甲型肝炎病毒IgM抗體測定.ppt.ppt

甲型肝炎病毒IgM抗體的測定 捕獲法 酶聯(lián)免疫吸附試驗 ELISA法 將抗體 抗原 包被在固相表面后 按不同的步驟加入待測抗原 抗體 和酶標(biāo)抗體 抗原 充分反應(yīng)后用洗滌的方法 使固相上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分離 洗去游離的酶標(biāo)抗體 抗原 最后加入底物 根據(jù)酶對底物催化的顯色反應(yīng)程度 而對標(biāo)本中的抗原 抗體 進(jìn)行定性或定量 ELISA類型 夾心法間接法測抗體競爭法捕獲法 捕獲法測IgM抗體 血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時存在 后者會干擾IgM抗體的測定 因此測定IgM抗本多用捕獲法 1 包被抗體 用抗人 鏈抗體包被固相載體上 形成固相抗人 鏈 2 加入病人的血清標(biāo)本 3 加入特異性抗原試劑 4 加入針對特異性抗原的酶標(biāo)抗體 5 加底物顯色 免疫球蛋白的結(jié)構(gòu) 一 基本結(jié)構(gòu) 四肽鏈結(jié)構(gòu) 由兩條相同的輕鏈 LightChain 和兩條相同的重鏈 Heavychain 通過鏈間二硫鍵連結(jié)形成 分子式為 H2L2 四條肽鏈兩端游離的NH2和COOH方向一致分別命名為N端和C端 一 輕鏈和重鏈 輕鏈 L鏈 鏈 鏈輕鏈決定型別 型 型正常人 2 1 重鏈 H鏈 根據(jù)其抗原性的差異 人類Ig的H鏈分為 鏈 鏈 鏈 鏈 鏈 重鏈決定Ig類別IgGIgAIgMIgDIgE 捕獲法 主要用于血清中某種抗體亞型成分 如IgM 的測定 實驗原理 用抗人 鏈抗體包被酶標(biāo)板 用以捕獲血清中IgM類抗體 然后用特異性HAVAg與IgM抗體結(jié)合 再加酶標(biāo)抗HAV抗體 最后加底物顯色 顯色深淺與HAVIgM的含量成正相關(guān) 試劑盒組成 1抗 鏈包被干板條4 12孔2抗 HAVIgM陰性對照1ml 1瓶3抗 HAVIgM陽性對照1ml 1瓶4HA Ag2 6ml 1瓶5酶結(jié)合物2 6ml 1瓶6濃縮洗滌液20ml 1瓶 用蒸餾水1 20稀釋 7顯色劑A3ml 1瓶8顯色劑B3ml 1瓶9終止液3ml 1瓶 操作步驟 1 將微孔條固定在支架上 按順序編號 2 分別將待測標(biāo)本 陰 陽性對照100 l 2滴 加入相應(yīng)的孔中 設(shè)空白對照孔 置37 20分鐘 3 洗滌 甩去孔內(nèi)液體 用洗滌液注滿各孔 靜置5秒 共三次 每次洗后均需扣干 4 每孔加HA Ag50 l 酶結(jié)合物50 l 空白對照除外 振蕩混勻 置37 20分鐘 5 洗滌 重復(fù)上述36 顯色 每孔加顯色劑A液50 l 再加顯色劑B液50 l 振蕩混勻 置37 15分鐘 7 每孔加終止液50 l 結(jié)果判定 酶標(biāo)儀讀數(shù) 450nm波長630nm副波長讀數(shù) 臨界值 陰性對照孔OD均值 2 1 陰性對照OD小于0 05以0 05計算 結(jié)果判定 S CO 1為HAV IgM陽性 S CO 1為HAV IgM陰性 Cutoffvalue 臨界值 Cutoffvalue 臨界值 陰陽性判斷值 簡稱CO值 夾心法 若S CO值 1 為陽性 S CO值1 為陰性 HAVHBV肝炎病毒 HCVHDVHEV其他 HGV TTV SEN TLMV 甲型肝炎急性期血清標(biāo)志物出現(xiàn)過程 要點 1 HAV的傳播途徑 糞 口 2 HAV的潛伏期 30天 2周 3 血清標(biāo)志物出現(xiàn)的規(guī)律4 免疫學(xué)檢測指標(biāo) HAVAg抗HAV總抗體抗HAV IgM 臨床意義 血清中抗HAVIgM出現(xiàn)于感染的早期 發(fā)病后數(shù)日 抗體的效價很快升到峰值并持續(xù)較長時間 2 4周 經(jīng)1 2個月后抗體的效價和陽性率明顯不降 于3個月后消失 因此抗HAVIgM陽性 尤其是效價較高時 表明處于感染的早期 被公認(rèn)為