色譜分析概論[1].ppt---盧佩章院士.ppt

色譜分析概論 第一節(jié)色譜法概述 一 色譜法的定義和用途二 色譜法的特點三 色譜法的起源四 色譜法的分類五 色譜法的發(fā)展 一 色譜法的定義及用途 定義 色譜法 chromatography 是一種物理或物理化學的分離分析方法 原理 利用物質在固定相和流動相中的分配系數(shù)不同 使混合物中的各組分分離 以前學過的分離方法有 1 沉淀法是利用物質溶解度的不同而進行分離 2 蒸餾法是利用有機物沸點的差異進行分離 3 萃取法是利用組分在水相和有機相 互不相溶 中的分配素數(shù)不同進行而分離 色譜法的用途 用途 色譜法已廣泛用于各個領域 是多組分混合物首選的分離分析方法 以 中國藥典 2005版為例 一部收載中藥1146個品種 用薄層色譜進行鑒別或含量測定的有1523項 用高效液相色譜進行定量分析的有479種518項 用氣相色譜進行檢測的有47種 二部收載的有1967個品種 采用高效液相色譜法的品種有848種 現(xiàn)在色譜法已形成一門專門的科學 二 色譜法的起源 1 創(chuàng)立 1906年 俄國植物學家Tsweet植物色素分離見圖示2 現(xiàn)狀 一種重要的分離 分析技術分離混合物各組分并加以分析 還可以進行制備固定相 除了固體 還可以是液體流動相 液體或氣體色譜柱 各種材質和尺寸被分離組分 不再僅局限于有色物質 碳酸鈣 固定相 色素混合液 石油醚 流動相 1906年 Tsweet發(fā)現(xiàn)色譜分離現(xiàn)象 色譜柱 植物色素分離圖示 三 色譜法的特點 優(yōu)點 三高 一快 一廣 缺點 高選擇性 高效能 高靈敏度 分析速度快 應用范圍廣 對未知物分析的定性專屬性差需要與其他分析方法聯(lián)用 GC MS LC MS 四 色譜法的分類 1 按兩相分子的聚集狀態(tài)分類 流動相固定相類型 超臨界流體色譜法 流動相為超臨界流體 色譜法分類 續(xù)前 2 按固定相的固定方式分類 3 按分離機制分類 分配色譜吸附色譜離子交換色譜空間排阻色譜毛細管電詠法毛細管電色譜法 毛細管電泳 色譜法分類 圖示 色譜法簡單分類 毛細管電泳法 五 色譜法的發(fā)展 1 歷史30年代茨維特分離綠葉色素 產(chǎn)生固液吸附色譜40年代液 液分配色譜法 TLC 紙色譜50年代GC出現(xiàn)使色譜具備分離和在線分析功能60年代推出了色譜 質譜聯(lián)用技術 GC MS 70年代HPLC出現(xiàn)使色譜分析范圍進一步擴大80年代出現(xiàn)了超臨界流體色譜法 毛細管電泳法90年代崛起的電色譜法 兼有毛細管電泳法與微微填充柱色譜法的優(yōu)點21世紀色譜科學將在生命科學等的前沿發(fā)揮他不可替代的重要作用 2 展望 新型固定相和檢測器手性固定相 浸透限制性固定相 灌注色譜固定相 生物色譜固定相等 蒸發(fā)光散射檢測器 色譜新方法的研究超臨界流體色譜法 毛細管電詠法 毛細管電色譜法 色譜聯(lián)用技術GC MS LC MS GC FTIR 色譜專家系統(tǒng)是一種色譜 計算機聯(lián)用技術 第二節(jié)色譜過程和基本原理 一 色譜過程 分離原理及特點二 色譜流出曲線和有關概念三 分配系數(shù)與色譜分離 一 色譜過程 分離原理及特點 色譜過程指被分離組分在兩相中的 分配 平衡過程 以吸附色譜為例見圖示吸附 解吸 再吸附 再解吸 反復多次洗脫 被測組分分配系數(shù)不同 差速遷移 分離 圖示 分配系數(shù)的微小差異 吸附能力的微小差異微小差異積累 較大差異 吸附能力弱的組分先流出 吸附能力強的組分后流出back 續(xù)前 色譜分離原理色譜分離基于各組分在兩相之間平衡分配的差異平衡分配可以用分配系數(shù)和分配比來衡量 色譜分離特點1 不同組分通過色譜柱時的遷移速度不等 提供了分離的可能性2 各組分沿柱子擴散分布 峰寬 不利于不同組分分離 二 色譜流出曲線和有關概念 色譜流出曲線和色譜峰 流出曲線 色譜圖 電信號強度隨時間變化曲線基線 無樣品時的電信號 反映儀器噪音的情況色譜峰 流出曲線上突起部分 圖17 2 續(xù)前 對稱因子 正常峰 對稱 非正常峰前沿峰拖尾峰 色譜峰 fs 0 95 1 05 fs 0 95 fs 1 05 二 保留值 色譜定性參數(shù) 1 保留時間 tR 從進樣開始到組分出現(xiàn)濃度極大點時所需時間 即組分通過色譜柱所需要的時間2 死時間 t0 不被固定相溶解或吸附的組分的保留時間 即 分配系數(shù)為零的組分 3 調整保留時間 tR 組分的保留時間與死時間之差值 即組分在固定相中滯留的時間 圖片 4 保留體積 VR 從進樣開始到組分出現(xiàn)濃度極大點時所消耗的流動相的體積 5 死體積 V0 由進樣器至檢測器的流路中未被固定相占有的空間 6 調整保留體積VR 保留體積與死體積之差 即組分停留在固定相時所消耗流動相的體積 7 相對保留值ri s 選擇性系數(shù) 調整保留值之比 8 保留指數(shù)Ix 指將待測物的保留行為換算成相當于正構烷烴的保留行為 已知范圍內組分的定性參數(shù) Ix 待測組分的保留指數(shù) z與z n為一對正構烷烴的含C數(shù) 一般n為1 t R X 應介于t R Z 和t R Z n 之間 三 色譜峰高和峰面積 2 峰面積A 指色譜曲線與基線間包圍的面積 1 峰高h 指組分在柱后出現(xiàn)濃度極大時的檢測信號 即色譜峰頂至基線的距離 四 色譜峰區(qū)域寬度 色譜柱效參數(shù) 3 峰寬W 正態(tài)分布色譜曲線兩拐點切線與基線相交的截距 1 標準差 正態(tài)分布色譜曲線兩拐點距離的一半 對應0 607h處峰寬的一半注 小 峰 窄 柱效 高2 半峰寬W1 2 峰高一半處所對應的峰寬 注 除了用于衡量柱效 還可以計算峰面積 圖示 五 分離度R 分辨率 相臨兩組分間峰頂間距離是峰底寬平均值的幾倍 衡量色譜分離條件優(yōu)劣的參數(shù) 討論 三 分配系數(shù)與色譜分離 分配系數(shù)和容量因子 相平衡參數(shù) 1 分配系數(shù)K 平衡常數(shù) 指在一定溫度和壓力下 組分在色譜柱中達分配平衡后 在固定相與流動相中的濃度比 色譜過程的相平衡參數(shù) 注 K為熱力學常數(shù)與組分性質 固定相性質 流動相性質及溫度有關實驗條件固定 K僅與組分性質有關 2 容量因子k 容量比 分配比 指在一定溫度和壓力下 組分在色譜柱中達分配平衡時 在固定相與流動相中的質量比 3 分配系數(shù)與容量因子的關系 二 分配系數(shù)和容量因子與保留時間的關系 保留比R 衡量溶質分子在色譜柱上相對移行速度 續(xù)前 設R為單位時間內一個分子在流動相中出現(xiàn)的幾率 設1 R為單位時間內一個分子在固動相中出現(xiàn)的幾率 續(xù)前 討論 色譜條件一定時 tR主要取決K的大小 色譜法基本的定性參數(shù) K tR 組分后出柱K 0 組分不保留K 組分完全保留 三 色譜分離前提 結論 各組分分配系數(shù)K或容量因子k不等是分離的前提 選擇合適分離條件使得難分離的組分K不等而分離 組分一定時 改變流動相 固定相和溫度 可改變K 第三節(jié)基本類型色譜法的分離機制 根據(jù)色譜法的作用機制不同 有多種類型色譜方法 以下列四種為基本類型 一 分配色譜法二 吸附色譜法三 離子交換色譜法四 空間排阻色譜法 一 分配色譜法 1 分離原理 將液體均勻地涂漬在惰性物質 載體 表面上作為固定相 利用被分離組分在固定相與流動相中的溶解度差別所造成的分配系數(shù)差別而被分離 見圖示 狹義分配系數(shù) 注 K與組分的性質 流動相的性質 固定相的性質以及柱溫有關next 圖示 分離機制利用組分在流動相和固定相間溶解度差別實現(xiàn)分離 連續(xù)萃取過程back 2 固定相和流動相 要求 固定相 機械吸附在惰性載體上的液體 常用的固定液有水 稀硫酸 甲醇 甲酰胺等強極性溶劑載體 惰性物質 無吸附性性質穩(wěn)定 不與固定相和流動相發(fā)生化學反應常用的有吸水硅膠 纖維素 多孔硅藻土等 流動相 必須與固定相不為互溶石油醚 醇類 酮類 酯類 鹵代烷及苯等 3 洗脫順序 正相色譜固定相極性大于流動相極性 主要分離極性樣品 極性弱的組分先被洗脫 極性強的組分后被洗脫 反相色譜固定相極性小于流動相極性 主要分離非極性樣品和中等極性樣品 極性強的組分先出柱 極性弱的組分后出柱 1 分離原理各組分與流動相分子爭奪吸附劑表面活性中心 利用吸附劑對不同組分的吸附能力差異而實現(xiàn)分離 經(jīng)過吸附 解吸 再吸附 再解吸 最后混合物得到分離 見圖示吸附平衡Xm nYa Xa nYm 吸附系數(shù) 二 吸附色譜法 注 Ka與組分的性質 吸附劑的活性 流動相的性質及溫度有關next 流動相的量很大 常數(shù) 圖示 a 吸附劑m 流動相Xm 流動相中的組分分子Xa 固定相中組分的分子Ym 流動相分子Ya 固定相中溶劑分子 吸附過程是試樣中組分分子與流動相分子爭奪吸附劑表面活性中心的過程 back m 2 固定相及其選擇 固定相是表面具有許多吸附中心的吸附劑 常用吸附劑硅膠表面的硅醇基為吸附中心 經(jīng)典液相柱色譜和薄層色譜使用一般硅膠 高效液相色譜常用球型或無定型全多孔硅膠和堆積硅珠 1 對吸附劑的要求 有大的表面積和足夠的吸附能力 對不同的化學成分有不同的吸附力 能較好地把混合物分開 與流動相 溶劑及樣品中各成分不起化學反應 在所用的溶劑及流動相中不溶解 顆粒均勻 操作過程中不會碎裂 2 吸附劑的類別 有機類淀粉 葡萄糖 聚酰胺 纖維素等 無機類氧化鋁 硅膠 活性炭 碳酸鈣 硅藻土等 3 吸附劑的活度因含水使吸附劑活度 含水量 活性 活度 級別 活性 4 吸附劑的選擇 a硅膠 為首選吸附劑 本身具微酸性 適用于分離酸性及中性物質 如有機酸 氨基酸 甾體等 nextb氧化鋁 氧化鋁具有分離能力強 活性可以控制等優(yōu)點 堿性氧化鋁pH9 10適于分析堿性 中性物質中性氧化鋁pH7 5適于分析酸性堿性和中性物質酸性氧化鋁pH4 5適于分析酸性 中性物質C聚酰胺 氫鍵作用 氫鍵能力 強 組分越后出柱 分離極性小的物質 一般選用活性大些的吸附劑 反之 分離極性大的物質 選用活性小的吸附劑 next 硅膠 SiO2 H2O 結構 內部 硅氧交聯(lián)結構 多孔結構表面 有硅醇基 氫鍵作用 吸附活性中心 特性 1 與極性物質或不飽和化合物形成氫鍵物質極性 吸附能力 強極性吸附中心 不易洗脫吸附活性次序 活潑型 束縛型 游離型2 吸水 失活 105 110OC烘干30分鐘 可逆失水 吸附力最大 500OC烘干 不可逆失水 活性喪失 無吸附力 適用 分析酸性或中性物質back 3 流動相及其選擇 1 要求 應使用較純試劑 含雜質會影響洗脫能力 與樣品或吸附劑不發(fā)生化學反應 能溶解樣品中各成分 且各被分離組分有不同的K值 粘度小 易流動 2 流動相流動相的洗脫能力主要由其極性決定 極性強的流動相分子占據(jù)極性中心的能力強 洗脫能力就強 流動相的選擇要依據(jù)樣品的極性 吸附劑的活性而定 3 常用溶劑的極性 石油醚 環(huán)己烷 二硫化碳 四氯化碳 三氯乙烷 苯 甲苯 二氯甲烷 乙醚 氯仿 乙酸乙酯 正丁醇 丙酮 乙醇 甲醇 吡啶 酸 水 4 流動相的選擇用硅膠或氧化鋁作色譜分離時 如被測成分極性較大 用活性較低的吸附劑 極性較大的沖洗劑 被測成分極性較小 選用活性較強的吸附劑 極性較小的沖洗劑 4 洗脫順序 吸附弱的組分先被洗脫 吸附強的組分后被洗脫 吸附的強弱與組分的性質 極性 取代基的類型和數(shù)目 構型 有關 一般規(guī)律是 非極性化合物 吸附弱 基本母核相同 分子中取代基的極性越強 或極性基團越多 分子極性越強 但要考慮其他因素的影響 吸附能力越強 分子中雙鍵數(shù)越多 則吸附力越強 能形成分子內氫鍵的化合物 其吸附能力降低 常見化合物的吸附能力的順序如下 烷烴 CH3 CH2 C O 醛類 CHO 硫醇 SH 胺類 NH2 酰胺 NHCOCH3 醇類 OH 酚類 Ar OH 羧酸類 COOH 三 離子交換色譜法 要求 固定相 離子交換樹脂流動相 水為溶劑的緩沖溶液被分離組分 離子型的有機物或無機物1 分離原理見圖示 選擇性系數(shù) 陽離子交換樹脂RSO3 H X RSO3 X H 注 Ks與離子的電荷數(shù) 水合離子半徑 流動相性質 離子交換樹脂性質以及溫度有關next 圖示 分離機制 依據(jù)被測組分與離子交換劑交換能力 親和力 不同而實現(xiàn)分離back E 離子交換劑 流動相 可交換離子 固定離子 2 固定相和流動相 固定相是離子交換劑 常見的是離子交換樹脂 是具有網(wǎng)狀立體結構高分子的聚合物 如 苯乙烯和二乙烯苯聚合 其中二乙烯苯是交聯(lián)劑 交聯(lián)度 degreeofcrosslinking 指交聯(lián)劑在原料中所占總重量的百分比理論交換容量 exchangecapacity 每克干樹脂能交換離子的毫摩爾數(shù)粒度 指離子交換樹脂顆粒的大小 一般以溶脹態(tài)所能通過的篩孔來表示 流動相 水 緩沖溶液 或加入少量的乙醇 四氫呋喃 乙腈等有機溶劑 提高選擇性 3 影響保留行為的因素 1 溶質離子的電荷和水合半徑 價態(tài)高 K大 同價離子 水合離子半徑增大 K小 常見陽離子在交換樹脂上的交換順序是 Fe3 A13 Ba2 pb2 Sr2 Ca2 Ni2 Cd2 Cu2 C02 Mg2 Zn2 Mn2 Ag Cs Rb K NH4 Na H Li 常見陰離子在交換樹脂上的交換順序通常為 檸檬酸根 P043 S042 I NO3 SCN NO2 C1 HCO3 CH3COO OH F 續(xù)前 2 離子交換劑的交聯(lián)度和交換容量 在一定的范圍內樹脂的交聯(lián)度越大 交換容量越大 則組分的保留時間越長 3 流動相的組成和pH 交換能力強的離子組成的流動相有較強的洗脫能力 強離子交換樹脂的交換容量不隨流動相的pH變化 調節(jié)pH值的主要作用是控制弱電解質離解 四 空間排阻色譜法 要求 固定相 多孔性凝膠流動相 水 凝膠過濾色譜流動相 有機溶劑 凝膠滲透色譜分離機制見圖示 滲透系數(shù) 注 Kp僅取決于待測分子尺寸和凝膠孔徑大小 與流動相的性質無關 當KP 1時 分子能進入所有的孔隙 KP 0時 分子不能進入任何孔隙 next 圖示 分離機制 利用被測組分分子大小不同 在固定相上選擇性滲透實現(xiàn)分離back 2 固定相和流動相 固定相多孔凝膠 主要性能參數(shù)是 平均孔徑 凝膠孔徑大小 排斥極限 不能滲透進入凝膠的任何孔隙的某分子量 KP 0 分子量范圍 排斥極限 KP 0 與全滲透點 KP 1 之間的分子量范圍 選擇凝膠時應使試樣的分子量落入此范圍 流動相要選對樣品的溶解好 又能潤濕凝膠 粘度要低的溶劑 否則 會限制分子擴散而影響分離效果 一般水溶性試樣選水溶液 非