生物：5.3《血紅蛋白的提取和分離》教案（新人教版選修1）.doc

世紀(jì)金榜 圓您夢想 課題3 血紅蛋白的提取和分離課題目標(biāo)（一）知識與技能1、嘗試從血液中提取和分離血紅蛋白2、了解色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理（二）過程與方法體驗血紅蛋白提取和分離的實驗的嚴(yán)格要求，注意按照操作提示進(jìn)行相關(guān)步驟課題重點凝膠色譜法的原理和方法課題難點 樣品的預(yù)處理；色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填教學(xué)過程（一）引入新課蛋白質(zhì)是生命活動的主要承擔(dān)者，是細(xì)胞內(nèi)含量最高的有機化和物。對蛋白質(zhì)的研究有助于人們對生命過程的認(rèn)識和理解。所以需要從細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)進(jìn)行研究。怎樣提取蛋白質(zhì)呢？（二）進(jìn)行新課1基礎(chǔ)知識蛋白質(zhì)的物化理性質(zhì)：形狀、大小、電荷性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)、親和力等千差萬別，由此提取和分離各種蛋白質(zhì)。11凝膠色譜法（分配色譜法）：（1）原理：（圖513a）分子量大的分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動快；分子量小的分子穿過多孔凝膠顆粒內(nèi)部，路程長，流動慢。（2）凝膠材料：多孔性，多糖類化合物，如葡聚糖、瓊脂糖。（3）分離過程：（圖513b）混合物上柱洗脫大分子流動快、小分子流動慢收集大分子收集小分子洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動。12緩沖溶液（1）原理：由弱酸和相應(yīng)的強堿弱酸鹽組成（如H2CO3NaHCO3，HCNaC，NaH2PO4/Na2HPO4等），調(diào)節(jié)酸和鹽的用量，可配制不同pH的緩沖液。（2）緩沖液作用：抵制外界酸、堿對溶液pH的干擾而保持pH穩(wěn)定。13凝膠電泳法：（1）原理：不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電量、形狀和大小不同，在電場中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場中的運動方向和運動速度不同。思考閱讀教材后，填寫下表：決定運動方向形成庫侖力形成阻力決定運動速率電荷性質(zhì)電荷量分子形狀分子大?。?）分離方法：瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺經(jīng)膠電泳等。（3）分離過程：在一定pH下，使蛋白質(zhì)基團(tuán)帶上正電或負(fù)電；加入帶負(fù)電荷多的SDS，形成“蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物”，使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大小。2實驗設(shè)計2.1蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為哪些基本步驟？樣品處理、粗分離、純化、純度鑒定。思考：是否所有種類的蛋白質(zhì)的提取和分離都是這樣的？為什么？不是。因為蛋白質(zhì)的來源和性質(zhì)不同，分離方法差別很大。2.2選擇實驗材料（1）你認(rèn)為鳥類血液和哺乳動物血液中，最好哪種血液來提取血紅蛋白？為什么？哺乳動物血液。因為該細(xì)胞中沒有細(xì)胞核，血紅蛋白含量高。（2）請閱讀教材，認(rèn)識哺乳動物血液組成及血紅蛋白性質(zhì)。并思考回答下列問題：血液由 和 兩部分組成。血細(xì)胞中 細(xì)胞數(shù)量最多，細(xì)胞的含量最高的化合物是 。該化合物是由 和 構(gòu)成的，其中每個亞基中都含有一個能與O2和CO2結(jié)合的 基團(tuán)。2.3從紅細(xì)胞中分離出血紅蛋白的過程為：洗滌紅細(xì)胞、釋放血紅蛋白、分離血紅蛋白、透析。洗滌紅細(xì)胞的目的是什么？除去血漿蛋白的雜蛋白，有利于后續(xù)步驟的分離純化。紅細(xì)胞的洗滌過程為血液檸檬酸鈉低速短時離心吸出上層血漿紅細(xì)胞5倍體積生理鹽水 緩慢攪拌10min低速短時離心吸出上清液反復(fù)洗滌直至上清液無黃色思考：加入檸檬酸鈉有何目的？為什么要低速、短時離心？為什么要緩慢攪拌？防止血液凝固；防止白細(xì)胞沉淀；防止紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。思考：你有什么方法將紅細(xì)胞中的血紅蛋白釋放出來？加入蒸餾水，用玻璃棒快速攪拌一段時間。補充：加入蒸餾水后紅細(xì)胞液體積與原血液體積要相同。加入甲苯的目的是溶解細(xì)胞膜，有利于血紅蛋白的釋放和分離。此時，紅細(xì)胞破碎混合液中不僅含有血紅蛋白，而且還含有細(xì)胞破碎物、脂質(zhì)、甲苯有機溶劑等。怎樣除去這些雜質(zhì)呢？由于它們的密度不同，科學(xué)家采取了離心分離的方法：紅細(xì)胞破碎混合液中速長時離心（2000c/min10min）濾紙過濾除去脂質(zhì)分液漏斗分離出血紅蛋白2.4如何除無機鹽離子和小分子有機物質(zhì)呢？。透析。半透膜的選擇透過性，大分子物質(zhì)不能通過半透膜，離子和小分子能夠通過半透膜。在透析過程中，血紅蛋白溶液中的離子和小分子不斷通過半透膜擴散進(jìn)入到pH7的磷酸緩沖液中。思考：為何使用pH7的磷酸緩沖液？為什么緩沖液量遠(yuǎn)多于血紅蛋白溶液量？維持血紅蛋白的正常特性。有利于雜質(zhì)分子充分地向外擴散。總結(jié)：通過以上四個基本過程，紅細(xì)胞中的血紅蛋白就被提取出來。但其中還含有其他種類的蛋白質(zhì)分子（如呼吸酶等）。怎樣將雜蛋白與血紅蛋白分離開來呢？我們來研究蛋白質(zhì)提取和分離的第二個步驟粗分離（凝膠色譜操作）。2.5凝膠色譜分離蛋白質(zhì)包括：制作色譜柱、裝填色譜柱、樣品加入和洗脫。根據(jù)教材圖519，說出制作色譜柱需要的材料。橡皮塞2個、打孔器、小刀、移液管、尼龍紗、尼龍網(wǎng)、玻璃管、尼龍管等。色譜柱的制作過程：準(zhǔn)備材料加工橡皮塞安裝色譜柱下面進(jìn)行第二步凝膠色譜柱的裝填。請閱讀教材：色譜柱的裝填過程。步驟操作要求操作要求色譜柱垂直固定在支架上計算稱量凝膠根據(jù)色譜柱體積計算凝膠用量配制懸浮液凝膠顆粒蒸餾水充分溶脹凝膠顆粒洗脫液沸水浴裝填懸浮液一次性緩慢倒入；輕輕敲打緩沖液洗滌平衡立刻用磷酸緩沖液洗滌平衡12h樣品加入和洗脫。其基本過程是：調(diào)節(jié)緩沖液面加入蛋白質(zhì)樣品調(diào)節(jié)緩沖液面洗脫收集分裝蛋白質(zhì)至此，血紅蛋白即可得到粗分離。在整個操作過程中，應(yīng)當(dāng)注意以下事項：（1）紅細(xì)胞的洗滌：洗滌次數(shù)不能過少；低速、短時離心。（2）凝膠的預(yù)處理：沸水浴法時間短，還能除去微生物和氣泡（3）色譜柱的裝填：裝填盡量緊密，降低顆粒間隙；無氣泡；洗脫液不能斷流。（4）色譜柱成功標(biāo)志：紅色區(qū)帶均勻一致地移動。（三）課堂總結(jié)、點評血紅蛋白的取和分離凝膠色譜法原理分離過程凝膠電泳法緩沖溶液組成作用蛋白質(zhì)的提取分離樣品處理粗分離純化純度鑒定血