免疫組化實驗方法.ppt

免疫組化實驗方法 免疫組織化學(xué)的概念 利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理 通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑 熒光素 酶 金屬離子 同位素 顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原 多肽和蛋白質(zhì) 對其進(jìn)行定位 定性及定量的研究 稱為免疫組織化學(xué) 2 最突出的優(yōu)點 在更廣闊的范圍內(nèi) 把結(jié)構(gòu)與功能及代謝結(jié)合起來 在微觀世界原位地確定組織及細(xì)胞結(jié)構(gòu)的化學(xué)成分 達(dá)到方法統(tǒng)一 定性可靠 定位準(zhǔn)確 定量可能 3 免疫組化實驗標(biāo)本 組織標(biāo)本 石蠟切片和冰凍切片 細(xì)胞標(biāo)本 組織印片 細(xì)胞爬片和細(xì)胞涂片 石蠟切片對于組織形態(tài)保存好 且能作連續(xù)切片 有利于各種染色對照觀察 還能長期存檔 4 細(xì)胞和組織的固定 1 固定的作用 使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固 終止或抑制外源性和內(nèi)源性酶活性 最大限度地保存細(xì)胞和組織的抗原性 使水溶性抗原轉(zhuǎn)變?yōu)榉撬苄钥乖?防止抗原彌散 2 選擇最佳固定液的標(biāo)準(zhǔn) 保持組織形態(tài)結(jié)構(gòu) 保存抗原性 1 醛類固定劑 穿透性較強 收縮性小 是常用的固定劑 如10 中性福爾馬林液 4 多聚甲醛緩沖液 戊二醛 甲醛液 乙酸 甲醛液等 2 非醛類固定劑 適用于多肽類激素的組織固定 常與戊二醛或多聚甲醛混合使用 3 丙酸及醇類固定劑 沉淀蛋白質(zhì)和糖 保存抗原性較好 但對低分子蛋白質(zhì) 多肽及胞漿內(nèi)蛋白質(zhì)的保存效果較差 和其它試劑混合使用加以解決 如加冰乙酸 乙醚 氯仿 甲醛等 3 常用的固定方法 浸入法和灌注法 適用于動物實驗研究 組織新鮮勿干燥體積適中固定液足夠 20倍 5 抗體 常用的抗體為單克隆抗體和多克隆抗體 特性比較 均一性2 穩(wěn)定性3 特異性4 重復(fù)性5 沉淀反應(yīng) 6 熒光素標(biāo)記抗體 能夠產(chǎn)生熒光并能作為染料的化合物稱為熒光色素 必備條件 熒光顏色與背景組織的自發(fā)熒光顏色對比鮮明 能清晰判斷結(jié)果 結(jié)合抗體蛋白后對抗體的免疫學(xué)性質(zhì)和生化性質(zhì)無影響 用于活體內(nèi)標(biāo)記 結(jié)合物應(yīng)無毒 附加抗原性小 7 常用的染色方法 根據(jù)標(biāo)記物的不同分為免疫熒光法 免疫酶標(biāo)法 親和組織化學(xué)法按標(biāo)記物定位于抗原所在部位的手段 則可將免疫細(xì)胞組織化學(xué)染色方法分為直接法 一步法 間接法 二步法 橋連法等 每進(jìn)行一步結(jié)合反應(yīng) 都會產(chǎn)生一次陽性結(jié)果的放大效應(yīng) 敏感性由高到低依次為橋連法 間接法 直接法 8 染色的基本程序 標(biāo)記抗體與標(biāo)本中抗原反應(yīng)結(jié)合 用緩沖液洗去未結(jié)合的成分 直接觀察結(jié)果 或顯色后再用顯微鏡觀察 9 反應(yīng)條件 抗原抗體結(jié)合屬于可逆性反應(yīng) 具有共性的反應(yīng)條件 1 PH 中性及弱鹼性條件 PH7 8 有利于免疫復(fù)合物的形成 2 離子強度 0 01 0 02M的低離于強度有利于免疫復(fù)合物的形成 3 去污劑 有利于復(fù)合物的形成 常用的非離子型去污劑有吐溫 20 EDTA 0 01 TritonX 100 0 1 1 4 抗體稀釋液中蛋白質(zhì)濃度 稀釋液中含無關(guān)蛋白質(zhì)可以減少抗體的非特異吸附 常用牛血清白蛋白 5 防腐劑 微生物生長會干擾抗原抗體反應(yīng) 稀釋液和抗體液中加入適量的疊氮鈉或硫柳汞以防腐 6 溫度和時間 較高的反應(yīng)溫度 37 可加速抗原抗體結(jié)合反應(yīng) 低溫有利于抗原抗體結(jié)合率的提高 7 洗滌 除去未結(jié)合抗原或抗體 除去非特異性吸附造成的背景染色 選用自來水 生理鹽水或PBS等 加去污劑并在洗滌過程中加以振搖 10 熒光素 1 異硫氰酸熒光黃 fluoresceinisothiocyanate FITC 黃色 橙黃色或褐黃色結(jié)晶粉末 最大吸收光譜為490 495nm 最大發(fā)射光譜為520 530nm 呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光 最常用 2 四甲基異硫氰酸羅丹明 tetramethylrhodamineisothiocyante TRITC 紫紅色粉未 較穩(wěn)定 最大吸收光譜550nm 最大發(fā)射光譜620nm 呈橙紅色熒光 與FITC發(fā)射的黃綠色熒光對比鮮明 3 四乙基羅丹明 tetraethylrhodamineB200 RB200 褐紅色粉未 最大吸收光譜570nm 最大發(fā)射光譜596 600nm 呈橙紅色熒光 價廉 11 染色注意事項 1 在濕盒內(nèi)進(jìn)行 以免標(biāo)本上的試劑干燥 2 酸堿度以接近體液環(huán)境為宜 PH7 4左右 3 組織細(xì)胞要求新鮮 最好使用冷凍切片 固定存檔標(biāo)本要求組織結(jié)構(gòu)完好 4 切片經(jīng)染色后 應(yīng)及時觀察并照相 切片在4 冰箱內(nèi)過夜 其熒光強度將減弱約30 5 調(diào)整抗體稀釋度以獲得最佳染色效果 以背景非特異性染色最小為標(biāo)準(zhǔn) 對每一批抗體必須試驗摸索 找出最佳稀釋度 6 所購抗體應(yīng)及早使用 盡量減少抗體溶液的凍融次數(shù) 12 酶標(biāo)抗體法 通過共價鍵將酶結(jié)合在抗體上制成酶標(biāo)抗體 再借酶對底物的特異性催化作用 生成有色的不溶性產(chǎn)物 于顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞或組織表面或內(nèi)部某種抗原成分定位觀察 常用的酶 辣根過氧化物酶 HRP 堿性磷酸酶 ALP 及葡萄糖氧化酶 GOD 等 優(yōu)點 與免疫熒光技術(shù)相比 終產(chǎn)物可在普通光鏡下觀察 切片能夠長久保存 經(jīng)鋨酸處理后 電子密度增強 可用于電鏡觀察 13 抗生物素 生物素 過氧化物酶技術(shù) avidin biotinperoxidasecomplexABC 原理 利用抗生物素分別連接生物素標(biāo)記的第2抗體和生物素標(biāo)記的酶 其第1抗體不為標(biāo)記物所標(biāo)記 生物素標(biāo)記的第2抗體與ABC復(fù)合物相連接 ABC復(fù)合物是將過氧化物酶結(jié)合在生物素上 再將生物素 過氧化物酶連接物與過量的抗生物素蛋白反應(yīng)而制備的 常用 ABC HRP辣根過氧化物酶 最通用的系統(tǒng) 使用范圍廣ABC AP堿性磷酸酶 靈敏度比較高 染色密度較低ABC GO葡萄糖氧化酶 靈敏度較低 適用于組織內(nèi)源性HRP或者AP含量比較高的組織 常與HRP或者AP系統(tǒng)配合進(jìn)行雙染 14 15 16 ABC法的特點 敏感性強特異性強 背景染色淡方法簡便 節(jié)約時間可用于雙重或多重免疫染色 17 免疫金染色原理 免疫金染色技術(shù)使用膠體金耦聯(lián)抗體 然后在光學(xué)顯微鏡下檢測抗原 解決了免疫組化里內(nèi)源性酶干擾的問題 整個檢測過程中無需酶的參與 因此不必預(yù)先處理樣本以消除內(nèi)源性酶的活性 免疫組化試劑的正確選擇和使用 18 一抗1 首選單克隆抗體 單克隆抗體具有高特異性 高親和力 交叉反應(yīng)少等特點 避免與細(xì)胞或組織蛋白的非特異性結(jié)合 減少染色背景 2 多克隆抗體 最好是經(jīng)樣本來源種屬正常血清吸附過 盡可能的減少非特異性著色背景 加一抗前 用封閉液 可以是BSA或二抗來源的正常動物血清 充分封閉 以阻斷非特異性結(jié)合位點 3 跨膜分子的抗體選擇 要注意免疫原是整個蛋白分子或是胞外區(qū) 胞內(nèi)區(qū) 對于胞內(nèi)區(qū)抗體 染色時需要使用穿孔劑 而胞外區(qū)抗體不必使用 4 正確使用 一般供應(yīng)商都會提供稀釋范圍和使用方法 但常常需要重新選擇比例 一般從供應(yīng)商提供稀釋比例的1 10稀釋度始 作倍比稀釋 19 20 二抗種屬來源要匹配 根據(jù)所用一抗選定二抗 一般來說 如果一抗是小鼠原性 二抗應(yīng)選擇兔 山羊或其它種屬抗小鼠的抗體 注意抗體同種型和亞型 確定一抗同種型和亞型后 可以選擇抗一抗來源種屬廣譜Ig或針對一抗亞型的二抗 如一抗是小鼠IgG1 可以選用山羊抗小鼠的Ig或IgG1的二抗 正確使用 也需要重新選擇稀釋比例 一般從供應(yīng)商提供稀釋比例的1 10稀釋度始 作5倍比稀釋 21 設(shè)立陽性對照和陰性對照 證明實驗系統(tǒng)的正確性1 陽性對照 主要涉及所用緩沖液 稀釋液 二抗和檢測系統(tǒng)等因素 尤其在結(jié)果出現(xiàn)無信號時 為查找原因提供重要線索 2 陰性對照 一種是自身對照 常用 指測試組織本身非抗原表達(dá)部位 一種是外部對照 指已證實不表達(dá)檢測抗原的組織 22 試劑保存 抗體試劑保存 抗體濃度越高越穩(wěn)定 易保存 濃度低時 應(yīng)