（發(fā)酵工程專業(yè)論文）微生物乳糖酶的固定化及應(yīng)用研究.pdf

摘要 乳糖酶能催化乳糖進(jìn)行水解反應(yīng)和轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)。低濃度下，乳糖水解生成葡萄糖和 半乳糖；高濃度下則發(fā)生轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)生成低聚半乳糖。因此，乳糖酶可用于制備低乳糖 牛奶和低聚半乳糖。低乳糖牛奶，對(duì)于滿足乳糖不耐癥患者的乳品消費(fèi)需求、促進(jìn)我國 乳品工業(yè)的發(fā)展意義重大；低聚半乳糖是一種新型食品添加劑，具有良好的生理保健功 能，市場廣闊。 與游離酶相比，固定化酶將酶封閉在一定空問內(nèi)，實(shí)現(xiàn)了催化劑的回收和反復(fù)利用。 固定化酶在節(jié)約能源資源、降低成本、保護(hù)環(huán)境、生產(chǎn)自動(dòng)化、連續(xù)化等許多方面都十 分有利。 本文重點(diǎn)研究了一種微生物胞外乳糖酶的固定化方法。用中國農(nóng)科院重組畢赤酵母 發(fā)酵得到的微生物胞外乳糖酶，采用吸附一包埋一交聯(lián)相結(jié)合的方法固定化，實(shí)現(xiàn)了乳糖 酶的多次反復(fù)利用，并對(duì)固定化過程進(jìn)行了優(yōu)化。在對(duì)固定化酶和游離酶進(jìn)行性質(zhì)比較 后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過固定化，乳糖酶性質(zhì)發(fā)生了較大的變化：固定化乳糖酶最適溫度比游離乳 糖酶顯著降低，游離乳糖酶的最適溫度6 5 ，而固定化后降至3 5 ：固定化后的最適 p h 變化不大，相比略偏酸性，最適p h2 5 ( 游離乳糖酶最適p h3 5 ) ，在p h2 5 6 范圍內(nèi) 保持相對(duì)活力8 0 以上( 游離酶p h3 6 范圍內(nèi)保持相對(duì)活力8 0 以上) ；固定化后與游離 酶比較，動(dòng)力學(xué)常數(shù)也有顯著變化，和a x 分別為0 7 1 4m o l 幾，6 2 6 5 6 “m o l m i n - m l 和o 2 6 7m o l l ，6 6 6 6 7 “m o l m i n m l 。 本文還研究了固定化乳糖酶水解5 乳糖溶液、制備低乳糖牛奶和低聚半乳糖的操 作穩(wěn)定性。 以5 乳糖溶液為底物，分批反應(yīng)中，固定化酶連續(xù)反應(yīng)5 2 批，乳糖水解率保持在 7 5 ；填充床反應(yīng)器中，在0 5h 。的稀釋速率下，固定化酶連續(xù)反應(yīng)6 2 天，乳糖水解 率保持在8 0 ，操作半衰期為1 3 6 天。 用固定化乳糖酶水解牛奶中的乳糖制備低乳糖牛奶，稀釋速率控制在o 6 7 h ，乳糖 水解率達(dá)到7 0 以上。以0 6 7h 1 的稀釋速率連續(xù)反應(yīng)3 0 天，剩余乳糖含量始終低于 1 5g l 。 用固定化乳糖酶水解乳糖溶液制備低聚半乳糖。以分批反應(yīng)方式進(jìn)行條件優(yōu)化，最 佳條件為溫度3 5 ，p h6 5 7 o ，乳糖濃度4 0 。低聚半乳糖的最大濃度達(dá)到1 6 0g l 。 固定化酶連續(xù)反應(yīng)7 批依然有良好的穩(wěn)定性。填充床反應(yīng)器中，研究了稀釋速率對(duì)低聚 半乳糖形成的影響。稀釋速率o 5h 。1 時(shí)，低聚半乳糖生成量最大，為1 4 8g l ；稀釋速 率o 7 8h 。1 時(shí)，低聚半乳糖生產(chǎn)強(qiáng)度最大，達(dá)到8 7 11 l _ h 。以0 5h 。1 的稀釋速率連續(xù) 反應(yīng)2 0 天，低聚半乳糖得率平均為3 2 2 0 。 采用活性炭吸附一乙醇溶液洗脫的方法提取低聚半乳糖。所得樣品中，低聚半乳糖 含量9 0 以上。整個(gè)提取過程，低聚半乳糖幾乎沒有損失。 關(guān)鍵詞：乳糖酶；固定化；低乳糖牛奶：低聚半乳糖；填充床反應(yīng)器 a b s t r a c t l a c t o s ew a sc a t a l y z e db yl a c t a s et op e 喲n nh y d r o l y s i sr e a c t i o na n dt r a n s g l a c t o s y l a c t i o n r e a c t i o n i tw a sh y d m l y z e dt of o m lg l u c o s ea j l dg a l a c t o s ea tl o wc o n c e n 仃a t i o na i l dt of b r n l g a l a c t o o l i g o s a c c h 撕d e s i n t r a n s g l a c t o s y l a t i o nr e a c t i o na th i 曲c o n c e n t m t i o n s o ， l a c t a s e c o u l db e a p p l i e d i nt h ep r e p a r a t i o no fl o w 一1 a c t o s em i l ka 1 1 d g a l a c t o o l i g o s a c c h a r i d e s l o w l a c t o s em i l kp l a y e da n i m p o r t a n tm l e i n s a t i s 毋i n gf e a t n e e dt o d a i r yf 而m l a c t o s e i n t o l e r a n c ea n d e n h a n c i n g t h e d e v e l o p m e n t o f d a i r yi n d u s t r y i nc h i n a g a l a c t o o l i g o s a c c h a r i d e sv ，a sak i n do fn e wf o o da d d i t i v ew i t hg o o dh e a l t l lb e n e f i t s i th a d l a r g ec o n s u m p t i o nm a r k e t f m mt h e s ev i e w s ，l a c t a s ew a st h ek e y - e n z y m ew a sr e s t r i c t e dt oc e r t a i nr o o mi ni i i l i n o b i l i z e de n z ”n ec o m p a r e dw i t ht h e 丘e e e n z y m e t h ec a t a l y s tc o u l db ec a l lb a c k e da n dr e c y c l e d i tt o o kg r e a ta d v a n t a g e si nr e s o u r c e a 1 1 d e n e 唱y s o u r c e se c o n o m i z e d ，c o s te c o n o m i z e d ，e n v i r o n r n e n t p r o t e c t e d ，p r o d u c t i o n a u t o m a t i s e da n dc o n t i n u e d am e t h o dt op r e p a r et h ei m m o b i l i z e dl a c t a s ew a ss t u d i e di nt h ed i s s e n a t i o n t h el a c t a s e w a sa ne x t r a c e l l u l a rp r o d u c ts e c r e t e db yj d f c 向曲p 鯽向，西c o n s n u c t e db yc h i n e s ea c a d e m yo f a g r i c u l t u r a l s c i e n c e t h ei m m o b i l i z a t i o nm e t h o dw a sac o m b i n a t i o no f a b s o r p t i o n e n t r a p c r o s s l i n ka n dt l l et a r g e t t or e u s eo ft h ee n z y m ew a sa c h i e v e d t h e i m m o b i l i z a 石o np r o c e s sw a so p t i m i z e d a n e rt h ep r o p e r t i e so ft h ei m m o b i l i z e da n df k e l a c t a s ew e r ec o m p a r e d ，s i g n 簡c a n tc h a n g e sw e r eo b s e r v e d i n 血er e s p e c to ft h eo p t i m u m t e m p e r a t l l r e ，t | l ef r e ee n 巧m ew a s6 5 w 1 1 i l et h ei m m o b i l i z e de n z y m ed e c r e a s e dm a r k e d i yt o 3 5 i nt h er e s p e c to fo p t i m u mp h ，t h ei m m o b i l i z e de n z y m ew a sp h2 5 ，al i m el o w e rt h a n t h a to ft h ef r e ee n z y m e ( p h3 5 ) t h ei m m o b i l i z e da j l df b el a c t a s es h o w e d8 0 o rh i 曲e r a c t i v 時(shí)d u r i n gt h er a n g eo fp h2 5 6 0a 1 1 dp h3 o 一6 0 ，r e s p e c t i v e l y t h ek i n e t i cc o n s t a n t s a l s oc h a i l g e dm u c h f o rm ei m m o b i l i z e da n d 缸el a c t a s e ，缸w e r eo 7 1 4m o l l ， 6 2 6 5 6p m o l m i n m la n d0 2 6 7m 0 1 l ，6 6 6 6 7 “m o l m i n m l t h eo p e m t i o n a ls t a b i l i t yo ft h ei m m o b i l i z e dl a c t a s ew a ss t u d i e di nt 1 1 ep a p e ri nr e s p e c to f l a c t o s eh y d r o l y s i s ，l o w l a c t o s em i l ka j l dg a l a c t o o l i g o s a c c h 捌d e s ( g 0 s ) p r 印a m t i o n w i m5 l a c t o s ew a t e rs o l u t i o na ss u b s 廿a t e ，i a c t o s eh y d r o l y s i sm a i m a i n e dal e v e lo f 7 5 a r e r5 2c y c l e si nb a t c ho p e r a t i o n l a c t o s eh y d r o l y s i sk e p tal e v e lo f8 0 a f t e r6 2d c o n t i n u o u so p e r a t i o n i t so p e r a t i o n a lh a l f l i f 爸w a s1 3 6d l o w l a c t o s em i l kw a sp r e p a r e db yt 1 1 ei m m o b i l i z e dl a c t a s ei nt h ep a c k e d b e dr e a c t o r w h e nd i l u t i o nr a t ew a sc o n t r o l l e da to 5h ，l a c t o s eh y d m l y s i sa c h i e v e d7 0 i nt h e3 0d c o m i n u o u so p e r a t i o n ，t h er e s i d u a l l a c t o s eb e l o w15 lw a sm a i n 詛i n e d t h ei m m o b i l i z e dl a c t a s ew a sa p p l i e di ng o s p r o d u c t i o n t h ec o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e d i nb a t c ho p e r a t i o n t h e yw e r et h a tt h et e m p e r a t u r ew a sc o n t m l l e da t3 5 ，p h6 5 7 oa n dt h e l a c t o s ec o n c e n t r a t i o nw a s4 0 t h em a x i m u mv a l u eo fg o sw a sl6 0g ，l a r e r7r e c y c l e s ， t h ei m m o b i l i z e dl a c t a s es t i l ls h o w e dg o o do p e r a t i o n a ls t a b i l i t y e 舵c to fd i l u t i o nm t eo nt h e f b n _ n a t i o no fg o sw a ss t u d i e di nt h ep a c k e d b e dr e a c t o lw h e nd i l u t i o nr a t eg o t0 5h 一，t h e m a ) ( i m 啪v a l u eo fg 0 sc o n c e n t r a t i o n ( 1 4 8 l ) w a sa c h i e v e d w h e nd i l u t i o nr a t e g o t o 7 8h 一，t h em a x i m 啪v a l u eo fg o sp r o d u c t i v i t y ( 8 7 1l l h ) w a sa c h i e v e d i nt h e2 0d c o n t i n u o u so p e r a t i o n 諏t ht h ed i l u t i o nr a t eo f 0 5h ，t h ea v e r a g eg o s y i e l dw a s3 2 2 0 t be x t r a c tg o sf r o ms o l u t i o n ，am e t h o de m p l o y i n ga b s o f p t i o nw i t ha c t i v a t e dc a r b o n d e s o r p t i o nw i t ha l c o h o lw a su s e d g o sr e a c h e d9 0 i nt h es a m p l ea j l dn e a r l yn ol o s sw a s o b s e r v e dd u r i n ge x t r a c tp r o c e s s k e y w o r d s ：l a c t a s e ；i m m o b i l i z a t i o n ；l o w l a c t o s em i l k ；g a l a c t o o l i g o s a c c h a r i d e s ； d a c k e d b e dr e a c t o r i i i 獨(dú)創(chuàng)性聲明 本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工 作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地 方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含 本人為獲得江南大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。 與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明 確的說明并表示謝意。 簽名：孟遑= ! ；至日期：卵年6 月rz 日 關(guān)于論文使用授權(quán)的說明 本學(xué)位論文作者完全了解江南大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī) 定：江南大學(xué)有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和 磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編 入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、 匯編學(xué)位論文，并且本人電子文檔的內(nèi)容和紙質(zhì)論文的內(nèi)容相一致。 保密的學(xué)位論文在解密后也遵守此規(guī)定。 簽名：盆盔! 至 導(dǎo)師簽名： 日期：如6 年6 月卜日 第一章緒論 第一章緒論 1 1 乳糖酶概況 l - 1 1 乳糖 乳糖是所有哺乳動(dòng)物乳中主要碳水化合物。它是一種雙糖，系統(tǒng)命名為4 一b d 一半乳 糖苷一b d 一葡萄糖，水解后產(chǎn)生d 一葡萄糖和d 一半乳糖。 b d - 半乳糖* d 一葡萄糖 乳糖 1 1 2 乳糖酶 p 半乳糖苷酶( p d 一半乳糖苷半乳糖水解酶，e c 3 | 2 1 2 3 ) ，商品名為乳糖酶( 1 a c t a s e ) ， 不僅能催化水解半乳糖苷鍵，將乳糖水解成為半乳糖和葡萄糖，同時(shí)具有轉(zhuǎn)移半乳糖苷 的作用，可以生成低聚半乳糖。 1 1 2 1 乳糖酶的作用 解決乳糖不耐受癥患者食用乳制品的問題 鮮乳中有上百種化學(xué)成分，總?cè)楣腆w平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 3 o ，脂肪4 o ，蛋白質(zhì)3 4 ， 乳糖4 8 ，無機(jī)鹽o 8 ( 其中鈣0 1 1 ) ，含有幾乎所有的脂溶性和水溶性維生素，營養(yǎng) 價(jià)值十分豐富，有全價(jià)食品之譽(yù)。乳品符合當(dāng)前膳食結(jié)構(gòu)調(diào)整的需要，能顯著提高人們 的身體素質(zhì)，對(duì)兒童、孕婦、老人等特殊人群具有非常重要的意義1 2 j 。 乳糖在人類的腸腔中必須先經(jīng)過乳糖酶水解，才能被直接吸收。人體內(nèi)若缺乏乳糖 酶，乳糖就會(huì)保留在腸腔中，造成等滲性水滯留和結(jié)腸細(xì)菌酵解乳糖而產(chǎn)生多種氣體及 短鏈脂肪酸，從而發(fā)生腹脹、腸鳴、排氣增多、腹瀉和腹痛等癥狀，這就是所謂的乳糖 不耐受現(xiàn)象i jj 。 乳糖酶缺乏是正常現(xiàn)象，一般認(rèn)為與世代形成的飲食習(xí)慣不同所造成的遺傳基因突 變有關(guān)。乳糖酶缺乏者中有5 0 左右的人存在乳糖不耐受癥狀。乳糖酶缺乏發(fā)生率隨不 同國家、不同種族人群的變化而變化【3 j 。 中國預(yù)防醫(yī)學(xué)院與食品衛(wèi)生研究所調(diào)查發(fā)現(xiàn)，有色人種，尤其是東方人種乳糖不耐 受癥的人較多，3 5 歲時(shí)為2 2 1 ，7 8 歲時(shí)為3 9 ，1 1 1 3 歲時(shí)為3 6 8 ，成年人更多。我 國成年人飲用牛乳后乳糖吸收不良的發(fā)病率高達(dá)8 6 7 ，不耐受指數(shù)為0 9 【4 j 。 江南大學(xué)碩士學(xué)位論文 表1 一l 乳糖不耐受人群的分布 t a b l e l 一ld i s t r i b u t i o no f l a c t o s e i n t o i e r a n c ep e r s o n sa m o “gp e o p l e s 種族比率( ) 北歐 中歐人( 英國人、俄羅斯人) 地中海沿岸居民( 希臘人、猶太人) 火多數(shù)非洲人和美國黑人 本土美國人 墨西哥人 東方人 l 一5 l o 2 0 6 0 9 0 7 0 1 0 0 8 0 i o o 5 0 _ 8 0 8 0 1 0 0 乳糖酶缺乏引發(fā)的乳糖消化不良會(huì)產(chǎn)生許多不良后果。全脂牛奶中約3 0 的熱量和 脫脂牛奶中6 0 的熱量是由乳糖提供的，乳糖不耐癥患者無法充分利用這種能量：對(duì)于 不能吸收的乳糖，會(huì)被腸道微生物作為碳水化合物進(jìn)行發(fā)酵而產(chǎn)酸產(chǎn)氣，從而導(dǎo)致胃腸 失調(diào)【3 】。由于乳糖吸收不良，還會(huì)影響到對(duì)牛乳中礦物質(zhì)尤其是鈣的吸收，有乳糖吸收 障礙的人將會(huì)發(fā)生礦物質(zhì)和鈣質(zhì)丟失的癥狀，這與小兒拘樓病和成年人的骨質(zhì)疏松癥都 有關(guān)系【3 】。另外調(diào)查結(jié)果還顯示，乳糖酶缺乏患者比正常情況的人的骨胳結(jié)構(gòu)差i j j 。乳 糖吸收障礙不僅伴有牛奶利用率低、腹瀉等乳糖不耐的征兆，還伴有食欲下降，導(dǎo)致飲 食量減少【j j 。 工業(yè)生產(chǎn)中可利用乳糖酶制備低乳糖乳制品。在乳糖酶的作用下，乳糖被分解為半 乳糖和葡萄糖，單糖可被腸道吸收并進(jìn)入血液，解決乳糖不耐癥患者的乳品消費(fèi)問題。 乳糖的甜度較低，只有蔗糖的2 0 ，被乳糖酶水解后生成甜度接近于蔗糖的葡萄糖和半 乳糖，可明顯提高乳制品的甜度，并且不增加食品的熱量。一般當(dāng)牛奶中的乳糖水解度 為3 0 、6 0 和9 0 時(shí)相當(dāng)于向牛奶中加入質(zhì)量濃度為3 ，6 ，9g l 的蔗糖【5 j 。 改良乳制品 ( 1 ) 在濃縮乳及煉乳中的應(yīng)用 乳糖的溶解度較低，只有蔗糖的1 0 。3 ：1 冷凍部分濃縮乳是保存牛奶的風(fēng)味和品 質(zhì)的有效方法之一，牛乳濃縮時(shí)或制作冷凍乳制品時(shí)，乳糖容易結(jié)晶析出， 使產(chǎn)品中 有顆粒狀物質(zhì)，食用時(shí)口中有沙樣感，產(chǎn)品質(zhì)量因此而下降。使用低乳糖奶可以延長乳 糖的結(jié)晶和蛋白質(zhì)的聚集，從而降低產(chǎn)品的冷凍增稠1 5j 。 ( 2 ) 在發(fā)酵乳制品中的應(yīng)用 使用乳糖酶水解的牛乳制作酸乳比普通脫脂乳要省時(shí)和節(jié)省蔗糖的用量，而且可以 改善酸乳的風(fēng)味和口感，這是由于乳糖分解成葡萄糖和半乳糖后增加了酸乳的甜度，并 且乳酸菌可以直接利用葡萄糖和半乳糖，使產(chǎn)酸速度加快。在奶酪生產(chǎn)中采用水解程度 為5 0 的水解乳，酸形成較快且脫水收縮較好，凝乳破碎或細(xì)屑較少，干酪形成快而且 產(chǎn)量高5 1 。 第一章緒論 ( 3 ) 奶粉生產(chǎn)中的應(yīng)用 低乳糖乳噴霧干燥得到的奶粉口感好、風(fēng)味濃郁、沖調(diào)性好，而且還具有適用人群 廣、奶粉用途多等特點(diǎn)n ( 4 ) 乳清糖漿的制造及應(yīng)用 在乳清中，9 9 8 以上的碳水化合物為乳糖( 在牛乳中含量為4 5 左右) 。乳清主要 用于生產(chǎn)各種糖果、糕點(diǎn)及各種食品但是利用率不到5 0 ，余下乳清因b o d 高達(dá)4 5 0 0 衛(wèi)，l ，被作為污染物處理或做成附加值不高的產(chǎn)品1 5j 。 用乳糖酶水解乳清，使乳糖水解為半乳糖和葡萄糖，甜度達(dá)到蔗糖甜度的6 5 - 8 0 ， 溶解度增加3 4 倍，稱為乳清糖漿。乳清糖漿可代替卵蛋白和蔗糖，用于面包、月餅、 蛋糕、乳脂糖的加工，使產(chǎn)品風(fēng)味和外觀質(zhì)量大為改善。此外，還可用于制作乳清飲料、 乳清酒等。乳清糖漿再經(jīng)葡萄糖異構(gòu)酶將其中的葡萄糖異構(gòu)化生成果糖，則稱為半乳果 葡糖漿，其甜度與等濃度的蔗糖相當(dāng)，可代替蔗糖作甜味劑，用于各種點(diǎn)心、飲料、罐 頭食品以及冰激凌、雪糕的加工，效果很好【6 】。 生產(chǎn)低聚半乳糖 低聚半乳糖具有良好的保健功能：( 1 ) 雙歧桿菌增值因子及與其相關(guān)的生理功能， 例如促進(jìn)有機(jī)酸生成使腸道p h 下降抑制外源菌生長、生成大量短鏈脂肪酸、產(chǎn)生b 族維 生素等：( 2 ) 低甜度低熱量，難被人體消化，食用后基本上不增加血糖血脂，但有潤腸 通便作用；( 3 ) 低齲齒性，不被口腔酶液分解，不被引起齲齒的鏈球菌所利用；( 4 ) 改善 脂質(zhì)代謝，降低總血清膽固醇濃度，提高血清中高密度脂蛋白所占比例；( 5 ) 改善礦物 元素的吸收利用，促進(jìn)對(duì)鈣的吸收，同時(shí)使腸道對(duì)鈉的吸收有降低的傾向，而對(duì)鈣的吸 收有升高的傾向| 7 j 。 低聚半乳糖口感清爽，甜度約為蔗糖的2 5 ，具有優(yōu)良的對(duì)酸和熱穩(wěn)定性。加熱至 18 0 都不分解，在p h3 0 的條件下都能穩(wěn)定存在。這使得它可以廣泛地添加于加工溫度 較高的產(chǎn)品如培烤食品和酸性食品中。另外，低聚半乳糖不被面包酵母分解，可用于面 包制品中。尤其是對(duì)那些“乳糖不耐受癥”的乳制品消費(fèi)者，可通過將其中的乳糖轉(zhuǎn)變 為低聚半乳糖從而提高其營養(yǎng)效價(jià)【7 j 。 1 1 2 2 乳糖酶來源及其性質(zhì) 乳糖酶廣泛存在于植物，動(dòng)物，微生物中。微生物來源的乳糖酶數(shù)量大，制備容易， 酶活力高。 翌塑查蘭墮主蘭絲堡蘭 表l 一2 產(chǎn)乳糖酶的微生物【8 】 t a b l e l 一2m i c m o 喀a n i s m ss c r e e n i n gl a c t a s e 酵母 真菌 k l l o w e m m y c e sl n c t l sn e u r o s p 。r dc r o s s a k i u ”c m m y c e s 聲d g i l i sa s p e r g 扣e t i d u s c a n d i d np s c u d o l r o p i cn l i s a s d e r g m “sn g e r b r e h n n o m y i c e s o m o l “sa s p e 曙m m 丑“m m n g e dm b e r s t s i ia s p e r g i l i 0 7 弘d e 緦菌a s p e 嚕m mp h o e n i c i s e s c h e r i c h t dc o h m m o rp m i l l t s b 口c i j j 淞m p 2 0 l p r i “所塒k c d r 招 e f t h e r m t l sd q u d t i c t t s s c o p h | o r i o p s 訌 s 盹p i o c o c c 粥f h e r m o p h i l h s a n e m n r i 。p d l m i l d c t o b d c 1 l 粥b u l n f i c 淞 c h r v u l o r i ai n d e g h n 弧 l a c t o b q c i l l m sh e h e l i c f 1 l s 口i u mm o n i l i f o r m e b n c 謝u ss p a l t e r n n r i 0n l t e m a r e b o d l l m sc i m u z d n s b d c i l l ms l e o r o m e r m o p h n m l o c l o b n c m u ss p m g e n e s 乳糖酶的性質(zhì)隨來源不同存在差異 表l 一3 不同乳糖酶的性質(zhì)【8 】 t a b l e l - 3p r o p e r t i e so fd i f f e r e n t l a c t a s e 來源 最適p h最適溫度( ) 分子量( k d ) 爿印p ，g 甜，琊啦；p r 3 o - 4 o5 5 6 0 1 2 4 爿印e 增f ，mo ，) 2 口p 5 05 0 一5 5 2 0 1 k l l o w e m m y c e s 聲d g i i i s 6 6 朝、3 5 尉w v p r o m w p s 腸c m6 9 7 3 3 55 4 0 e s c h e r i c h hc o “ 124 0 5 3 0 ，d 6 口c f 脅p 卯 口w 6 2 - 7 15 5 5 7 c 加剛口凰 3 4 _ 4 33 0 一5 5 bc 口“如m6 o 6 0 一6 5 b a c i f 沁s 口 6 86 5 三p l 盯d ”n ，f 。cc f 們v d r 堋 6 5 6 0 o 口“h 面镕括 3 6 55 0 - 6 5 b s t e d m | h e r m o d h i t m 6 日6 a6 52 1 5 跏叫o c d c c 曲p r m 印 6 5 - 755 5 5 0 0 6 0 0 m ”d ，口w 講m 4 5 6 6 0 a i f e m d r 泌n t f e n 一n4 5 s 5 5 0 o 砌m 虎m 4 5 5 58 0 5 7 0 乳糖酶在乳品加工中的潛力在上世紀(jì)初即為人們所知。但直到5 0 年代，人們對(duì)乳糖 4 第一章緒論 不耐受癥的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)才逐漸被重視。6 0 年代，當(dāng)由微生物中提取的乳糖酶商業(yè)化生產(chǎn) 后，乳糖酶的應(yīng)用才得以推廣。 表l 一4 商品化乳糖酶1 9 l 1 h b l e l 4c o m m e r c i a l i a c t a s e 目前，商品化的乳糖酶主要來源于黑曲霉、米曲霉、克魯維乳酸酵母和克魯維脆壁 酵母等巾j 。 來源于乳酸克魯維酵母菌的乳糖酶 乳酸克魯維酵母菌乳糖酶適合于牛乳和甜乳清的加工處理，對(duì)酸性乳清需先調(diào)節(jié)d h 至中性。該酶4 仍具有一定活力，低溫下因腐敗菌生長緩慢，牛乳及乳清可在4 5 下 過夜加工不發(fā)生腐敗，這在工業(yè)應(yīng)用上尤為重要。 來源于黑曲酶的乳糖酶 由黑曲霉制備的乳糖酶適合于加工處理干酪和酸性乳清，在此條件下，大部分常見 腐敗細(xì)菌的生長可以受到抑制。由于酶分子量較小，且加工時(shí)不需要相關(guān)的金屬離子穩(wěn) 定與激活，用于食品加工更方便。 來源于米曲霉的乳糖酶 此酶適用于加工處理牛乳和酸乳。7 0 時(shí)熱處理，乳糖酶很快失活。 江南大學(xué)顧： ：學(xué)位論文 表1 5 列出了乳糖酶的一些應(yīng)用實(shí)例。 表l 一5 乳糖酶在乳制品中的應(yīng)用實(shí)例【8 t a b i e l - 5a p p l i c a t i o no fl a c t a s ei nd a i r y 1 2 固定化乳糖酶制備低乳糖牛奶 1 2 1 低乳糖牛奶的意義 對(duì)中國乳品業(yè)來說，一方面牛乳是人類最佳的飲食，需大力普及全民營養(yǎng)知識(shí)，讓 廣大消費(fèi)者自覺飲用牛乳，以更好地增加國民體質(zhì)；另一方面，多數(shù)人因乳糖不耐癥而 無法大量充分利用牛乳，相當(dāng)一部分人群忠有此癥，要影響牛奶消費(fèi)。開發(fā)低乳糖牛乳， 對(duì)于滿足乳糖不耐癥患者的乳品消費(fèi)需求和促進(jìn)我國乳品工業(yè)的發(fā)展均有重要意義1 4 j 。 1 2 2 低乳糖牛奶的生產(chǎn)方法 低乳糖牛奶能有效地解決乳糖不耐受癥。乳糖被水解后，生成易被人體吸收的葡萄 糖和半乳糖，剩余的乳糖就可發(fā)揮如前所述的營養(yǎng)與保健作用。 低乳糖牛奶有三種生產(chǎn)方法：物理去除法，酸水解法和酶水解法1 4 j j 。 物理去除法：采用超濾技術(shù)去除乳糖，雖可將大部分乳糖去除，但維生素和礦 物質(zhì)也隨之損失，不得不在去除乳糖后再將它們添加進(jìn)去，這也造成了乳糖的浪費(fèi)。 酸水解乳糖的特點(diǎn)是用強(qiáng)酸和高溫( p hl 一2 ，1 0 0 1 5 0 ) 對(duì)乳糖進(jìn)行水解，可以 用單一酸進(jìn)行酸催化，使酸根離子游離于溶液中。也可以用混合酸通過離子交換樹脂進(jìn) 行氫離子催化。在如此劇烈的條件下，只需很短的時(shí)間就可達(dá)到高水解度的低乳糖乳， 該法簡單且成本低，但存在缺點(diǎn)：由于反應(yīng)條件劇烈，易引起蛋白質(zhì)變性，故不適于處 理牛乳和含蛋白質(zhì)的乳糖溶液，僅限于處理過濾后的乳清液；乳清中的鹽離子與酸發(fā)生 第一章緒論 作用，脫鹽度應(yīng)達(dá)到9 0 9 5 ；反應(yīng)液呈現(xiàn)棕色，應(yīng)進(jìn)行脫色處理；形成許多不理想的 副產(chǎn)物；要求性能較好的設(shè)備材料，如耐酸、耐高溫等。 利用外源性乳糖酶生產(chǎn)低乳糖牛奶是當(dāng)今最安全、有效和實(shí)用的方法。酶水解 法的優(yōu)點(diǎn)是水解條件溫和、產(chǎn)物簡單、口感好、不會(huì)破壞乳中其他營養(yǎng)成分，保證食品 安全，設(shè)備投資小。 與普通牛奶相比，酶水解牛奶的優(yōu)點(diǎn)是：牛奶水解后，奶香味增加，甜度增加約3 倍，可明顯改善口味，增加滋味；提高了牛奶的營養(yǎng)價(jià)值1 3 】0 酸奶同樣能解決乳糖不耐受問題，它是牛乳經(jīng)乳酸菌發(fā)酵而成的。為加強(qiáng)發(fā)酵產(chǎn)酸， 生產(chǎn)時(shí)往往另添加蔗糖或葡萄糖等。如所用生產(chǎn)菌種能充分利用乳糖，產(chǎn)品中乳糖殘量 很低。反之，如菌種主要利用添加的糖份發(fā)酵而對(duì)乳糖利用不佳，則產(chǎn)品仍含較多乳糖， 且酸奶并不為人人喜愛，也不便用于嬰兒喂養(yǎng)i i 。 綜上所述，使用乳糖酶水解牛奶中的乳糖生成低乳糖牛奶是目前解決乳糖不耐受的 最佳方法。 使用乳糖酶生產(chǎn)低乳糖牛奶有多種方式：直接將游離乳糖酶加入牛奶中制備低乳 糖牛奶；直接服用乳糖酶片劑；使用固定化乳糖酶制備低乳糖牛奶。 雖然用游離乳糖酶制備低乳糖牛奶的工藝簡便，但游離乳糖酶會(huì)使牛奶摻入外來蛋 白，同時(shí)由于乳糖酶價(jià)格昂貴，使用游離乳糖酶制備低乳糖牛奶生產(chǎn)成本偏高，因 此難以推廣。服入乳糖酶片劑在胃腸道可能受到降解，而且同時(shí)食入的其它食物也可能 破壞酶的活性i l 。 固定化酶能反復(fù)回收利用，它的使用成本較游離酶下降很多：同時(shí)，乳糖酶被牢牢 地“固定”在某個(gè)區(qū)域，不會(huì)泄漏出來，不會(huì)污染牛奶。固定化乳糖酶能有效地解決生 產(chǎn)成本、食用安全問題。 1 2 3 乳糖酶的固定化 1 2 3 1 固定化生物催化劑【1 3 】 固定化生物催化劑，是指通過物理或化學(xué)法把生物催化劑束縛在一定空間內(nèi)仍具有 生物催化活性的一種生物催化用制劑。固定化生物催化劑與游離生物催化劑相比，固定 化具有下列優(yōu)點(diǎn)： 固定化的基本優(yōu)點(diǎn)是固定化生物催化劑很容易與底物、產(chǎn)物分離，并可反復(fù)使 用，可以在較長時(shí)間內(nèi)進(jìn)行反復(fù)分批催化反應(yīng)； 固定化生物催化劑有一定的機(jī)械強(qiáng)度，可以在柱式反應(yīng)器中連續(xù)使用，在連續(xù) 反應(yīng)體系中可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作，生物催化反應(yīng)過程能夠嚴(yán)格控制，生產(chǎn)效率大大提高， 適用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)； 固定化生物催化劑反復(fù)長期使用，利用率提高，催化反應(yīng)的催化劑消耗很少， 不僅使催化成本降低，而且能大大減少生物催化劑制造過程的廢物排放與操作污染： 固定化生物催化劑催化反應(yīng)產(chǎn)物溶液中沒有催化劑的殘留，最終產(chǎn)物不會(huì)被催 江南大學(xué)碩：l 學(xué)位論文 化劑污染，簡化了產(chǎn)物的提純工藝，也有利于產(chǎn)品質(zhì)量提高。 固定化生物催化劑也存在一些缺點(diǎn)： 固定化時(shí)，生物催化劑酶活力有損失； 生產(chǎn)過程中需要有固定化工序和裝囂，增大了生產(chǎn)成本，工廠初始投資增加。 但總的來說，固定化生物催化劑在節(jié)約能源資源，降低成本，保護(hù)環(huán)境，生產(chǎn)自動(dòng) 化、連續(xù)化等許多方面都十分有利。 1 2 3 2 酶的固定化方法 吸附法 吸附法是通過載體表面和酶分子表面間的次級(jí)鍵非共價(jià)結(jié)合而達(dá)到固定目的的方 法。吸附法是固定法中最簡單的方法，載體和生物催化劑酶之間的作用力是非共價(jià)作用 力，主要是靜電作用力，如范德華力、離子鍵和氫鍵作用力， 吸附法所用的固相載體很多，無機(jī)載體有活性炭、硅藻土、金屬氧化物、陶瓷等： 天然及合成高分子載體有二乙氨乙基纖維素( d e a e 一纖維素) 、s e p h a d e x 、離子交換樹脂、 大孔樹脂等。 吸附法的缺點(diǎn)是酶和載體的作用力比較弱，酶容易泄露，污染產(chǎn)物。 共價(jià)結(jié)合法 共價(jià)結(jié)合法是酶的活性非必需側(cè)鏈基團(tuán)與載體的功能基團(tuán)進(jìn)行共價(jià)鍵結(jié)合制備固 定化酶的方法。 共價(jià)結(jié)合法與吸附法相比，其優(yōu)點(diǎn)是酶與載體結(jié)合牢固，得到的固定化酶穩(wěn)定性好、 利于連續(xù)使用，一般不會(huì)因底物濃度高或存在鹽類等原因而輕易脫落。但是該方法反應(yīng) 條件苛刻，操作復(fù)雜，而且由于采用了比較激烈的反應(yīng)條件，會(huì)引起酶蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)變 化，破壞部分活性中心，易使酶變性失活。 包埋法 包埋法是將生物催化劑( 酶或細(xì)胞) ，通過物理學(xué)方法固定在高分子凝膠細(xì)微網(wǎng)格中 的方法。控制凝膠的孔隙大小，使網(wǎng)格結(jié)構(gòu)足夠緊密，酶分子或細(xì)胞不能泄漏出去，小 分子的反應(yīng)底物和產(chǎn)物能自由進(jìn)出。包埋法的優(yōu)點(diǎn)是包埋時(shí)條件溫和，很少發(fā)生酶高級(jí) 結(jié)構(gòu)的改變，酶活回收率較高( 但化學(xué)聚合包埋時(shí)，酶容易失活) ，缺點(diǎn)主要是載體對(duì)反 應(yīng)物質(zhì)的傳輸障礙，只有小分子可以通過高分子凝膠的網(wǎng)格擴(kuò)散，因此，包埋法固定化 只適合于小分子底物和產(chǎn)物的生物催化反應(yīng)，對(duì)大分子底物和產(chǎn)物的催化反應(yīng)不適合。 交聯(lián)法 交聯(lián)法是利用雙功能或多功能試劑在酶分子問或酶分子與惰性蛋白問、或酶分子與 載體問進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)以共價(jià)鍵制各固定化酶的方法。交聯(lián)法最常用于增強(qiáng)其他固定化方 法，可以減少其他固定化酶體系的酶泄漏。 1 2 4 固定化乳糖酶在乳制品生產(chǎn)中的應(yīng)用 固定化乳糖酶的關(guān)鍵在于酶的固定化。表l 一6 列出了乳糖酶固定化方法以及固定化 第一章緒論 乳糖酶在乳制品方面的應(yīng)用。 表1 6 乳糖酶的固定化及其在乳制品中的應(yīng)用4 舶l(fā) t a b l e l 6p r e p a r a t i o no 九h ei m m o b i l i z e dl a c t a s ea n d 弧a p p | i c a t i o ni d a 時(shí) 1 3 固定化乳糖酶制備低聚半乳糖 1 3 1 低聚半乳糖的性質(zhì) 低聚半乳糖( g a l a c t o o l i g o s a c c h 枷d e s ，g o s ) 是指在乳糖的半乳糖一側(cè)連結(jié)上1 4 個(gè) 分子的半乳糖的結(jié)合糖，屬于葡萄糖和半乳糖組成的雜低聚糖，分子式為 9 江南大學(xué)碩士學(xué)位論文 ( g a l a c t o s e ) n g l u c o s e ，它以母乳中含有的6 p 一半乳糖基為主要成分，含單糖數(shù)2 6 ：半 乳糖之間以d ( 1 4 ) 等鍵相聯(lián)結(jié)，其中以p ( 1 4 ) 鍵為主，半乳糖與葡萄糖之間的鍵主要 為p ( 1 4 ) 鍵。在自然界，動(dòng)物的乳汁中存在微量的低聚半乳糖，母乳中含量稍多。因 此，低聚半乳糖是一種具有天然屬性的低聚糖。 = l 一4 ，口鍵連接 有人將低聚半乳糖與其它低聚糖進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)低聚半乳糖對(duì)雙歧桿菌的活化增 殖效果最佳( 表1 7 ) 。 低聚半乳糖的有效攝取量為3g d ，每日攝取3 1 0g ，即能顯示各種生理功能。母乳 中含少量的低聚半乳糖。以乳糖為原料酶法合成的低聚半乳糖的大鼠急性試驗(yàn)測得低聚 半乳糖的l d 5 0 為16 眺g 體重。而在白鼠經(jīng)口攝取劑量高達(dá)1 5g 瓜g 體重并持續(xù)2 6 周的慢 性毒理試驗(yàn)中，也未發(fā)現(xiàn)低聚半乳糖的任何不安全因子i l 。 表l 一7 功能性低聚糖對(duì)雙歧桿菌的增殖情況【1 8 】 1 鈾l e l 7b m d o b a c t e r i u mp r o l i f e r a t i o np r o m o t e db yd i b r e n to h g o s a c c h a r i d e s 【1 8 注：卅，增殖效果好；+ + ，增殖效果中；+ ，增殖效果弱 到目前為止，被證實(shí)、分離得到的低聚半乳糖已有幾十種，它們的結(jié)構(gòu)如下 表l 一8 含單糖數(shù)目不同的低聚半乳糖的結(jié)構(gòu)式1 1 9 】 t h b l e l 8s t m c t u nf o 皿l u l a eo f g o sw i t hd i f k r e t u m b e ro f m o n o s a c c h a r i d e s 【1 9 】 低聚半乳糖結(jié)構(gòu)式 二糖 三糖 p d - g a 】( 1 6 ) p d g a l p - d g a l ( 1 6 ) - p d g l o b d g a l ( 1 3 ) p d - g a l p d g a l ( 1 3 ) 一p - d - g l o d g a l ( 1 - 2 ) 一爭d g l u b - d - g a i ( 1 - 6 ) p d g a l ( 1 4 ) 一d - g l c p d g a l ( 1 - 6 ) - p - d g a l ( 1 - 6 ) - d - g l c p d g a l ( 1 6 ) - p - d - g a l ( 1 6 ) - d - g a l 1 0 第一章緒論 續(xù)表l 一8 含單糖數(shù)目不同的低聚半乳糖的結(jié)構(gòu)式1 1 9 j 1 a b l e l 一8c o n t i n u e ds t r u c t u r ef o r m u l a eo f g o sw i t hd i f r b r e n tn u m b e ro f m o n o s a c c h a r i d e s 【1 9 】 低聚半乳糖結(jié)構(gòu)式 三糖 p - d g a l ( 1 6 ) 一p - d g l c ( 1 2 ) 一d g a l p d g a l ( 1 6 ) 一p d g a l ( 】- 4 ) - d - g a i p - d g a l ( 1 - 4 ) - p d - g a l ( 1 6 ) 一d g l c p d g a l ( 1 4 ) 一b d ga l ( 1 4 ) 一d g l c 口一d - g a f ( 1 - 4 ) 一b - d - g a i ( 1 3 ) 一d g i c p d g a l ( 1 _ 4 ) 一p d g a i ( 1 2 ) 一d g l c p d - g a l ( 1 3 ) 一p - d - g a l ( 】- 6 ) - d g 1 c p - d g a l ( 1 - 3 ) 一p d g a l ( 1 4 ) d g l c p d g a l ( 1 2 ) - p d - ga 1 ( 1 - 4 ) 一d - g a i p - d - g a l ( j - 2 ) p d g a l ( 1 3 ) - d g a l 四糖 五糖 b d g a i ( 1 6 ) _ p - d g a 】( 1 6 ) 一p - d - g a l ( 1 - 4 ) 一d - g l c p d g a i ( 1 - 6 ) 一p - d - g a l ( 1 - 3 ) - p d g a i ( 1 4 ) 一d g l c p d g a l ( 1 6 ) 一p d g a l ( 1 6 ) 一p d - g a l ( 1 - 4 ) 一d - g 1 c 、 p d g a l ( 1 6 ) - p - d g a l ( 】- 6 ) - p - d g a l ( 1 - 4 ) 一p - d g a l ( 1 - 4 ) 一d - g l o 1 3 2 低聚