現(xiàn)了微柱r p l c c z e 聯(lián)用 以緩沖液的流動(dòng)和停止來(lái)控制c z e 的進(jìn)樣與 分析 利用此裝置在人尿樣中分離出4 0 0 余種紐分 圖1 5 f i g u r e1 2 t w oc o n f i g u r a t i o n so fs i x p o r t c o m p u t e r c o n t r o l1 e dv a l v e c l o s eu 口o f i n t e r f a c ef f ig u r e1 3 t w o d ir a e n s i o n a ir p l c f a s 卜c z ei i s tr u m e n t a l d i a g r a m 復(fù)旦大學(xué)碩士掌位論文 t n i s5 t e e 一 k 陟 f ig u r e1 4s c h e m a t i co ft h ec l e a rf l o wg a l i n g i n t e r f a c e f i g 1 5 g t a ys c a l ei m a g eo fa t w o d i m e n s i n n a lm i c r 0 一r p l c c z e s e p ar a t j o no f f i t c t a g g e dh u m a n1 3 i f i e 4 o l m m 復(fù)旦大掌碩士掌位論文 多維分離的小型化是必然的趨勢(shì) n o r o tr o y 等指出 微柱h p l c 由于其高 選擇性 高柱效 在蛋白質(zhì)樣品的分離 特別是微分離方面將顯示獨(dú)具的優(yōu)越 性n 0 1 將其與c e 聯(lián)用 也能盡可能地減少樣品轉(zhuǎn)移損失 1 j o r g e n s o n 等已 成功地實(shí)現(xiàn)了微柱h p l c c z e 的在線聯(lián)用 4 本論文研究背景 為滿足生物大分子 天然化合物等復(fù)雜體系極高的分離要求 需發(fā)展高效 微分離方法 特別是多維微分離技術(shù) 本論丈全面探討了建立毛細(xì)管高效液相 色譜一毛細(xì)管電泳二維分離系統(tǒng)方法學(xué)的研究及相關(guān)的柱制備技術(shù) 快速膠來(lái)電 動(dòng)色譜理論等問(wèn)題 并將這些新方法應(yīng)用于中藥 蛋白 核酸等實(shí)際樣品中的 分析 證明了其超強(qiáng)的分離能力和潛在的應(yīng)用價(jià)值 復(fù)蘭查蘭璺圭蘭蘭蘭苧 一 一 一 5 參考文獻(xiàn) 1 1 師治賢 王俊德 生彩大分于的寢徊笆學(xué)分離和別務(wù) 科學(xué)出版社 2 3 4 19 9 3 6 5 5 6 魏偉 王叉明 羅國(guó)安 劣尹筍扳 k e n n e d y r t j o r g e n s o n j w h er n a n d e z l t u c c i s g u z m a n 3 93 n o v o t n y m a r i a i g id d i n gs j c 1 997 3 2 4 76 a n a c h e m 1 9 8 9 6 1 4 3 6 n p a e z x c h r o m a t o g r 竹鯽 19 88 6 0 5 o o a a n a l c t l e m 19 8 4 56 1258 a 7 c or t e s lj r o t h m a n d c h r o m at o g r a p h 兒m a r c e l d e k k e r c o r t e sh j e d i t o t 艦 t i d i m e n s i o n a n e wy or k 19 90 2 19 劉照勝 李永民 蔣生祥 陳之仁 芭學(xué) 1 9 97 4 9 0 b u s h e y m m j o r g e n s o n j w a r i a t h e m 19 9 0 6 2 9 78 l e m m o a v j o r g e n s o n j w j r c h r o m a l o g r i9 93 633 2 13 m o o r e a w j o r g e n s o n j w a r i a c h e m i9 9 5 67 3 4 4 8 h o o k e t f j o r g e n s o n j w a r i a c h e m 1 9 9 7 6 9 4 1 3 4 g 0 1 a y m j e g a sc h r o m a t o g r a p h y a c a d e m i cp r e s8 n e wy or k 14 g o la y m j e g a sc h r o m a t o g r a p h y a c a d e m l cp r e ss s e wy o r k 195 8 3 6 15 16 17 i 8 19 2 0 3 9 1 4 2 2 n o v o t n y m h a l a s z i s c h i e k e j d a n d e n e a n c h r o m a o g r a p h i a 19 6 8 1 3 3 2 a r i a e l i9 63 3 5 4 4 9 d c h r o m a t o g r 1 9 75 112 97 r u 班i c c c 19 7 9 2 3 5 史堅(jiān) 明代在芭孝分彬 上海科學(xué)技術(shù)丈獻(xiàn)出版社 1 98 8 2 9 1 h o r e a t h c g p r ess b a l i p s k y s r a n a c h 6 196 7 2 1 is h i i d h s a i k h ib i k j o n o k n c h i w n a g a a m 6 復(fù)旦大學(xué)碩士掌位論x 一 一 r o m 8 f o g r 1 9 7 1 14 4 l57 2 2 is h i i d h i b i k a sa i k j o n o k u c h i t j c b r o m a t o g f 1 9 78 l52 14 7 23 is h ii d h i b i k a s a i k n a g a g a m c h r o m a l o g r 1978 152 3 4 1 c 24 is h i i d h i b i k a s a i k n a g a y a m m o c h iz n k e k c h r o m a o g r 19 7 8 1 5 2 173 25 is h i i d h ir o s e a h l b i k 1 w a sa k i y c h r o m a t o g r 97 8152 43 r s e s e c e s c o t t r p w c h r o m a t o 占 s c i 19 80 18 47 9 s c o t t r p w c h r o m a t o g r s c i 19 80 18 49 k u c e r e p c h f o m a t o g r 19 8 0 19 8 93 y a n g f j c h e m 1 9 8 2 2 3 6 2 6 5 t a k e u c h i t is h i i d c h r o a t o g r 19 8 1 2 13 2 5 t s u d a t n o v o t n y m a r i a c h e m 197 8 5 0 63 2 is h i i d t a k e n c h i t t r e n d s i n a r i a c h e m 1 9 9 0 9 1 52 v iss e rs j p c c l a e ss e n s h a c r f i n e rs c a c h r o 口a t o g r 19 9 7 7 7 9 1 3 4 kr e j c m y e s ari k k r u s e d m p a j ur e k j c h r o m a o g f 198 1 2 18 167 m c g u f f i n n