辣根過氧化物酶.doc

辣根過氧化物酶（HRP）一種糖蛋白，由于在辣根中該酶的含量很高，故名。它以鐵卟啉為輔基，在過氧化氫存在時能催化苯酚、苯胺及其取代物聚合。通常用做光學(xué)和電子顯微鏡的組織化學(xué)示蹤物。簡介： 過氧化物酶，通常來源于辣根（因此稱辣根過氧化物酶），是臨床檢驗試劑中的常用酶。該產(chǎn)品不但廣泛用于多個生化檢測項目，也廣泛運用于免疫類（ELISA）試劑盒。過氧化物酶作為多個試劑盒顯色體系的關(guān)鍵成分，對試劑盒的質(zhì)量有重要影響。 辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，穩(wěn)定，分子量小，純酶容易制備，所以最常用。HRP廣泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結(jié)合而成的糖蛋白，糖含量18%。HRP由多個同功酶組成，分子量為40,000,等電點為PH39,酶催化的最適PH因供氫體不同而稍有差異，但多在PH5左右。酶溶于水和58%以下飽和度硫酸銨溶液。HRP的輔基和酶蛋白最大吸收光譜分別為403nm和275nm，一般以O(shè)D403nm /OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的純度。高純度的酶RZ值應(yīng)在3.0左右(最高可達3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。用途：1) RZ3 活性 250u/mg， 主要應(yīng)用于免疫學(xué)，是高純度的過氧化酶。采用特殊色譜純化技術(shù)以除去會影響免疫學(xué)反應(yīng)的同工酶B . 2) RZ2 活性 180u/mg ，主要應(yīng)用于臨床化學(xué)，我們的客戶也有將這個規(guī)格的產(chǎn)品應(yīng)用于免疫學(xué)研究的。此時，一個標準化的分析方法就變得尤為重要。 3) RZ1 活性 100u/mg，主要應(yīng)用于血糖試紙和尿液分析試紙。 4) RZ0.6 活性 60u/mg ，主要應(yīng)用于尿液分析試紙。 實驗原理：過氧化物酶催化以下反應(yīng)： 2 H2O2 O2+2H2O 這一類酶以鐵卟啉為輔基，所以屬血紅素蛋白質(zhì)類(hemeProteins)。過氧化物酶在生物界分布極廣，在細胞代謝的氧化還原過程中起重要的作用。 辣根過氧化物酶的作用機理可分以下幾步： 第一步，形成綠色有活性的酶一底物復(fù)合物： 第二步，復(fù)合物轉(zhuǎn)變成紅色有活性的復(fù)合物： 復(fù)合物+AH復(fù)合物+A （AH：表示還原型氫供體。） 第三步，復(fù)合物被還原，釋放出酶： 在一定程度上復(fù)合物可自發(fā)地分解成HRP和產(chǎn)物(P)，亦可與過量的過氧化氫形成無活性的復(fù)合物。 辣根過氧化物酶的活力測定方法有多種，主要原理介紹如下： 1、Rz值，提純工作的后幾步以及純酶溶液可用Rz值表明酶的純度。 403nm處的吸收代表血紅素輔基的吸收，275nm的吸收是蛋白質(zhì)的吸收，結(jié)晶的HRP的Rz值為3.04。測定時的酶濃度為1毫克蛋白/毫升。 2、愈創(chuàng)木酚法：測k4見反應(yīng)式(3)。以愈創(chuàng)木酚(鄰甲氧基酚，guaiacol)為氫給體，其反應(yīng)如下： 四鄰甲氧基連酚有色產(chǎn)物四鄰甲氧基連酚(E470nm = 26.6mM1cm1)生成的速度(dx/dt)與底物過氧化氫以及氫供體愈創(chuàng)木酚的濃度有關(guān)。方程如下： e酶濃度； 0氫供體起始濃度； x0為過氧化氫的起始濃度。 如果測定的條件選擇成k40k1x0，可以測得k1： 所以 所以： 測定過程中底物減少的速度。 本實驗是采用測定k4的方法來判斷酶的純度。 上述測定Rz值和k4值的方法雖然比較簡單，但都不能測得酶的實際活力單位。測定過氧化物酶的傳統(tǒng)方法是連苯三酚試驗法，以過氧化氫為底物，在酶作用下，連苯三酚可形成紅棓