分子生物學(xué)電子版(修正版).doc

1.snRNA：小核RNA，只存在于細(xì)胞核或者核質(zhì)核仁中的一類(lèi)小分子量的RNA，具有獨(dú)特功能并且獨(dú)立存在的實(shí)體，約為70-300個(gè)核苷酸，可參與真核生物的RNA剪接。2.siRNA：即干擾RNA，一類(lèi)小分子量的RNA，可以高效，特意地阻斷體內(nèi)同源基因的表達(dá)，促使同源mRNA降解，誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定的基因缺失。3.核酶：一類(lèi)具有催化活性的核糖核酸，呈錘頭狀，參加RNA的剪切和降解。與RNA酶有顯著區(qū)別，它是RNA，后者是蛋白質(zhì)。4.反義RNA又稱(chēng)調(diào)節(jié)RNA，是指能與特定mRNA互補(bǔ)結(jié)合的RNA片段，即堿基序列正好與有意義的mRNA互補(bǔ)的RNA分子。5三鏈DNA：是在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上形成的，由多聚嘧啶核苷酸或者多聚嘌呤核苷酸與DNA雙螺旋形成的。/由于雙螺旋的一股輕微折疊后，該股中的堿基可與雙螺旋的堿基以Hoogsteen氫鍵相連如TAT、CGC、TAA、CGG。6.RNAi：即RNAi干擾，siRNA高效特異地阻斷體內(nèi)同源基因表達(dá)，促使同源RNA降解，誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型的現(xiàn)象。7.何謂反義RNA？其功能和醫(yī)學(xué)意義如何？答：又稱(chēng)為調(diào)節(jié)RNA，是指能與特定mRNA互補(bǔ)結(jié)合的RNA片段，也即堿基序列與有意義的mRNA互補(bǔ)的RNA分子。功能：a阻斷mRNA的翻譯，b抑制DNA復(fù)制和mRNA的轉(zhuǎn)錄，c選擇性的關(guān)閉基因。意義：參與基因調(diào)控：可用于基因治療（病毒、腫瘤）；8什么叫做核酶？如何發(fā)揮作用？有何應(yīng)用價(jià)值？答：即一類(lèi)具有催化活性的核糖核酸。主要催化RNA的剪接反應(yīng)和剪切反應(yīng)。應(yīng)用意義：通過(guò)設(shè)計(jì)合成特異性切割病毒以及病毒的RNA的核酶，對(duì)病毒和腫瘤的基因治療將發(fā)揮重要作用。9.何謂RNAi？其作用機(jī)理和應(yīng)用前景如何？答：即RNAi干擾，siRNA高效特異地阻斷體內(nèi)同源基因表達(dá)，促使同源RNA降解，誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型的現(xiàn)象。作用機(jī)理：分為起始階段和效應(yīng)階段。起始階段Dicer酶以依賴(lài)ATP的方式切割外源性的雙鏈RNA為小分子干擾RNA，清除病毒，阻斷轉(zhuǎn)座子表達(dá)；效應(yīng)階段小分子干擾RNA結(jié)合核酶復(fù)合物形成RNA誘導(dǎo)活化的復(fù)合物及RISC，然后RISC結(jié)合至mRNA轉(zhuǎn)錄本上并切割它，從而發(fā)揮作用。應(yīng)用前景：大通量研究基因功能的工具；基因敲除中的應(yīng)用；用于基因治療；基因表達(dá)的調(diào)控。第二章 1移動(dòng)基因：又叫轉(zhuǎn)位因子（transposable elements）,由于它可以在染色體基因組上移動(dòng)，甚至可在不同染色體間躍遷，故又稱(chēng)跳躍基因（jumping gene）。2斷裂基因：真核細(xì)胞的結(jié)構(gòu)基因，其核苷酸序列中含有與氨基酸編碼無(wú)關(guān)的DNA間隔區(qū)段，從而被分割成不連續(xù)的若干區(qū)域。將這種編碼序列不連續(xù)，有間隔區(qū)段的DNA片斷稱(chēng)為斷裂基因3 RNA剪接：將斷裂基因的內(nèi)含子刪除和表達(dá)子連接并最終形成成熟mRNA的過(guò)程。4 重疊基因：不同基因的核苷酸序列有時(shí)為相鄰兩個(gè)基因共用，將核苷酸彼此重疊的兩個(gè)基因稱(chēng)為重疊基因。5 假基因：在珠蛋白基因簇各片段核苷酸序列分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，除了有正常的功能基因之外，還有功能失活的特殊序列片段，它不能行使表達(dá)功能。該類(lèi)核苷酸序列中存在的無(wú)表達(dá)功能的畸變核苷酸序列片段。6 衛(wèi)星DNA：又稱(chēng)隨體DNA,不編碼蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄RNA的小片段高度重復(fù)一類(lèi)小片段DNA序列，多富含GC堿基在DNA浮力密度實(shí)驗(yàn)中會(huì)在主峰旁形成些小峰，形似衛(wèi)星分布而稱(chēng)之。一般5-10bp短序列，人類(lèi)為171bp，保護(hù)和穩(wěn)定染色體7 基因組：表示某物種單倍體的總DNA。對(duì)于二倍體高等生物其配子的DNA總和即為一組基因組不同生物基因組數(shù)目不同。8 LTR：即長(zhǎng)末端重復(fù)序列，為RNA基因組的兩端含有的U3RU5兩個(gè)完全相同的正向重復(fù)序列。具隨機(jī)整和能力，可用作病毒載體問(wèn)答：1 什么叫做基因？何謂基因的新概念？基因的主要功能是什么?答：基因就是指編碼有功能蛋白質(zhì)多肽鏈或RNA分子所必須的全部核酸序列。所謂基因的新概念是隨著近年分子生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展從分子水平上研究基因的結(jié)構(gòu)和功能，提出的移動(dòng)基因，斷裂基因，重疊基因，假基因等基因的新概念。功能：編碼蛋白質(zhì)或者RNA分子基本遺傳信息的基本遺傳單位，是構(gòu)成DNA的功能單位。2.何謂轉(zhuǎn)位子和轉(zhuǎn)位作用？轉(zhuǎn)位的后果如何？答：一種大于2000bp的可以在染色體基因組上移動(dòng)，甚至可以在不同染色體間跳躍的基因序列，也可以稱(chēng)為插入因子IS因子。轉(zhuǎn)位作用：轉(zhuǎn)位子具有雙向整合特性，可以插入其他基因及自身基因不同位點(diǎn)上的移動(dòng)方式。后果：可以在細(xì)菌染色體或質(zhì)粒中隨機(jī)轉(zhuǎn)移，被插入的基因即失去活性?？梢栽谌旧w或質(zhì)粒的某一IS上脫落轉(zhuǎn)位至另一相同的IS上，引起突變或基因轉(zhuǎn)移。3.何謂基因工程的四大里程碑和三大技術(shù)發(fā)明？答：四大里程碑：1944年Oswald報(bào)道肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，明確遺傳物質(zhì)是DNA；1953年James waston和Francis Crick闡明了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)(半保留復(fù)制及其中心法則)；遺傳密碼子的破譯；基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)。三大技術(shù)發(fā)明：工具酶的發(fā)明（內(nèi)切酶、合成酶、連接酶）；基因合成和測(cè)序（合成儀、測(cè)序儀）；PCR技術(shù)（PCR擴(kuò)增儀）。第三章名詞解釋?zhuān)?基因表達(dá)：是目的基因DNA在導(dǎo)入的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄成mRNA, 再以mRNA指導(dǎo)翻譯成蛋白質(zhì)。2 啟動(dòng)子：是位于結(jié)構(gòu)基因上游，轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控所必需的一段DNA序列，內(nèi)含-35區(qū)（與因子結(jié)合）和-10區(qū)（和核心酶結(jié)合）的保守序列。當(dāng)啟動(dòng)子與全酶結(jié)合后可在+1轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)開(kāi)始轉(zhuǎn)錄。3 終止子：位于一個(gè)基因編碼區(qū)下游提供終止信號(hào)的DNA序列，可以被RNA聚合酶識(shí)別并發(fā)出停止mRNA合成的信號(hào)。4 起始密碼子：編碼多肽鏈的第一位氨基酸的密碼子AUG（或ATG），編碼甲硫氨酸（蛋氨酸）。在細(xì)菌中也有罕見(jiàn)的其實(shí)密碼子GUG，編碼纈氨酸。其起始表達(dá)作用AUGGUG。5 終止密碼子：有三個(gè)密碼子（UAA, UAG，UGA），為終止密碼子，只表示鏈的終止，不表達(dá)氨基酸。問(wèn)答1外源基因在大腸桿菌中表達(dá)需要的條件有哪些？答：條件：一：外源基因插入序列必須保持有正確的方向和閱讀框架。其遺傳密碼不得缺失、遺漏或錯(cuò)位及錯(cuò)碼。否則會(huì)導(dǎo)致編碼錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)分子，特別是目的基因序列內(nèi)部應(yīng)不含兩端酶切位點(diǎn)的識(shí)別序列；二：原核mRNA聚合酶能夠識(shí)別插入的基因，三: 外源基因必須能在大腸桿菌中進(jìn)行有效轉(zhuǎn)錄（如無(wú)內(nèi)含子），轉(zhuǎn)錄后的信使RNA在菌體必須相當(dāng)穩(wěn)定，并且能有效的進(jìn)行翻譯，轉(zhuǎn)譯的蛋白分子在菌體內(nèi)不至于受菌體蛋白酶的降解2 影響外源基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素有哪些？答：包括以下這些因素：?jiǎn)?dòng)子結(jié)構(gòu)對(duì)表達(dá)效率的影響；表達(dá)載體的選擇；外源基因中密碼子的作用；mRNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)與基因表達(dá)；mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)翻譯起始的影響；mRNA穩(wěn)定性的影響；轉(zhuǎn)錄終止區(qū)對(duì)外源基因表達(dá)效率的影響；轉(zhuǎn)錄后的若干因素與基因表達(dá)的關(guān)系；宿主選擇對(duì)表達(dá)的影響；培養(yǎng)條件的控制對(duì)表達(dá)效率的影響。第四章名詞解釋?zhuān)? 鋅指結(jié)構(gòu)：由兩個(gè)半胱氨酸殘基和兩個(gè)組氨酸殘基通過(guò)位于中心的鋅離子結(jié)合成一個(gè)穩(wěn)定的指狀結(jié)構(gòu)，表面暴露的堿基及其極性氨基酸與DNA結(jié)合有關(guān)。 2 亮氨酸拉鏈：存在與蛋白C末端，為兩組走向平行.帶亮氨酸的螺旋形成的對(duì)稱(chēng)二聚體，約為30個(gè)氨基酸，每?jī)蓚€(gè)亮氨酸之間隔有六個(gè)氨基酸，于是每?jī)扇β菪陀幸粋€(gè)亮氨酸，排成一排，從而在2個(gè)-螺旋的蛋白分子之間形成一條拉鏈。3 RNA編輯：是mRNA轉(zhuǎn)錄后因插入，缺失或核苷酸的替換，改變了DNA模板來(lái)源的遺傳信息，從而翻譯出氨基酸序列不同的多種蛋白。4增強(qiáng)子：是使啟動(dòng)子的基因轉(zhuǎn)錄效率顯著提高的一類(lèi)順式作用元件，其本身不具有啟動(dòng)子活性，可獨(dú)立存在與上游區(qū)、下游區(qū)或基因內(nèi)部，可進(jìn)行遠(yuǎn)距離增強(qiáng)啟動(dòng)作用，而且無(wú)方向性。問(wèn)答1 真核表達(dá)調(diào)控的順式作用元件有哪些？其作用特點(diǎn)是什么？ 答：順式作用元件有：?jiǎn)?dòng)子，增強(qiáng)子，沉默子，衰減子，終止子。作用特點(diǎn)：是能夠與DNA結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合的特定序列的DNA片段，決定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄效應(yīng)。2 真核表達(dá)調(diào)控的反式作用因子有哪些？其作用特點(diǎn)？答：反式作用元件：主要分為通用轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子兩大類(lèi)。作用特點(diǎn)：一，同一DNA序列可被不同蛋白質(zhì)識(shí)別；二：同一蛋白質(zhì)因子可與多種不同DNA序列發(fā)生聯(lián)系，多通過(guò)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)先結(jié)合再影響DNA。三：蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)-DNA的結(jié)合，導(dǎo)致構(gòu)象上細(xì)微的改變，從而發(fā)揮調(diào)控作用。四：反式作用元件在合成過(guò)程中有相當(dāng)大的可變性和可塑性。4 常用的真核表達(dá)載體有哪些？并簡(jiǎn)述其特點(diǎn)。答：主要有一下幾種：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，痘類(lèi)病毒載體，HSV-I單純皰疹病毒載體。特點(diǎn)：一，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體：對(duì)細(xì)胞的感染效率高，并能表達(dá)整合的病毒基因；可以同時(shí)感染大量細(xì)胞；長(zhǎng)時(shí)間感染細(xì)胞并不會(huì)發(fā)生毒害作用；宿主范圍十分廣泛；可以進(jìn)行DNA的單拷貝整合；但穩(wěn)定性差，安全性差，重組病毒滴度不高而且局限于感染分裂細(xì)胞。二，痘類(lèi)病毒載體：對(duì)多種細(xì)胞敏感易于培養(yǎng)利于大量生產(chǎn)制備；對(duì)外環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定并易于保存運(yùn)輸；接種途徑簡(jiǎn)單易行；利于多價(jià)疫苗的研究開(kāi)發(fā)；利于大片段的外源性基因的插入，且不影響病毒的正常復(fù)制和表達(dá)，但是基因組分子量大不易操作，沒(méi)有mRNA的剪切功能故不宜采用基因組DNA，需使用無(wú)內(nèi)含子的cDNA。三，HSV-I單純皰疹病毒載體：比較大利于大片段的外源性基因插入提供條件，而且插入容量大；可以感染神經(jīng)細(xì)胞。5 簡(jiǎn)述真核，原核倆大表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)？答：一，真核生物DNA只有一小部分是裸露的，有核膜包裹；原核生物大部分屬于非結(jié)合狀態(tài)，且無(wú)核膜的阻隔，轉(zhuǎn)錄的mRNA直接在胞質(zhì)中進(jìn)行蛋白合成。二，真核生物DNA都有內(nèi)含子，可以剪接加以去除；原核生物mRNA的剪接加工能力。三，真核生物可以在需要時(shí)可以重排某些DNA片段和擴(kuò)增特定基因的機(jī)制，而原核生物沒(méi)有。四，真核生物有三種mRNA酶，可參與不同類(lèi)型的RNA分子轉(zhuǎn)錄作用，而原核生物只有一種RNA酶。五，真核生物產(chǎn)生的mRNA分子壽命大多比原核生物長(zhǎng)。六，真核生物具有對(duì)初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的剪接能力。七，真核生物不存在操縱子結(jié)構(gòu)，原核生物多是。八，真核生物基因多拷貝，而原核生物含有很少的重復(fù)序列。第五章名詞解釋?zhuān)? 限制性核酸內(nèi)切酶：是一類(lèi)能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。2 同尾酶：有一些限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別的堿基順序不完全恒定，即識(shí)別順序不同，但酶切后產(chǎn)生同樣黏性末端的兩種酶稱(chēng)為同尾酶，如BamH和Bgl 。 3 同裂酶：識(shí)別序列相同，對(duì)甲基化切點(diǎn)敏感性不同的兩種酶 。如:Mbo 和Sau3A共同識(shí)別序列GATC ，但對(duì)GmeATC切點(diǎn),前者不能切，后者能切。 4 甲基化酶：常見(jiàn)的有dam甲基化酶和dcm甲基化酶，可使相應(yīng)堿基甲基化。常用于使酶切位點(diǎn)中的堿基甲基化而避免降解，保護(hù)酶切位點(diǎn)。5 Klenow酶：為DNA聚合酶大片段，分子質(zhì)量為7.6KD，是經(jīng)過(guò)枯草桿菌蛋白酶或胰蛋白酶分解DNA聚合酶，切除小亞基，保留的大亞基部分。這種酶只有DNA聚合酶的活性和3/外切酶的活性，但是沒(méi)有5/外切酶活性。6 堿性磷酸酶：該酶的功能是以單鏈或雙鏈的DNA、RNA為基質(zhì)，將DAN或RNA片段的5端的磷酸切除，產(chǎn)生5-OH7 逆轉(zhuǎn)錄酶：又稱(chēng)為依賴(lài)RNA的DNA聚合酶，可以RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，這種酶具有聚合酶活性和3外切酶活性。8 DNA連接酶(Ligase）:是一種能夠催化在雙股DNA鏈的3-OH和5-P之間形成磷酸二酯鍵的酶，可連接互補(bǔ)粘性末端或平端以及缺口修復(fù)，不能連接單鏈DNA,被連接的DNA鏈必須是雙螺旋DNA分子的一部分。問(wèn)答：1 影響型核算內(nèi)切酶活性的因素有哪些？如何克服？答：一、DNA的純度。限制性核酸內(nèi)切酶消化DNA底物的反應(yīng)速率，很大程度上取決于所使用的DNA本身的純度。在DNA制劑中的你、某些污染物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、究竟、乙二胺四乙酸（EDTA）、SDS（十二烷基硫酸鈉）以及高濃度的鹽離子等，都有可能抑制核酸內(nèi)切酶的活性。 克服的方法為：a、增加限制酶的用量，平均每微克底物DNA可高達(dá)10單位甚至更多些；b、擴(kuò)大酶催化反應(yīng)的體積，以使?jié)撛诘囊种埔蛩乇幌鄳?yīng)的稀釋?zhuān)籧、延長(zhǎng)酶催化反應(yīng)的保溫時(shí)間。二、DNA的甲基化程度。限制性?xún)?nèi)切酶不能夠切割甲基化的核苷酸序列，因此甲基化會(huì)強(qiáng)烈的影響酶的活性。為了避免這種問(wèn)題，在基因克隆中是使用失去了甲基化酶的大腸桿菌菌株制備質(zhì)粒DNA。三、酶切消化反應(yīng)的溫度。不同的限制性核酸內(nèi)切酶具有不同的最適反應(yīng)溫度，而且彼此之間有相當(dāng)大的變動(dòng)范圍。大多數(shù)限制酶的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度是37C，但也有例外。溫度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響酶的活性甚至最終導(dǎo)致其完全失活。四、DNA分子結(jié)構(gòu)。有些限制酶切割超螺旋的質(zhì)粒DNA或病毒DNA所需的酶量要比消化線(xiàn)性DNA高出許多倍，而有些限制性核酸內(nèi)切酶切割他們自己處于不同部位限制位點(diǎn)的效率也有明顯的差別。五、限制性核酸內(nèi)切酶的緩沖液。不同的內(nèi)切酶對(duì)鹽濃度要求不一樣。同時(shí)還有其他一些如巰基試劑、適宜PH值、甘油體積分?jǐn)?shù)等對(duì)不同的內(nèi)切酶來(lái)說(shuō)要求也不同2 如何實(shí)現(xiàn)DNA粘性末端連接?單酶切點(diǎn)的連接如何降低本底和克服自我環(huán)化？答：用同一限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)載體及外源DNA作相同消化，隨后把這兩種DNA混合起來(lái)，加入DNA連接酶，便可產(chǎn)生出穩(wěn)定的雜種DNA。上述方法的缺點(diǎn)是限制酶切割產(chǎn)生的具有黏性末端的載體DNA分子 連接反應(yīng)混合物中會(huì)發(fā)生自我環(huán)化作用，并在連接酶的作用下重新變成穩(wěn)定的共價(jià)閉合的環(huán)形結(jié)構(gòu)，使得只含有載體分子的轉(zhuǎn)化子克隆的“本底”比例大幅度上升?？朔@一缺點(diǎn)的方法是：用細(xì)菌的或小牛腸的堿性磷酸酶（BAP或CAP），預(yù)先處理線(xiàn)性的載體DNA分子，以移去其末端的5/-P基團(tuán)，于是在連接反應(yīng)中，它自己的兩個(gè)末端就再也不能被連接酶共價(jià)連接起來(lái)了。這樣形成的雜種DNA分子的每一個(gè)連接位點(diǎn)中，載體DNA都只有一條鏈?zhǔn)峭庠碊NA連接上的，而另外一條鏈由于失去了5/-P基團(tuán)，不能作此連接，故留下一個(gè)具有3/-OH和5/-OH的缺口，盡管如此，這樣的DNA分子仍然可以導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞，并在寄主細(xì)胞內(nèi)完成缺口的修復(fù)工作。 3 基因片段與載體間的平末端連接有什么方法？答：連接平末端DNA分子的方法有兩種：一、T4連接酶連接法。T4 DNA連接酶除了能封閉具有3/-OH和5/-P末端的雙鏈DNA的缺口外，在存在ATP和加入高濃度酶的條件下，它還能夠連接具有完全配對(duì)堿基的平末端DNA分子，但其連接效率比黏性末端要低的多。二、同聚物加尾法。先用末端核苷酰轉(zhuǎn)移酶給平末端DNA分子3/-OH基團(tuán)端加上同聚物尾巴，再用DNA連接酶進(jìn)行連接。為了在平末端的DNA分子上產(chǎn)生帶有3/-OH的單鏈延伸，需要用5/特異的核酸外切酶處理DNA分子，以便移去少數(shù)幾個(gè)末端核苷酸。將要連接的DNA分子3/-OH基團(tuán)端延伸出poly（dA）和poly（dT）或者poly（dG）和poly（dC）尾巴后，互補(bǔ)的尾巴就會(huì)連接起來(lái)，連接分子的裂口可通過(guò)大腸桿菌DNA聚合酶的作用予以補(bǔ)上，留下的單鏈缺口則可由DNA連接酶封閉。三、用化學(xué)合成的銜接物鏈接DNA分子。第六章名詞解釋?zhuān)?.COS質(zhì)粒，粘性質(zhì)粒（Cosmid）帶有噬菌體的Cos位點(diǎn)和整個(gè)pBR322的DNA順序。經(jīng)感染進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞以后，它就好象質(zhì)粒那樣在細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制。易環(huán)化和擴(kuò)增。分子量小，可包裝30-45kb外源基因，可由Ampr抗性篩選，常用于構(gòu)建基因文庫(kù)。2.Cos位點(diǎn)（Cohesive-end site）： DNA為線(xiàn)狀雙鏈分子，兩端各有幾個(gè)堿基的單鏈互補(bǔ)粘性末端，通過(guò)粘性末端的互補(bǔ)作用形成雙鏈環(huán)形DNA。這種由粘末端結(jié)合形成的雙鏈區(qū)段即Cos位點(diǎn)。3.COS細(xì)胞：用一個(gè)復(fù)制起始部位缺失的SV40突變種感染猴細(xì)胞，由于病毒DNA不能自主復(fù)制，便整合到宿主染色體DNA中，病毒DAN?,早期基因表達(dá)產(chǎn)生功能性的T抗原，這樣的細(xì)胞就叫COS細(xì)胞。問(wèn)答：1 基因重組是常用哪幾種載體？其共同特點(diǎn)如何？ 答：常用載體的種類(lèi)：質(zhì)粒、噬菌體衍生物（COS、M13）、動(dòng)物病毒；共同特征：自主復(fù)制易于擴(kuò)增分離純化有非必需區(qū)有單一酶切位點(diǎn)（多克隆位點(diǎn)）單一酶切位點(diǎn)：一種酶在一個(gè)載體上只有一個(gè)酶切位點(diǎn)；多克隆位點(diǎn)：一個(gè)載體上的某一個(gè)區(qū)域含有多個(gè)單一酶切位點(diǎn)有選擇標(biāo)記基因表達(dá)載體還應(yīng)有表達(dá)調(diào)控元件（啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子,SD序列）2 作為理想的質(zhì)粒載體有哪些基本條件？答：作為理想的質(zhì)粒載體，應(yīng)具備以下幾個(gè)條件（1）能自主復(fù)制，即本身是復(fù)制子（2）具有一種或多種限制酶的單一切割位點(diǎn)，并在此位點(diǎn)中插入外源基因片段，不影響本身的復(fù)制功能；（3）在基因組中有1-2個(gè)篩選標(biāo)記，為寄主細(xì)胞提供易于檢測(cè)的表型特征，（4）分子量要小，多拷貝，易于操作。第七、八章名詞解釋?zhuān)? RT-PCR：即逆轉(zhuǎn)錄PCR，先在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下以mRNA為模板合成DNA,再以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。這樣低濃度的mRNA被擴(kuò)增放大易于檢測(cè)。是一種快速、簡(jiǎn)便且敏感性極高的檢測(cè)RNA的方法，可用于分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、克隆cDNA及合成cDNA探針、改造cDNA序列等。2 錨定PCR：在基因未知序列端添加同聚尾，人為賦予未知基因末端序列信息，再用人工合成的與多聚尾互補(bǔ)的引物作為錨定引物，在與基因配對(duì)互補(bǔ)結(jié)合后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。3 反向PCR：用限制性?xún)?nèi)切酶消化DNA，然后環(huán)化切割的的產(chǎn)物，再用已知序列上也可將兩端相反方向的引物進(jìn)行PCR，也可將環(huán)化DNA線(xiàn)性化再進(jìn)行PCR，是擴(kuò)增未知序列的簡(jiǎn)便方法。4原位PCR：直接用細(xì)胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個(gè)細(xì)胞中進(jìn)行PCR擴(kuò)增的方法。在單個(gè)細(xì)胞中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后用特異探針進(jìn)行原位雜交即可檢出含該特異序列的細(xì)胞。5 Southern印跡：將DNA經(jīng)酶切后瓊脂電泳分離，在凝膠中進(jìn)行堿變性處理，再轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜等固體載體上，用標(biāo)記的DNA特異探針對(duì)固定在膜上的DNA進(jìn)行雜交的方法。主要用來(lái)檢測(cè)DNA限制性?xún)?nèi)切酶圖譜。6 Northern印跡：將RNA樣品變性和通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，再轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜等固相載體上，用標(biāo)記的DNA或RNA特異探針對(duì)固定在膜上的RNA進(jìn)行雜交。7 斑點(diǎn)雜交：直接將變性DNA樣品點(diǎn)于硝酸纖維素膜上，固定好后先預(yù)雜交，再與標(biāo)記探針雜交，然后通過(guò)高嚴(yán)謹(jǐn)性沖洗(低鹽高溫)，降低本底和提高特異性。探針與同源樣品雜交后，陽(yáng)性結(jié)果產(chǎn)生斑點(diǎn)，故稱(chēng)斑點(diǎn)雜交。 8 原位雜交：用標(biāo)記的已知核酸序列為探針，使其與細(xì)胞或組織切片中核酸進(jìn)行雜交檢測(cè)的方法.有兩種：與胞內(nèi)DNA的雜交和與RNA的雜交。9 Western印跡:一種蛋白質(zhì)的固定和分析技術(shù)，將蛋白質(zhì)電泳分離后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜等固體載體上，然后加入抗體形成抗原抗體復(fù)合物，利用發(fā)光或顯色原理將 結(jié)果顯示到膜或底片上。10 差異顯示PCR：又稱(chēng)為差異顯示RT-PCR，用于分離在不同的真核細(xì)胞中差異表達(dá)的DNA并加以克隆，產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的DNA片段，電泳后比較兩者差別。該技術(shù)最大的優(yōu)點(diǎn)是省去了cDNA克隆和隨后繁雜的克隆篩選工作。問(wèn)答：1 試述PCR技術(shù)在基因診斷中的應(yīng)用？舉例說(shuō)明 答：一，在法醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用。即個(gè)人識(shí)別和親子鑒定。二，遺傳病相關(guān)基因的檢測(cè)：如果堿基突變的位置與某種限制性?xún)?nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)相關(guān)，突變會(huì)產(chǎn)生新的或消除原有的內(nèi)切酶位點(diǎn)，那么用特定的限制性?xún)?nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，通過(guò)電泳酶切圖譜就能直接判斷堿基發(fā)生突變與否。若某一遺傳病與這一酶切位點(diǎn)的存在或消失有連鎖關(guān)系，PCR-RFLP即可用于該遺傳病的診斷。用于遺傳病的產(chǎn)前診斷比如苯丙酮尿癥，鐮刀狀紅細(xì)胞貧血，杜氏營(yíng)養(yǎng)不良癥，血友病。三，致病病毒的檢測(cè)：檢測(cè)HIV，HBV,HSV單純皰疹病毒,HPV人乳頭病毒,等。比如人類(lèi)免疫缺陷病毒HIV-1是一種RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒，根據(jù)其保守序列設(shè)計(jì)引物，先用逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板產(chǎn)生cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。該法比分子雜交、血清學(xué)等診斷方法敏感性高，且操作簡(jiǎn)便，是診斷HIV的最佳方法。直接檢測(cè)臨床標(biāo)本中HBV DNA序列的存在，對(duì)確定患者血液標(biāo)本的感染性。HCV是單股正鏈RNA病毒，可采用逆轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)合巢式PCR法對(duì)急性丙型肝炎作出快速診斷四，腫瘤的診斷和研究如抑癌基因，癌基因的檢測(cè)，腫瘤相關(guān)病毒基因的研究等。如人類(lèi)一些血液系統(tǒng)的惡性腫瘤與特定的染色體易位或基因重排有關(guān)，這種易位、重排擾亂了基因的正常調(diào)控，可導(dǎo)致原癌基因從相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)變成激活狀態(tài)。應(yīng)用PCR技術(shù)能發(fā)現(xiàn)微量存在有染色體易位的癌細(xì)胞。五，感染性疾病病原體的診斷和研究。比如在針對(duì)支原體，螺旋體，衣原體，幽門(mén)螺旋桿菌等不易生長(zhǎng)的細(xì)菌檢測(cè)。2 核酸探針標(biāo)記常用哪些方法？ 答：一、探針?lè)派湫酝凰貥?biāo)記法 放射性同位素的選擇：32P、35S或3H均可用于標(biāo)記DNA或RNA。32P最常用于核酸的標(biāo)記。35S適用于原位雜交和DNA序列測(cè)定。3H放射比活度低，故常用于原位雜交。 核酸探針的標(biāo)記方法缺口平移法 大腸桿菌DNA聚合酶I具有53DNA聚合酶活性，以相對(duì)應(yīng)的鏈為模板，從切口處3-OH端逐個(gè)加入新的核苷酸，此酶還具有53外切核酸酶活性，可從切口的5端逐個(gè)切去核苷酸，造成切口平移。若反應(yīng)體系中存在一種或多種標(biāo)記的核苷酸，如a-32P dNTP，則隨著反應(yīng)的進(jìn)行，這些標(biāo)記的核苷酸將置換原有的核苷酸，制備出核素標(biāo)記的DNA探針。缺口平移法適用于標(biāo)記大于1 kb的雙鏈DNA。隨機(jī)引物法： 隨機(jī)引物法的基本原理是DNA聚合酶可利用隨機(jī)引物，沿單鏈模板進(jìn)行DNA的合成。末端標(biāo)記只將DNA 3端或5端標(biāo)記的方法稱(chēng)末端標(biāo)記，常用的方法如下：(1)DNA聚合酶I Klenow片段末端標(biāo)記法(圖7-3)。用該酶將含有核素標(biāo)記的dNTP補(bǔ)平切口或粘性末端。(2) T4DNA聚合酶標(biāo)記法。加入dNTP后抑制外切活性可將標(biāo)記的dNTP進(jìn)行填充標(biāo)記。(3)T4多核苷酸激酶標(biāo)記法。用該酶可將g-32P從g-32P ATP轉(zhuǎn)移至核酸的5-OH端(4)末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法。將多種標(biāo)記的dNTP逐個(gè)轉(zhuǎn)移到核酸缺口中的3-OH端，形成長(zhǎng)尾標(biāo)記。二、非放射性標(biāo)記核酸探針： 生物素標(biāo)記：生物素能以共價(jià)結(jié)合方式連接到UTP或dUTP的嘧啶環(huán)C5位置上，形成生物素化的核苷酸。其標(biāo)記方法有摻入標(biāo)記法和光敏生物素標(biāo)記方法。1. 摻入標(biāo)記法：生物素標(biāo)記的dNTP可代替相應(yīng)的單核苷酸，在DNA聚合酶的作用下，通過(guò)隨機(jī)引物法或缺口平移法，將生物素化核苷酸摻入到DNA分子中，獲得生物素標(biāo)記的DNA探針。2.光敏生物素標(biāo)記法：先通過(guò)連接臂將一個(gè)光敏基團(tuán)連接于生物素，成為光敏生物素(photobiotin) 半抗原地高辛配基標(biāo)記方法：將Dig與dUTP(或dCTP，dCTP)相連生成Dig-dUTP復(fù)合物，再通過(guò)切口平移法和隨機(jī)引物法將其摻入到DNA上。3 核酸分子雜交在基因診斷中的應(yīng)用？舉例說(shuō)明。 答：核酸雜交（Nucleic acid hybridization）是指具有一定同源性的兩條單鏈核酸在一定條件下，按堿基互補(bǔ)的原則重新配對(duì)形成雙鏈的過(guò)程。常用的技術(shù)有Southern印跡、Northern印跡、斑點(diǎn)雜交、原位雜交等。通過(guò)核酸雜交技術(shù)，可以利用帶有某種標(biāo)記的已知核酸片段作為探針，去檢測(cè)未知核酸序列。因此，核酸雜交可用于基因鑒定和基因突變分析等領(lǐng)域1、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）分析 ：多態(tài)性（polymorphism）指基因組中特定基因座位（DNA序列）存在兩種或兩種以上狀態(tài)（等位基因），并且其中任何一個(gè)等位基因在人群中的頻率不低于1%。限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）是由于DNA變異（產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)或消除原有的酶切位點(diǎn)）導(dǎo)致在限制性核酸內(nèi)切酶酶切時(shí)產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的片段。可借助southern blotting或PCR 的方法進(jìn)行檢測(cè)RFLP分析與遺傳病基因診斷。人類(lèi)染色體VNTR序列的RFLP分析圖譜：DNA fingerprinting。2、等位基因特異性寡核苷酸（ASO）探針雜交寡核苷酸中的堿基錯(cuò)配會(huì)大大影響雜交分子的穩(wěn)定性，因此可用人工合成的針對(duì)正常和突變等位基因的特異性寡核苷酸探針進(jìn)行雜交，檢測(cè)點(diǎn)突變。3、基因表達(dá)分析 常用Northern blotting或原位雜交分析。第九章名詞解釋?zhuān)? 基因組文庫(kù)：分離真核生物中某種DNA成分, 通常是分離供體細(xì)胞中的染色體DNA，酶切后，將這些染色體DNA片段與某種載體相接，而后轉(zhuǎn)入大腸桿菌，建立包含有真核細(xì)胞染色體DNA片斷的克隆株, 這種克隆株群體稱(chēng)基因組文庫(kù)。2.cDNA文庫(kù)：以mRNA為模板在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下將形成的互補(bǔ)DNA（cDNA ）建立基因文庫(kù)（gene library）。問(wèn)答1 目的基因克隆時(shí)常用哪些方法分離和獲得基因？答：一 、化學(xué)合成法：已知目的基因的核苷酸序列或其對(duì)應(yīng)的多肽鏈氨基酸序列。第一個(gè)核苷酸固定于不溶性的固相載體上, 然后按預(yù)定順序從該核苷酸開(kāi)始，以3、5-磷酸二酯鍵與另一核苷酸進(jìn)行縮合反應(yīng)（封閉非反應(yīng)基團(tuán) ），其后用洗滌法除去多余的反應(yīng)物和副產(chǎn)物, 再用同樣的步驟與下一個(gè)核苷酸進(jìn)行縮合反應(yīng), 如此循環(huán)將合成的寡核苷酸鏈從載體上洗脫下來(lái), 解除保護(hù)基, 進(jìn)一步純化。二、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）方法擴(kuò)增目的基因：以DNA變性復(fù)制的某些特性為原理，以目的DNA片段為模板, 利用酶促反應(yīng)（Taq酶），在特定引物的引導(dǎo)下，將加入的4種dNTP由引物沿模板從53按堿基配對(duì)原則, 形成與模板DNA互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈, 新合成的鏈又可作為下一輪循環(huán)的模板。經(jīng)25-30個(gè)循環(huán)產(chǎn)物呈 2n指數(shù)擴(kuò)增，由pgg（紫外可見(jiàn)），可獲得基因片段三、建立基因組DNA文庫(kù)：分離真核生物中某種DNA成分, 通常是分離供體細(xì)胞中的染色體DNA，酶切后，將這些染色體DNA片段與某種載體相接，而后轉(zhuǎn)入大腸桿菌，建立包含有真核細(xì)胞染色體DNA片斷的克隆株, 這種克隆株群體稱(chēng)基因組文庫(kù)。四、構(gòu)建cDNA文庫(kù)篩選目的基因：以mRNA為模板在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下將形成的互補(bǔ)DNA（cDNA ）建立基因文庫(kù)（gene library）五、其他方法 構(gòu)建差示文庫(kù)篩選特殊基因差示文庫(kù)； mRNA差異顯示法獲得目的基因 ； 基因改造可獲得新型目的基因2.構(gòu)建基因組文庫(kù)的意義及構(gòu)建過(guò)程如何？答：意義：提供全套遺傳信息, 即完整的基因組DNA,可以研究基因組中5端控制基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控序列, 內(nèi)含子的分布和作用, 以及重復(fù)序列的數(shù)量分布及大小 過(guò)程： 分離純化基因組DNA,提取哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體DNA； 制備全部基因組的DNA片斷。機(jī)械斷裂法:用超聲波或高速攪拌DNA溶液斷裂片段兩端沒(méi)有與克隆載體匹配的粘末端，因此插入載體之前還需要進(jìn)行修飾加工，少用限制性?xún)?nèi)切酶降解（鳥(niǎo)槍法）過(guò)去用EcoR,現(xiàn)在用Sau3A斷裂片段兩端有與克隆載體匹配的粘末端，可以直接與處理過(guò)的載體連接。 DNA片斷與載體的連接包裝 常用載體：粘性質(zhì)粒 噬菌體 酵母人工染色體基因組DNA +粘性質(zhì)粒重組DNA轉(zhuǎn)化細(xì)菌菌落 基因組DNA +噬菌體重組DNA包裝成噬菌體感染細(xì)菌噬菌斑1個(gè)克隆含有基因組的某個(gè)片段，整個(gè)克隆群體就包含基因組的全部基因片段總和。3 構(gòu)建cDNA文庫(kù)的意義？常用載體及構(gòu)建過(guò)程如何？答：意義：通過(guò)構(gòu)建cDNA文庫(kù)能直接分離到生命活動(dòng)過(guò)程中的一些調(diào)控基因及了解這些基因所編碼的蛋白質(zhì)的相互作用關(guān)系因此cDNA文庫(kù)的構(gòu)建是基因克隆的重要方法之一，從cDNA文庫(kù)中可以篩選到所需的目的基因，并直接用于該目的基因的表達(dá)。它是發(fā)現(xiàn)新基因和研究基因功能的工具。常用載體是質(zhì)粒（噬菌體）。過(guò)程：1.制備mRNA 1)取材：mRNA約占總RNA的15，所以應(yīng)選用目的基因mRNA表達(dá)最豐富的組織細(xì)胞為材料來(lái)源，如獲胰島素基因，由應(yīng)以胰島細(xì)胞為原始生物材料，細(xì)胞因子基因應(yīng)選用經(jīng)抗原或絲裂原刺激培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞為材料；2)從總的RNA中分離mRNA：將提取的mRNA在寡聚脫氧胸苷酸 oligo(dT) 纖維素中進(jìn)行親和層析 2.第一股 cDNA合成 1）以O(shè)ligo(dT) 為引物：從模板3末端開(kāi)始，沿模板的35方向合成, 對(duì)于較長(zhǎng)的mRNA分子很難得到全長(zhǎng)cDNA ；2）隨機(jī)引物：以68個(gè)核苷酸為隨機(jī)引物，從mRNA的不同結(jié)合點(diǎn)合成全長(zhǎng)cDNA第一鏈（RNA-DNA）3.第二股cDNA的合成 自身引導(dǎo)法； 置換合成法； 外加引物合成法 4.cDNA與載體連接和導(dǎo)入宿主細(xì)胞4 采用單酶切點(diǎn)法克隆基因時(shí)有什么缺點(diǎn)？如何克服？答：（1）高背景：載體經(jīng)單一限制性核酸內(nèi)切酶切割后，載體分子易于自我環(huán)化，既不利于目的基因的重組連接，大大降低陽(yáng)性克隆效率，又可使非重組性載體造成高背景。應(yīng)對(duì)方法：通常用堿性磷酸酶去除載體粘性末端的5-p以抑制DNA的自我環(huán)化。（2）雙向插入：經(jīng)單一限制核算內(nèi)切酶切割的目的基因和載體，因兩者的粘性末端是相同的，因此在連接反應(yīng)中，目的基因可發(fā)生雙向插入。載體對(duì)目的基因的表達(dá)是有方向的，而目的基因可雙向與之連接，這種連接如以克隆目的基因片段為目的則沒(méi)有影響，若以表達(dá)為目的，就要對(duì)插入的片段進(jìn)行方向鑒定。應(yīng)對(duì)方法：若構(gòu)建表達(dá)DNA重組體選用雙酶切切割目的基因和載體，可使目的基因與載體的連接發(fā)生定向連接重組，以使定向克隆。5 目的基因與載體的連接方法有哪些？基因重組時(shí)在倆個(gè)酶切位點(diǎn)中其中有一個(gè)不相匹配時(shí)，你如何解決連接問(wèn)題？答：連接方法： 粘性末端的連接：1單酶切點(diǎn)的粘性末端：目的基因片段與載體由相同的單一限制性?xún)?nèi)切酶消化酶切后，兩者的末端均具有相同的粘性末端，然后兩者相互連接。 2.雙酶切片段的定向克隆使外源性DNA片段定向插入到載體分子中的克隆，是用兩個(gè)不同的限制性?xún)?nèi)切酶切割目的基因，使之產(chǎn)生兩個(gè)不同的粘性末端，載體也用相同的兩個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶將載體切開(kāi)，此時(shí)載體不僅不會(huì)發(fā)生自我環(huán)化，而且只能在DNA連接酶的作用下與目的基因的相應(yīng)的粘性末端互補(bǔ)連接 平端連接法：1.同聚物加尾法；2.用銜接物連接法；3.適配子連接法（帶有相應(yīng)酶切點(diǎn)的粘性末端）；4.TA克隆法 TaqDNA聚合酶在擴(kuò)增目的基因DNA的同時(shí), 能不依賴(lài)模板而在擴(kuò)增產(chǎn)物兩3端加上兩個(gè)游離的“A”。 6 試述T-A克隆法的原理和用途。答：T-A克隆法是一種對(duì)PCR產(chǎn)物直接克隆的技術(shù)。TaqDNA聚合酶在擴(kuò)增目的基因DNA的同時(shí), 能不依賴(lài)模板而在擴(kuò)增產(chǎn)物兩3端加個(gè)游離的“A”。這樣只要載體切口處人工加上游離的“T”，PCR產(chǎn)物即可與載體連接。這種技術(shù)使得PCR產(chǎn)物的克隆變得非常簡(jiǎn)單。第十章1 轉(zhuǎn)染：病毒（含噬菌體）DNA及其重組子DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞（或細(xì)菌）的過(guò)程稱(chēng)轉(zhuǎn)染。2 轉(zhuǎn)導(dǎo)：以噬菌體為媒介，將外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌的過(guò)程稱(chēng)轉(zhuǎn)導(dǎo)。3 轉(zhuǎn)化：以質(zhì)粒作為克隆載體將目的基因?qū)胨拗骷?xì)胞。使原來(lái)細(xì)胞的遺傳基因和遺傳性發(fā)生相應(yīng)變化，常見(jiàn)的轉(zhuǎn)化方法有：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法；化學(xué)轉(zhuǎn)化法；電穿孔法4 -互補(bǔ)：原理：所謂基因內(nèi)互補(bǔ)作用，在LacZ體系中,是指二個(gè)彼此互補(bǔ)的突變基因（突變體1缺失LacZ近操作基因區(qū)段LacI；突變體2帶有完整的近操縱基因而無(wú)-半乳糖苷酶活性），它們編碼產(chǎn)生的無(wú)活性的多肽產(chǎn)物，但由于二個(gè)突變體之間通過(guò)肽互補(bǔ)作用可呈現(xiàn)有功能的-半乳糖苷酶活性, 進(jìn)而可分解底物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷）而產(chǎn)生半乳糖和深藍(lán)色的底物5-溴-4-氯-青定藍(lán), 使菌落呈現(xiàn)出藍(lán)色反應(yīng)。問(wèn)答1 重組DNA向受體細(xì)胞的導(dǎo)入方法有哪些？ 答：一.轉(zhuǎn)化 : 以質(zhì)粒作為克隆載體將目的基因?qū)胨拗骷?xì)胞。轉(zhuǎn)化作用就是一種基因型細(xì)胞（感受態(tài)細(xì)菌）從周?chē)橘|(zhì)中吸收來(lái)自另一種基因型細(xì)胞的DNA, 進(jìn)而使原來(lái)細(xì)胞的遺傳基因和遺傳性發(fā)生相應(yīng)變化的現(xiàn)象。常見(jiàn)轉(zhuǎn)化方法有 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法； 化學(xué)轉(zhuǎn)化法； 電穿孔法。 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法:除去細(xì)胞壁后加外源DNA，經(jīng)吸收恢復(fù)再生培養(yǎng)，如枯草桿菌。 化學(xué)轉(zhuǎn)化法:將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌在0下, 用預(yù)冷的CaCl2溶液低滲處理, 以使菌體的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜通透性增加, 菌體膨脹成球形。DNA易于進(jìn)入細(xì)菌的細(xì)胞內(nèi) 。電穿孔法：利用高壓脈沖電場(chǎng), 在宿主細(xì)胞表面形成暫時(shí)性的微孔, 質(zhì)粒DNA可乘隙而入, 在脈沖過(guò)后, 微孔復(fù)原 。二、通過(guò)接合作用傳遞質(zhì)粒DNA：質(zhì)粒由F+向F菌的轉(zhuǎn)移過(guò)程叫接合作用傳遞質(zhì)粒, 又稱(chēng)質(zhì)粒的接合傳遞。凡帶有在染色體上整合F質(zhì)粒的細(xì)菌又稱(chēng)高頻重組株系（Hfr株系）。Hfr株系不穩(wěn)定，F(xiàn)質(zhì)?？砂l(fā)生接合傳遞質(zhì)粒DNA, F+菌株可失去F質(zhì)粒, F菌也可獲得F質(zhì)粒, 其轉(zhuǎn)移難以人為控制,又不穩(wěn)定， 通常不用作克隆載體。三、通過(guò)轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)作用傳遞遺傳物質(zhì)。 轉(zhuǎn)染：病毒（含噬菌體）DNA及其重組子DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞（或細(xì)菌）的過(guò)程稱(chēng)轉(zhuǎn)染。 轉(zhuǎn)導(dǎo)：以噬菌體為媒介，將外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌的過(guò)程稱(chēng)轉(zhuǎn)導(dǎo)。原理：1.重組外源基因的噬菌體DNA, 體外包裝成噬菌體，感染宿主菌，同時(shí)導(dǎo)入外源基因。2.噬菌體的主動(dòng)感染將含有外源DNA片段的重組噬菌體DNA導(dǎo)入宿主菌體內(nèi)。2如何利用抗體標(biāo)記基因篩選陽(yáng)性克隆？答：大多數(shù)質(zhì)粒載體均帶有抗生素抗性基因，常見(jiàn)的有抗氨芐西林基因，抗四環(huán)素基因等，當(dāng)帶有完整抗性基因的載體轉(zhuǎn)化抗性細(xì)胞后，所有轉(zhuǎn)入載體的細(xì)菌都獲得了抗性，被轉(zhuǎn)化的陽(yáng)性克隆菌能在相應(yīng)抗生素的瓊脂平板上生長(zhǎng)，并形成菌落，而未被轉(zhuǎn)化的原宿主菌則不能生長(zhǎng)，據(jù)此可篩選攜帶外源基因的重組DNA轉(zhuǎn)化子。在含有兩個(gè)抗性基因的載體中，如果目的基因DNA片段插入其中一個(gè)抗性基因，就會(huì)導(dǎo)致該抗性基因的功能失活，用兩個(gè)分別含不同抗生素藥物的平板進(jìn)行對(duì)照篩選，可篩選出陽(yáng)性重組子克隆菌體。3、 如何從所克隆到的基因重組體載體中鑒定基因的存在和正確性？答：（1）重組子大小鑒別篩選：重組子中裝有一段較大分子量的外源性基因，其分子量明顯比原載體大很多，因此可將提取的重組載體和原載體，用一種限制性?xún)?nèi)切酶消化后，直接進(jìn)行凝膠電泳，從而據(jù)其電泳特性而初步篩選重組子中是否插入外源基因片段。（2）酶切鑒定：對(duì)于篩選出的具有重組子的菌株，經(jīng)小量培養(yǎng)后，再分別提取原載體或重組載體DNA，根據(jù)已知重組時(shí)外源基因兩端的酶切位點(diǎn)，用相應(yīng)的兩種內(nèi)切酶進(jìn)行酶解，經(jīng)瓊脂糖電泳后，就可以看出載體中是否含有目的基因片段，以及有DNAmarker條帶對(duì)比分析可得知插入基因片段的大小。（3）PCR篩選法：利用能與插入基因片段兩端互補(bǔ)的特異引物，以少量抽提的重組子DNA為模板進(jìn)行PCR分析，能擴(kuò)增出特異片段的轉(zhuǎn)化子為攜有目的基因的重組子（4）原位雜交：在培養(yǎng)基平板上的菌落或噬菌斑按照其原來(lái)的位置原位不變的轉(zhuǎn)移到濾膜上，并在原位溶菌裂解，DNA變性和用特異探針進(jìn)行雜交，從而鑒定出含有重組子的菌落或噬菌斑。第十一章1.基因突變：是基因組DNA分子在結(jié)構(gòu)上發(fā)生堿基對(duì)組成或排列順序的改變（通常它只涉及基因中部分序列的變化），并引起個(gè)體表型的改變, 而使生物體發(fā)生遺傳性變異。2.同義突變：是指堿基被替代后, 沒(méi)有改變產(chǎn)物氨基酸序列, 這是與密碼子的簡(jiǎn)并性相關(guān), 如CTT、CTC、CTA、CTG的第3位堿基互相替代后其編碼表達(dá)的產(chǎn)物均為亮氨酸,因此這種突變不產(chǎn)生突變效應(yīng)。 3.錯(cuò)義突變：是指堿基序列的改變引起了產(chǎn)物氨基酸的序列改變。有些錯(cuò)義突變嚴(yán)重影響到蛋白質(zhì)活性甚至完全失去活性，從而影響了表型。如果該基因是必需基因，則該突變?yōu)橹滤劳蛔儭?4.無(wú)義突變：某個(gè)堿基的改變可使某種氨基酸的密碼子突變?yōu)榻K止密碼子。如賴(lài)氨酸的密碼子AAG突變?yōu)榻K止密碼子TAG,使肽鏈合成過(guò)早終止, 因而蛋白質(zhì)產(chǎn)物一般沒(méi)有活性。若是發(fā)生在基因DNA的3末端處, 它所表達(dá)產(chǎn)生的多肽常有一定活性或有部分活性, 這種突變又稱(chēng)為滲漏變型（leaky mutation）。 第十二章名詞解釋?zhuān)? cdk：即周期素依賴(lài)激酶，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的有絲分裂促進(jìn)因子的組成成分，具有蛋白激酶活性的催化亞單位，活性依賴(lài)于同周期素結(jié)合。2 CD：即周期素依賴(lài)激酶抑制蛋白，是一種具有抑制cdk功能的新蛋白，能在細(xì)胞周期的特定時(shí)刻負(fù)調(diào)控cdk活性而控制細(xì)胞周期的進(jìn)程。3 周期素：調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的有絲分裂促進(jìn)因子，依據(jù)其在周期中調(diào)控階段的不同，將其分為G1期和S期和M期周期素，有一段高度保守的氨基酸序列與cdk互相結(jié)合，其合成與cdk結(jié)合或降解起到對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)作用。問(wèn)答：1 細(xì)胞周期調(diào)控檢查站有哪幾種？各自有何功能？ 答：人及哺乳動(dòng)物細(xì)胞中存在三個(gè)細(xì)胞周期控制點(diǎn)，即決定G期的G1調(diào)控點(diǎn)，決定S期的S控制點(diǎn)，決定M期發(fā)生的M控制點(diǎn)。G1控制點(diǎn)：在G1期哺乳動(dòng)物細(xì)胞趨向有三種可能性連續(xù)分裂細(xì)胞不斷突破G1期至S期。通過(guò)G2期和M期連續(xù)分裂，2.停留在G1期的暫不增殖細(xì)胞。3.無(wú)增殖力細(xì)胞，在G1期停止走向終末分化。在正常情況下哺乳動(dòng)物體內(nèi)的大部分細(xì)胞是處于非增殖狀態(tài)的休止期(G0期)，只在一定條件下才進(jìn)入G1期，只有通過(guò)限制點(diǎn)的細(xì)胞才能進(jìn)入SG2M期，R點(diǎn)是控制細(xì)胞增殖的關(guān)鍵。S控制點(diǎn)：完成G期后，S期激活因子啟動(dòng)DNA復(fù)制，進(jìn)入S期完成所有DNA復(fù)制以后進(jìn)入G2期。M控制點(diǎn)：細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂需要M期激酶的活化。只有產(chǎn)生有活性的二聚體激酶，使細(xì)胞進(jìn)入M期。M后期M期激酶失活，經(jīng)前期。中期。后期。末期后分裂成兩個(gè)子細(xì)胞，結(jié)束M期。 2 試述細(xì)胞周期調(diào)控異常與惡性腫瘤發(fā)生的相關(guān)性。 答：細(xì)胞周期素和CDK等細(xì)胞周期相關(guān)蛋白過(guò)表達(dá)或者缺陷，特別是那些決定細(xì)胞有G1進(jìn)入S期的蛋白若表達(dá)異常，使細(xì)胞周期進(jìn)程超越或突破細(xì)胞周期的控制點(diǎn)，細(xì)胞不能正常發(fā)生細(xì)胞自發(fā)產(chǎn)生的細(xì)胞死亡，衰老或分化，從而造成細(xì)胞惡化增生，形成惡性腫瘤。P53，Rb等抑癌基因的突變或缺失，與許多惡性腫瘤的發(fā)生進(jìn)展和不良預(yù)后相關(guān)，如某些生長(zhǎng)因子及其受體的高表達(dá)與癌基因異常激活有關(guān)，特別是一些與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的蛋白酶的異常活化，以抑制細(xì)胞凋亡基因的異常表達(dá)，均與細(xì)胞的惡性變相關(guān)。第十三章1 PCD：即程序性細(xì)胞死亡，又叫細(xì)胞凋亡，是由基因編程控制的細(xì)胞主動(dòng)參與的自殺過(guò)程，是細(xì)胞衰老自然死亡的主要方式之一，是一種生理性調(diào)節(jié)機(jī)制，在機(jī)體中承擔(dān)著重要的調(diào)控作用。2 DNAladder：細(xì)胞凋亡過(guò)程中，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶激活，染色質(zhì)DNA被有規(guī)律的切成180-200的整倍數(shù)的核小片段，在凝膠電泳中呈條帶狀，稱(chēng)之為DNAladder。3 AP峰：即凋亡峰，經(jīng)DAPI即4-6-二脒基二苯基吲哚熒光染色，可見(jiàn)顆粒狀的熒光碎片(核內(nèi))，在流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞周期時(shí)可測(cè)出亞G1峰，稱(chēng)“G1”期的AP峰。4 Caspase3：又稱(chēng)Cpp32/Yama/Apopain，可作用于多聚ADP核糖多聚酶PARP使之降解為89KD和24KD。破壞PARP修復(fù)DNA功能，引起細(xì)胞凋亡。問(wèn)答1 何謂細(xì)胞凋亡？細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死有何不同？ 答：是由基因編程控制的細(xì)胞主動(dòng)參與的自殺過(guò)程，是細(xì)胞衰老自然死亡的主要方式之一，是一種生理性調(diào)節(jié)機(jī)制，在機(jī)體中承擔(dān)著重要的調(diào)控作用。不同：細(xì)胞凋亡是細(xì)胞主動(dòng)死亡的過(guò)程，具有特征的形態(tài)和生化改變，是由基因控制的個(gè)別細(xì)胞發(fā)生的自主有序的死亡；是有目的有選擇性的自我消亡過(guò)程，是一種保證生命進(jìn)化的淘汰機(jī)制。2 Bcl-2，Bcl-x，Bax三者如何調(diào)控細(xì)胞死亡？答：（一）Bcl-2基因：又稱(chēng)為抗凋亡基因，其表達(dá)產(chǎn)物可增加細(xì)胞對(duì)多種促凋亡因素的抗性，而延長(zhǎng)細(xì)胞的壽命，其機(jī)制有抗氧化作用；影響胞內(nèi)鈣離子的重新分布；與凋亡基因bax的產(chǎn)物形成異源二聚體bax/bcl-2而競(jìng)爭(zhēng)抑制細(xì)胞凋亡的bax/bax同源二聚體的形成。 （二）bcl-x基因：其表達(dá)的mRNA可經(jīng)不剪切形成bcl-XS和bcl-XL兩個(gè)蛋白，bcl-XS促進(jìn)細(xì)胞凋亡，bcl-XL抑制細(xì)胞凋亡。（三）bax基因：表達(dá)產(chǎn)物常以bax/bax同源二聚體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，起加速凋亡的作用。3 細(xì)胞凋亡常用哪幾種特異檢測(cè)方法來(lái)證明細(xì)胞凋亡？答：(一）光鏡的形態(tài)學(xué)觀察：普通光鏡：細(xì)胞園縮，核濃縮、破碎 透射光鏡：凋亡小體（二）細(xì)胞DNA提取物的核酸電泳：電泳后經(jīng)過(guò)溴乙錠染色，在紫外光下呈梯形條帶。（三）MTT法：細(xì)胞凋亡，細(xì)胞琥珀酸脫氫酶下降，經(jīng)過(guò)MTT呈蘭紫色顆粒下降，經(jīng)過(guò)酸化異丙醇溶解后，于490nm波長(zhǎng)下測(cè)OD值，計(jì)算IC50。(四)熒光法：斷裂DNA可被DAPI著色后形成核斷裂顆粒熒光。(五)流式細(xì)胞儀檢測(cè)法測(cè)定DNA細(xì)胞經(jīng)乙醇固定后，采用碘化丙錠熒光染料，通透細(xì)胞后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)：1、測(cè)定DNA總量變化 2、測(cè)定細(xì)胞周期變化S期消失 3、測(cè)定凋亡峰于細(xì)胞G1期前出現(xiàn)亞G1峰，即凋亡峰。根據(jù)凋亡峰占總DNA的比例測(cè)定凋亡百分率。（六）Bcl-2、Bax胞漿蛋白檢測(cè)：1、免疫組化法：細(xì)胞固定滴片，用穿孔素打孔。加Bcl-2抗體，洗滌后加酶標(biāo)二抗顯色鏡檢。2、流式細(xì)胞儀檢測(cè)法Bcl-2/Bax：多聚甲醇固定細(xì)胞用TB穿孔液打孔加入Bcl-2/Bax單抗洗滌后加入熒光標(biāo)記二抗洗滌后FCM檢測(cè)含量。（七）Bcl-2/Bax基因表達(dá)檢測(cè)：提取細(xì)胞mRNA加逆轉(zhuǎn)錄酶加入引物，Taq酶PCR擴(kuò)增cDNA定量檢測(cè)cDNA量。（八）其他方法：1、磷脂酰絲氨酸（ps ）測(cè)定2、斷裂DNA位點(diǎn)的原位標(biāo)記試驗(yàn)第十四章問(wèn)答：1 試述G蛋白的作用和特點(diǎn) 答：作用：G蛋白是連接受體與效應(yīng)器之間的中介物質(zhì)，是一種酶。由于在中介反應(yīng)過(guò)程中與鳥(niǎo)苷酸(GTP和GDP)結(jié)合故稱(chēng)為G蛋白。G蛋白由a、b和g三個(gè)亞基構(gòu)成。具有酶催化活性的a亞基與鳥(niǎo)苷酸結(jié)合后，可催化GTP變?yōu)镚DP的反應(yīng)。b和g亞基是疏水蛋白，總是以gb復(fù)合物的形式存在于細(xì)胞膜的內(nèi)表面。G蛋白中介的反應(yīng)可分為四個(gè)階段：第一階段為靜止態(tài)。含a、b和g亞基。第二階段，激動(dòng)劑分子與受體結(jié)合，使受體的構(gòu)象變得易于與G蛋白結(jié)合。第三階段，a/GTP在細(xì)胞膜內(nèi)擴(kuò)散，與不同的靶蛋白效應(yīng)酶或離子通道相連，引起不同的生物效應(yīng)。當(dāng)GTP酶水解a/GTP成a/GDP時(shí)，效應(yīng)過(guò)程終止。第四階段是a/GDP從效應(yīng)靶蛋白上解離，a亞基與gb亞基重新結(jié)合，形成gba復(fù)合物，從而完成了一個(gè)循環(huán)。每個(gè)循環(huán)過(guò)程起到信號(hào)放大的作用。G蛋白偶聯(lián)型受體的特點(diǎn)：1.都是由七個(gè)跨膜區(qū)的單一肽鏈構(gòu)成的。2.第五和第六跨膜區(qū)之間的第三內(nèi)環(huán)較其他環(huán)大，而且是G蛋白的結(jié)合區(qū)。3. G蛋白是一個(gè)三聚體，由a、b和g亞基組成，a亞基具有GTP酶活性。a亞基的多樣性決定了受體功能的多樣性和專(zhuān)一性。4.G蛋白的三聚體與激動(dòng)劑結(jié)合的受體偶聯(lián)后，a亞基解離并激活效應(yīng)器(酶或離子通道)。5.當(dāng)a亞基結(jié)合的GTP被水解，激活效應(yīng)器的反應(yīng)即終止，此時(shí)a亞基可又與gb亞基結(jié)合。2 試述