植物細(xì)胞組織培養(yǎng)技術(shù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書.doc

T 植物細(xì)胞組織培養(yǎng)技術(shù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書中國計(jì)量學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院二零零六年七月植物細(xì)胞組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)目 錄實(shí)驗(yàn)一、植物組織培養(yǎng)培養(yǎng)基母液的配制實(shí)驗(yàn)二、植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基配制 實(shí)驗(yàn)三、康乃馨的離體快繁實(shí)驗(yàn)四、胡蘿卜愈傷組織的建立實(shí)驗(yàn)五、組織培養(yǎng)物的繼代培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)一 組織培養(yǎng)基母液的配制一、 儀器及藥品冰箱、天平（0.0001g）容量瓶: 1000 ml, 500 ml、250 ml、100 ml、25 ml廣口儲(chǔ)液瓶：500 ml、250 ml、50 ml、25 ml燒杯：1000 ml 、500 ml 、250 ml、100 ml 、50 ml數(shù)十根玻璃攪棒、大藥勺、小藥勺或挖耳勺標(biāo)簽紙、膠水、50%酒精、95%酒精、1 mol/L鹽酸、1 mol/L NaOH幾種常用的培養(yǎng)基所需的大量元素、微量元素、有機(jī)物、激素、鐵鹽等藥品蒸餾水二、方法和步驟：按照培養(yǎng)基配方,把大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)物、植物激素分類,每一類中各種藥品分別稱量,如N6培養(yǎng)基各種母液的配制步驟如下：大量元素母液：包括用量較大的幾種化合物見N6培養(yǎng)基配方，按表中排列順序,將每種藥品的用量擴(kuò)大10倍，分別稱取，分別溶解，然后按照順序混合在一起。如鈣鹽等易發(fā)生沉淀的藥品不能混合，應(yīng)單位定容，最后加上蒸餾水，定容至1升或500毫升。在定容時(shí)注意用蒸餾水洗凈燒杯和玻璃攪棒以減少誤差。定容后的溶液為大量元素母液，配制培養(yǎng)基時(shí)，每配1 L培養(yǎng)基需吸取該母液l00 ml或50 ml。微量元素母液：因用量少，為了稱量精確和方便,常配成 100倍或1000倍的母液，即每種藥品擴(kuò)大l00倍或者l000倍。逐個(gè)溶解，混合在一起成為微量元素母液，每配1 L N6培養(yǎng)基需吸取該母液10 ml或者1 ml。鐵鹽：在N6培養(yǎng)基中需要單獨(dú)配制，它是由硫酸亞鐵（FeSO47H2O）2.78 g和乙二氨四乙酸二鈉（Na2-EDTA）3.73 g，分別溶解，混合后，用酒精燈加熱半小時(shí)以上，冷卻后定容至1 L。冰箱過夜貯藏?zé)o結(jié)晶析出，否則重新配制。每配l升N6培養(yǎng)基需加該鐵鹽母液5 ml。有機(jī)物質(zhì)：主要指氨基酸，維生素類物質(zhì)。它們大都是擴(kuò)大1000倍，分別稱量，分別定容和儲(chǔ)存，配制培養(yǎng)基時(shí)按需要的量加入。植物激素：常用的有生長素類如：2,4-D、 萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）；細(xì)胞分裂素類：激動(dòng)素（KT）、6-芐基氨基嘌呤（6-BA）、玉米素（ZT）。配制時(shí)需要單個(gè)稱量，根據(jù)需要可分別用酸、堿或酒精等不同的溶劑溶解后 ,再用蒸餾水配制成所需的濃度，一般為每ml含 0.1-2 mg，配制培養(yǎng)基時(shí)按所需要的量分別加入，本實(shí)驗(yàn)中的2,4-D和6-BA均配成1 mg/ml的母液。在配制吲哚乙酸（IAA）母液時(shí)，先用幾滴95%酒精溶解完全后，加蒸餾水定容，否則會(huì)發(fā)生沉淀。而配制6-BA母液時(shí)，要用少量的1 mol/L NaOH溶解；而配制2,4-D時(shí)，可先用少量的95%酒精溶解。表1N6朱至清(1975)培養(yǎng)基配方藥品名配方量(mg/L)母液倍數(shù)稱取量(g/L)(NH4)2SO4大量元素463104.63KNO32 83028.3CaCl22H2O1661.66MgSO47H2O1851.85KH2PO44004.0Na2- EDTA鐵鹽37.31003.73FeSO47H2O27.82.78MnSO44H2O微量元素4.010004.0ZnSO47H2O3.83.8H3BO31.61.6KI0.80.8鹽酸硫胺素(VB1)有機(jī)物質(zhì)110001.0煙酸0.50.5鹽酸吡哆醇(VB6)0.50.5甘氨酸2.02.0各種母液配制好后，要貼好標(biāo)簽，注明母液的名稱，配制1 L培養(yǎng)基需要的吸取量、母液配制的日期，然后放入冰箱中儲(chǔ)存。一般無機(jī)物質(zhì)的母液在冰箱中可保存半年以上，有機(jī)物質(zhì)的母液保存時(shí)間在半年以內(nèi)，但若發(fā)現(xiàn)有沉淀或霉變,應(yīng)立即需重新配制。三、注意事項(xiàng)1. 如藥品所帶結(jié)晶水不同，應(yīng)進(jìn)行換算。2. 因常用的MS培養(yǎng)基中硝酸銨(NH4NO3)屬于公安部門嚴(yán)格限制管理的藥品，所以本實(shí)驗(yàn)采用N6培養(yǎng)基替代MS培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)二 培養(yǎng)基的配制一、儀器設(shè)備及試劑 電爐天平（0.0001 g）高壓滅菌鍋量筒：l0 ml、20 ml、100 ml、500 ml燒杯：1000 ml、500 ml、250 ml移液管：1 ml、2 ml、 5 ml吸管若干、記號筆三角瓶或試管、試管架錫鉑紙、玻璃棒配制好的各種母液，如大量元素母液、微量元素母液、鐵鹽、有機(jī)物、生長調(diào)節(jié)劑等，個(gè)別生長調(diào)節(jié)劑要隨配隨用。蒸餾水、pH試紙蔗糖、瓊脂 等1 mol/L NaOH 溶液、1 mol/L HCl溶液 。二、方法和步驟 1 量取所配培養(yǎng)基總體積的2/3體積的蒸餾水，如要配l升培養(yǎng)基, 先量取約700 ml體積的水。2 根據(jù)培養(yǎng)基配方， 用量筒量取所需要的各種元素的母液。物質(zhì)加入體積或重量大量元素母液(10)100ml微量元素母液(1000)1 ml有機(jī)物質(zhì)母液(1000)1 ml鐵鹽母液(1000)10 ml蔗糖30 g瓊脂8 g吸取母液時(shí)，注意應(yīng)先將幾種母液按順序排好，不要弄錯(cuò)以免使培養(yǎng)基中藥品成分發(fā)生改變。在培養(yǎng)不同的外植體時(shí)，應(yīng)加入不同的激素，如本實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)康乃馨側(cè)芽或莖段時(shí)就加入1ml的1 mg/ml的6-BA；而另一個(gè)實(shí)驗(yàn)胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)中應(yīng)加入2ml的1 mg/ml的2,4-D。加入一種母液后應(yīng)先攪拌均勻，避免因不均而使局部濃度過高而引起沉淀，瓊脂可于加入蔗糖調(diào)節(jié)完pH值后再加入，此時(shí)應(yīng)注意攪拌，以免瓊脂或蔗糖沉淀于燒杯底而炭化。加熱至沸騰片斷，以使瓊脂充分溶解，檢查時(shí)可注意燒杯內(nèi)溶液是否透明。3 調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值，用pH計(jì)或pH試紙測定培養(yǎng)基的pH按照培養(yǎng)材料的要求分別用1 mol/L NaOH溶液、1 mol/L HCl溶液來調(diào)節(jié)所配制培養(yǎng)基的pH值，一般培養(yǎng)基的pH值約為5.8，培養(yǎng)的材料不同，對培養(yǎng)基的pH值要求也不同。4 分裝 將配制好的培養(yǎng)基分別裝在事先洗凈的三角瓶，用錫鉑紙封口，注明標(biāo)簽，然后和用牛皮紙或報(bào)紙包好的培養(yǎng)皿及用三角瓶裝好的蒸餾水一道進(jìn)行高壓滅菌。5 培養(yǎng)基的滅菌 一般用手提式醫(yī)用高壓鍋來滅菌（方法略），本實(shí)驗(yàn)采用全自動(dòng)高壓滅菌鍋。6 培養(yǎng)基的保存 消毒過的培養(yǎng)基通常放在接種室或培養(yǎng)室中保存，一般 應(yīng)在消毒后的兩周內(nèi)用完，最好不要超過一個(gè)月。 三、注意事項(xiàng)激素應(yīng)在調(diào)節(jié)pH之前加入，因?yàn)橛行┘に厥怯盟峄驂A溶解的，在調(diào)節(jié)pH好之后加入會(huì)改變pH值。pH過酸或過堿對培養(yǎng)基均是不利的，會(huì)導(dǎo)致過軟或過硬的結(jié)果，從而影響培養(yǎng)質(zhì)量。在本次實(shí)驗(yàn)中將下次實(shí)驗(yàn)所需的其它材料一同滅菌處理。實(shí)驗(yàn)三 康乃馨的離體快繁一、 儀器設(shè)備和試劑超凈工作臺(tái)、帶有吸水紙的成套的培養(yǎng)皿，無菌水培養(yǎng)基 N6+1 mg/L 6-BA剪刀、槍型鑷子量筒、酒精燈、濾紙、蒸餾水、小刷子95%乙醇、70%酒精、70%酒精棉球、0.2%升汞、甲醛、高錳酸鉀、來蘇爾紗布、棉塞、牛皮紙、才培純、肥皂、酒精噴壺植物的嫩莖、側(cè)芽、莖尖、葉片、花、愈傷組織上的不定芽、胚狀體、試管苗等二、實(shí)驗(yàn)材料 康乃馨枝條三、方法和步驟1 外植體滅菌 取從市場上購買的康乃馨枝條，去掉大的葉片，剪取帶腋芽的節(jié)結(jié)，用肥皂（洗潔精）清洗表面，再用自來水沖洗 30-60分鐘，然后在無菌室（超凈工作臺(tái)）內(nèi)用70%酒精浸沒20-40秒鐘（根據(jù)材料的木質(zhì)化程度掌握具體的浸沒時(shí)間。用0.2% 的升汞溶液浸泡10-15分鐘，再用無菌水沖洗3-4次，放入已滅菌的培養(yǎng)皿中的濾紙上待用。2 接種 先進(jìn)行無菌室內(nèi)消毒，用紫外燈照射30-45分鐘，地面用低濃度的來蘇爾溶液消毒，紫外燈關(guān)閉約20分鐘后方可進(jìn)去工作。超凈工作臺(tái)消毒 開啟無菌風(fēng)開關(guān)，讓無菌風(fēng)吹上30-45分鐘后方可工作。并用70% 的酒精棉球擦凈工作臺(tái)。接種時(shí)先點(diǎn)燃酒精燈，鑷子和剪刀都要先浸泡在70%的酒精溶液中。用酒精燈上灼燒好冷卻后的鑷子、剪刀取出一個(gè)側(cè)芽或小段莖，迅速打開三角瓶口，將材料才插入瓶內(nèi)，注意材料上下端的極性，不能倒插。在酒精燈邊塞回錫箔紙，用記號筆在瓶體上寫明日期和材料。3 培養(yǎng)條件： 25光照13小時(shí)/天 光強(qiáng)1000 Lux4 繼代培養(yǎng)（見下一個(gè)實(shí)驗(yàn)）5 誘導(dǎo)生根：用低濃度的吲哚乙酸或者萘乙酸或無激素的N6培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根6 試管苗移栽參見有關(guān)其它實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)四 胡蘿卜愈傷組織的建立一、 材料和設(shè)備超凈工作臺(tái)或者無菌接種室培養(yǎng)基 N6+2 mg/L 2,4-D帶有吸水紙的成套的培養(yǎng)皿，無菌水解剖刀、槍型鑷子、刀片無病蟲的胡蘿卜直根數(shù)十個(gè)消毒劑 0.2%的升汞溶液70%酒精、95%酒精及70%的酒精棉球l000毫升的玻璃燒杯數(shù)個(gè)、酒精燈、火柴、記號筆、小刷子（可用一次性牙刷）二、實(shí)驗(yàn)材料 新鮮胡蘿卜、胡蘿卜愈傷組織三、實(shí)驗(yàn)步驟1 選擇無傷、無病、形狀較規(guī)則的胡蘿卜，用小刷子在流動(dòng)的自來水下洗刷胡蘿卜，除凈表面所有的泥屑?？梢愿鶕?jù)實(shí)驗(yàn)的時(shí)期，選用其它的實(shí)驗(yàn)材料。2 將胡蘿卜切成大約 40 mm厚的片段,放入100或500 ml的燒杯中，倒入消毒液，將植物材料覆蓋、浸泡10-30 min。在滅菌過程中，在每個(gè)材料上做好標(biāo)記，并對應(yīng)地放在預(yù)接種的培養(yǎng)基邊上。接種后在培養(yǎng)瓶上標(biāo)明培養(yǎng)物名稱和培養(yǎng)日期。 3 在超凈工作臺(tái)上，倒掉消毒液，用無菌水沖洗3-5次，以便去除殘留的消毒液。4 取消毒過的胡蘿卜放入已滅菌的帶有濾紙的培養(yǎng)皿中，用無菌解剖刀從兩端各切去10毫米，再將留下的胡蘿卜直根切成一系列一毫米厚的橫切片。取其中的一片轉(zhuǎn)到另一個(gè)已滅菌的帶有吸水紙的培養(yǎng)皿中，再將每一片切成小塊，使其每個(gè)小塊上均包含木質(zhì)部、形成層和韌皮部，外植體的大小要盡量一致。5 接種 取下培養(yǎng)瓶的塞子（或錫鉑紙），用火灼燒瓶口2 cm處，手持培養(yǎng)瓶呈45角，用消毒鑷子把4-8塊外植體轉(zhuǎn)到瓊脂培養(yǎng)基的表面，注意把靠近根尖的一面接觸培養(yǎng)基。然后立即將燒過的封口棉塞或錫鉑紙封住瓶口。每兩次轉(zhuǎn)移之間都要用酒精燈灼燒鑷子，防止帶菌。 6 培養(yǎng) 接種好的外植體在25的培養(yǎng)箱中，黑暗條件下培養(yǎng)四周左右就會(huì)形成一塊較大的愈傷組織。實(shí)驗(yàn)五 組織培養(yǎng)物的繼代培養(yǎng)一、 材料和設(shè)備材料 從培養(yǎng)4-6周的外植體上長出的愈傷組織、叢生芽或胚狀體超凈工作臺(tái)培養(yǎng)基N6+0.5 mg/L 2,4-D N6+2 mg/L 6-BA（也可以自已設(shè)計(jì)）三角瓶、帶有吸水紙的成套的培養(yǎng)皿、鑷子、解剖刀70%酒精、95%酒精及70%的酒精棉球酒精燈、火柴、記號筆、酒精噴壺二、方法步驟1 取材 在無菌室的超凈工作臺(tái)內(nèi)，每次取一瓶培養(yǎng)物，灼燒培養(yǎng)瓶口約20 毫米處，用灼燒冷卻后的鑷子和解剖刀，取出外植體或者愈傷組織放在無菌的培養(yǎng)皿中。每個(gè)培養(yǎng)皿中約放4-6個(gè)外植體或者愈傷組織。把每塊愈傷組織分成兩、三個(gè)不小于5 mm見方的小塊。外植體下面向著中心的細(xì)胞常呈壞死狀,不適宜作繼代培養(yǎng)。這些壞死的部分應(yīng)當(dāng)與正常的部分分離并棄去。每次操作后要去掉用過的吸水紙并重新蓋上培養(yǎng)皿的蓋子。2 繼代轉(zhuǎn)接 將正在發(fā)育的外植體或愈傷組織轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上，接種方法同前。轉(zhuǎn)接后在培養(yǎng)瓶上寫明培養(yǎng)物、培養(yǎng)基、日期。長期培養(yǎng)的胡蘿卜組織會(huì)產(chǎn)生大塊愈傷組織。正在發(fā)育的愈傷組織作第一次繼代培