雙向電泳操作步驟.doc

3.1 全菌蛋白的制備將細(xì)菌接種于DMEM培養(yǎng)基，置于28培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h。參照Coelho 等（Coelho et al. 2004）的方法，略有改動(dòng)。用Wash buffer（10mmol/L TrisCl pH8.0，5mmol/L 醋酸鎂）清洗細(xì)胞3次。離心，細(xì)胞沉淀在Lysis Buffer( 7mol/L 尿素， 2mol/L硫尿，1% IPG Buffer pH3-10或 pH4-7，4% CHAPS，1% DTT， 1%蛋白酶抑制劑，1%核酶抑制劑)中懸浮，使其濃度范圍在510mg/mL。置于冰上裂解2h。13000r/min離心1h取上清，-80保存。用2-D clean-up Kit 純化蛋白，再用2-D Quant Kit測(cè)定樣本中蛋白濃度。3. 2 2-D Clean-Up Kit的使用方法 （全程小心）蛋白質(zhì)樣本在1.5mL微型離心管中處理，所有步驟均在冰上進(jìn)行。1）將體積100L的蛋白質(zhì)樣本（含1100g蛋白質(zhì)）置于1.5mL微型離心管中。加入300L沉淀劑。振蕩或倒置攪勻。冰浴中（45）培育15min。2）加入300L共沉淀劑，簡(jiǎn)單振蕩混合一下，12000r/min離心5min。3）將上清液盡量多地傾析或吸出，不要攪散沉淀。保持沉淀不變，在其上面加入一層40L共沉淀劑，冰上培育5min。后離心5min，去上清。4）往沉淀加入25L蒸餾水或去離子水。將管振蕩510s，這時(shí)沉淀應(yīng)散開，但并未溶解于水中。在管中加入1mL洗滌緩沖液（在-20下至少預(yù)冷1h）和5L洗滌添加劑，振蕩直至沉淀完全散開。-20下培育至少30min，每10min振蕩2030s。5）將離心管以最大速度（至少12000r/min）離心5min。小心地將上清液移走棄去。此時(shí)應(yīng)可見白色沉淀，將沉淀簡(jiǎn)單風(fēng)干一下（不要超過5min）。6）用裂解液溶解沉淀，以備第一向IEF電泳。振蕩管子至少30s，在室溫下孵育，振蕩或用移液管抽吸使之完全溶解。將離心管以最大速度（至少12000r/min）離心5min，去掉所有不溶物質(zhì)，除去泡沫。上清液可以直接加載到第一向IEF 電泳膠上，也可以移至另一個(gè)管中，在-80下保存以備日后分析。3.3 2-D Quant Kit的使用方法1）用2mg/mL濃度的BSA 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備標(biāo)準(zhǔn)曲線（050g）。2）制備含150L待測(cè)樣本的微型離心管，一式兩份。有效檢測(cè)范圍是0.550g。3）每個(gè)微型離心管中（包括含BSA 標(biāo)準(zhǔn)溶液的離心管）加入500L沉淀劑。振蕩并在室溫下培育 23min。4）加入500L輔助沉淀劑，短暫混勻。5）離心（至少10 000r/min）5min。棄去上清液。再次短暫離心將殘余的上清液集中至管底，用微量移液管吸去殘余的上清液。操作要快，避免離心沉淀再溶或分散開。此時(shí)應(yīng)無可見的液體成分殘留。5）每個(gè)管中加入 100L銅溶液和 400L蒸餾水或去離子水。振蕩使沉淀的蛋白質(zhì)溶解。應(yīng)徹底振蕩混勻，確保沉淀完全再溶解。6）每個(gè)管中加入 1mL工作比色劑，應(yīng)確保以最快的速度加入，使之與樣本立即相混。在室溫下培育 1520min。采用分光光度計(jì)，如Ultrospec1100 pro UV/ 可見光分光光度計(jì)，測(cè)定樣本和標(biāo)準(zhǔn)液的480nm波長(zhǎng)吸光率。7）根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液蛋白質(zhì)含量的吸光率，標(biāo)繪標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣本與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，得到樣本蛋白質(zhì)濃度。3.4雙向電泳主要是依據(jù)GE Healthcare公司雙向電泳操作手冊(cè)進(jìn)行，并參考GE Healthcare描述方法進(jìn)行一些改進(jìn)(Berkelman et al. 1998)。3.4.1 一向等電聚焦（IEF）13cm pH 3-10的膠條每膠條上樣150g蛋白。24cm pH 4-7的膠條，每膠條上樣300ug蛋白。膠條上樣后于20水化l2h。水化好的膠條移至Ettan IPGphor III水平電泳儀按照：S100v 1h，S200v 1h，S500 v 1h，G1000v 1h，G10000v 3h，S10000v 8h至等電聚焦完成。等電聚焦結(jié)束后, 迅速取出IPG 膠條, 先置于平衡液A( 6 mmol/L Urea，2% SDS，75 mmol/L Tris-HCl pH8.8，29.3%甘油，1% DTT，痕量溴酚藍(lán)) 平衡15min后，再將膠條置于平衡液B ( 6mmol/L Urea，2% SDS，75mmol /LTris-HCl pH 8.8，29.3%甘油，2.5%碘乙酰胺，痕量溴酚藍(lán))平衡15 min。3.4.2 二向SDS-PAGE（緩沖液全部是新鮮配制）將平衡好的膠條轉(zhuǎn)入Ettan DALTsix垂直電泳槽中進(jìn)行第二向電泳，聚丙烯酰胺凝膠濃度為12%，電泳條件為每膠1W ，電泳1h，然后每膠20W直至溴酚藍(lán)指示線到達(dá)凝膠底部停止電泳。3.4.3 銀染將凝膠在玻璃板上剝離下來后，置于固定液(40%無水乙醇)30min，倒去固定液，換敏化液(30%無水乙醇10%冰乙酸，0.2%硫代硫酸鈉，6.8%的乙酸鈉) )中敏化30min，倒去敏化液，以雙蒸水洗3次，每次5min，然后置于銀染液(0.25%硝酸銀)中染色20min，再次用雙蒸水洗2次，每次l min，接著置于顯影液(2.5%無水碳酸鈉，0.0084%甲醛)中至蛋白質(zhì)點(diǎn)完全顯現(xiàn)為止，倒去顯影液，立即換終止液(1.5%乙二胺四乙酸二鈉)停止顯影，10min后用雙蒸水洗滌3次，每次5min，然后置于保存液(30%無水乙醇，4.6%丙三醇)中，30min后再換一次保存液，此時(shí)凝膠就可以進(jìn)行掃描和分析了。3.5 凝膠掃描及圖象分析Image Scanner III型透射掃描儀對(duì)凝膠進(jìn)行圖象掃描。得到的雙向電泳圖譜通過ImageMaster 2D Elite 5.0 圖像分析軟件進(jìn)行分析，所得數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析在SPSS11.0 軟件上進(jìn)行。水化過程： 從冰箱中取-20冷凍保存的水化上樣緩沖液（不含DTT ，IPG Buffer）一小管（1ml/管），置室溫溶解。 在小管中加入2.8mg DTT，IPG Buffer 5ul，充分混勻。 從小管中取出450ul水化上樣緩沖液，加入(13cm pH 3-10的膠條每膠條上樣150g蛋白)樣品，充分混勻。 確保充分吸收，不要過量加入水化液。短暫離心。水化液加入溶脹盤。從冰箱中取-20冷凍保存的IPG預(yù)制膠條（17cm pH 4-7），室溫中放置10分鐘。分清膠條的正負(fù)極，從正極開始剝保護(hù)層，膠面朝下，除氣泡，正極先放。注意：堿性（負(fù)極）端較脆弱，應(yīng)小心操作。輕輕地將IPG膠條膠面朝下置于聚焦盤或水化盤中樣品溶液上，使得膠條的正極（標(biāo)有+）對(duì)應(yīng)于聚焦盤的正極。確保膠條與電極緊密接觸。不要使樣品溶液弄到膠條背面的塑料支撐膜上，因?yàn)檫@些溶液不會(huì)被膠條吸收。同樣還要注意不使膠條下面的溶液產(chǎn)生氣泡。如果已經(jīng)產(chǎn)生氣泡，用鑷子輕輕地提起膠條的一端，上下移動(dòng)膠條，直到氣泡被趕到膠條以外。注意：不要產(chǎn)生氣泡。否則影響到膠條中蛋白質(zhì)的分布。在每根膠條上覆蓋2-3ml覆蓋油，防止膠條水化過程中液體的蒸發(fā)。需緩慢的加入礦物油，沿著膠條，使礦物油一滴一滴慢慢加在塑料支撐膜上。 膠條上樣后于20水化l2-20h。 第一向等電聚焦水化結(jié)束后，調(diào)儀器水平，放膠條槽。膠條放與濾紙上，吸多余覆蓋油。取出水化好的膠條，提起一端將礦物油瀝干，膠面朝下，將其置于剛好潤(rùn)濕的濾紙片上雜交以去除表面上的不溶物。放膠條，膠面朝上。加電極片，裝電極片。將紙電極置于聚焦盤的正負(fù)極上，加ddH2O 58l潤(rùn)濕。蓋蓋，設(shè)程序?qū)谜?、?fù)極，蓋上蓋子。設(shè)置等電聚焦程序。聚焦結(jié)束的膠條。立即進(jìn)行平衡、第二向SDS-PAGE電泳，否則將膠條置于樣品水化盤中，-20冰箱保存。第二向SDS-PAGE電泳 配制10%的丙烯酰胺凝膠兩塊。配80ml凝膠溶液，每塊凝膠40ml，將溶液分別注入玻璃板夾層中，上部留1cm的空間，用MilliQ水（沒有milliq的話ddh2o也行）、封面，保持膠面平整。聚合30分鐘。一般凝膠與上方液體分層后，表明凝膠已基本聚合。 待凝膠凝固后，倒去分離膠表面的MilliQ水，用MilliQ水沖洗。 從-20冰箱中取出的膠條，先于室溫放置10分鐘，使其溶解。 配制膠條平衡緩沖液A。 5在桌上先放置干的厚濾紙，聚焦好的膠條膠面朝上放在干的厚濾紙上。將另一份厚濾紙用MilliQ水浸濕，擠去多余水分，然后直接置于膠條上，輕輕吸干膠條上的礦物油及多余樣品。這可以減少凝膠染色時(shí)出現(xiàn)的縱條紋。 將膠條轉(zhuǎn)移至溶漲盤中，每個(gè)槽一根膠條，在有膠條的槽中加入5ml膠條平衡緩沖液A。將樣品水化盤放在水平搖床上緩慢搖晃15分鐘。 配制膠條平衡緩沖液B。 第一次平衡結(jié)束后，徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩沖液A。并用濾紙吸取多余的平衡液（將膠條豎在濾紙上，以免損失蛋白或損壞凝膠表面）。再加入膠條平衡緩沖液B，繼續(xù)在水平搖床上緩慢搖晃15分鐘。 用濾紙吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠上方玻璃板間多余的液體。將處理好的第二向凝膠放在桌面上，長(zhǎng)玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝膠的頂部對(duì)著自己。 將瓊脂糖封膠液進(jìn)行加熱溶解。 將10電泳緩沖液，用量筒稀釋10倍，成1電泳緩沖液。趕去緩沖液表面的氣泡。 第二次平衡結(jié)束后，徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩沖液。并用濾紙吸取多余的平衡液（將膠條豎在濾紙上，以免損失蛋白或損壞凝膠表面）。 將IPG膠條從樣品水化盤中移出，用鑷子夾住膠條的一端使膠面完全浸末在1電泳緩沖液中。然后將膠條膠面朝上放在凝膠的長(zhǎng)玻璃板上。其余膠條同樣操作。 將放有膠條的SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移到灌膠架上，短玻璃板一面對(duì)著自己。在凝膠的上方加入低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液。 用鑷子、壓舌板或是平頭的針頭，輕輕地將膠條向下推，使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面完全接觸。注意不要在膠條下方產(chǎn)生任何氣泡。在用鑷子、壓舌板或平頭針頭推膠條時(shí)，要注意是推動(dòng)凝膠背面的支撐膜，不要碰到膠面。 放置5分鐘，使低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液徹底凝固。 在低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液完全凝固后。將凝膠轉(zhuǎn)移至電泳槽中。 在電泳槽加入電泳緩沖液后，接通電源，起始時(shí)用的低電流（5mA/gel/17cm）或低電壓，待樣品在完全走出IPG膠條，濃縮成一條線后，再加大電流（或電壓）（20-30mA/gel/17cm），待溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到底部邊緣時(shí)即可停止電泳。 電泳結(jié)束后，輕輕撬開兩層玻璃，取出凝膠，并切角以作記號(hào)（戴手套，防止污染膠面）。 進(jìn)行染色。雙向電泳蛋白點(diǎn)的切取和保存1.用PDQuest軟件或肉眼比對(duì)，找出感興趣的蛋白點(diǎn)，并做好標(biāo)記和記錄。2.用MilliQ水沖洗膠2次。3.用色譜純甲醇和MilliQ水沖洗Ep管4.將槍頭(200l)下端剪去，使其內(nèi)徑略小于蛋白斑點(diǎn)的直徑，用色譜純甲醇和MilliQ水沖