培養(yǎng)基的制備與滅菌.doc

資料收集于網(wǎng)絡(luò) 如有侵權(quán)請聯(lián)系網(wǎng)站 刪除 謝謝 實(shí)驗(yàn)八 培養(yǎng)基的制備與滅菌一、目的要求1. 掌握微生物實(shí)驗(yàn)室常用玻璃器皿的清洗及包扎方法。2. 掌握培養(yǎng)基的配置方法。3. 掌握干熱滅菌和高壓蒸汽滅菌的操作方法。二、基本原理 正確掌握培養(yǎng)基的配制方法是從事微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)工作的重要基礎(chǔ)。由于微生物種類及代謝類型的多樣性因而用于培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基的種類也很多，它們的配方及配制方法雖各有差異。但一般培養(yǎng)基的配制程序卻大致相同例如器皿的準(zhǔn)備，培養(yǎng)基的配制與分裝，棉塞的制作，培養(yǎng)基的滅菌，斜面與平板的制作以及培養(yǎng)基的無菌檢查等基本環(huán)節(jié)大致相同。三、實(shí)驗(yàn)材料1. 藥品：待配各種培養(yǎng)基的組成成分、瓊脂、1mol/L的NaOH和HCl溶液。2. 儀器及玻璃器皿：天平、高壓蒸汽滅菌鍋、移液管、試管、燒杯、量筒、三角瓶、培養(yǎng)皿、玻璃漏斗等。3. 其他物品：藥匙、稱量紙、pH試紙、記號筆、棉花等。四、操作步驟（一）玻璃器皿的洗滌和包裝1玻璃器皿的洗滌玻璃器皿在使用前必須洗刷干凈。將三角瓶、試管、培養(yǎng)皿、量筒等浸入含有洗滌劑的水中用毛刷刷洗，然后用自來水及蒸餾水沖凈。移液管先用含有洗滌劑的水浸泡，再用自來水及蒸餾水沖洗。洗刷干凈的玻璃器皿置于烘箱中烘干后備用。2滅菌前玻璃器皿的包裝（1） 培養(yǎng)皿的包扎：培養(yǎng)皿由一蓋一底組成一套，可用報(bào)紙將幾套培養(yǎng)皿包成一包，或者將幾套培養(yǎng)皿直接置于特制的鐵皮圓筒內(nèi)，加蓋滅菌。包裝后的培養(yǎng)皿須經(jīng)滅菌之后才能使用。圖8-1 移液管的包扎（2） 移液管的包扎：在移液管的上端塞入一小段棉花(勿用脫脂棉)，它的作用是避免外界及口中雜菌進(jìn)入管內(nèi)，并防止菌液等吸入口中。塞入此小段棉花應(yīng)距管口約0.5cm左右，棉花自身長度約11.5cm。塞棉花時(shí)可用一外圍拉直的曲別針、將少許棉花塞入管口內(nèi)。棉花要塞得松緊適宜，吹時(shí)以能通氣而又不使棉花滑下為準(zhǔn)。先將報(bào)紙裁成寬約5cm左右的長紙條，然后將已塞好棉花的移液管尖端放在長條報(bào)紙的一端，約成45角，折疊紙條包住尖端，用左手握住移液管身，有手將移液管壓緊在桌面上向前搓轉(zhuǎn)，以螺旋式包扎起來。上端剩余紙條，折疊打結(jié)，準(zhǔn)備滅菌。（二）液體及固體培養(yǎng)基的配制過程1液體培養(yǎng)基配制1) 稱量：一般可用0.01g天平稱量配制培養(yǎng)基所需的各種藥品，先按培養(yǎng)基配方計(jì)算出各成分的用量然后進(jìn)行準(zhǔn)確稱量。2) 溶解：將稱好的藥品置于一燒杯中，先加入少量水(根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要可用自來水或蒸餾水)，用玻璃棒攪動(dòng)，加熱溶解。3) 定容：待全部藥品溶解后，倒入一量筒中，加水至所需體積。如某種藥品用量太少時(shí)，可預(yù)先配成較濃溶液，然后按比例吸取一定體積溶液，加入至培養(yǎng)基中。4) 調(diào)pH：一般用pH試紙測定培養(yǎng)基的pH。用剪刀剪出一小段pH試紙，然后用鑷子夾取此段pH試紙，在培養(yǎng)基中蘸一下，觀看其pH范圍，如培養(yǎng)基偏酸或偏堿時(shí)，可用1mol/L NaoH或1mol/L HCl溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)pH時(shí)，應(yīng)逐滴加入NaOH或HCI溶液，防止局部過酸或過堿，破壞培養(yǎng)基中成分。邊加邊攪拌，并不時(shí)用pH試紙測試，直至達(dá)到所需pH為止。5) 過濾：用濾紙或多層紗布過濾培養(yǎng)基。一般無特殊要求時(shí)，此步可省去。2固體培養(yǎng)基的配制 配制固體培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)將已配好的液體培養(yǎng)基加熱煮沸，再將稱好的瓊脂(1.52)加入，并用玻棒不斷攪拌，以免糊底燒焦。繼續(xù)加熱至瓊脂全部融化，最后補(bǔ)足因蒸發(fā)而失去水分。（三）培養(yǎng)基的分裝 根據(jù)不同需要，可將已配好培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶內(nèi)，分裝時(shí)注意不要使培養(yǎng)基沾污管口或瓶口，造成污染。如操作不小心，培養(yǎng)基沾污管口或瓶口時(shí)，可用鑷子夾一小塊脫脂棉，擦去管口或瓶口的培養(yǎng)基，并將脫脂棉棄去。1試管的分裝取一個(gè)玻璃漏斗，裝在鐵架上，漏斗下連一根橡皮管，橡皮管下端再與另一玻璃管相接，橡皮管的中部加一彈簧夾。分裝時(shí)，用左手拿住空試管中部，并將漏斗下的玻璃管嘴插入試管內(nèi)，以右手拇指及食指開放彈簧夾，中指及無名指夾佐玻璃管嘴，使培養(yǎng)基直接流入試管內(nèi)。裝入試管培養(yǎng)基的量視試管大小及需要而定，若所用試管大小為15150 mm時(shí)，液體培養(yǎng)基可分裝至試管高度14左有為宜；如分裝固體或半固體培養(yǎng)基時(shí)，在瓊脂完全融化后，應(yīng)趁熱分裝于試管中。用于制作斜面的固體培養(yǎng)基的分裝量為管高15(約34mI)，半固體培養(yǎng)基分裝量為管高的13為宜。2三角瓶的分裝圖8-2培養(yǎng)基的分裝 用于振蕩培養(yǎng)微生物時(shí)，可在250 m1三角瓶中加入50 m1的液體培養(yǎng)基；若用于制作平板培養(yǎng)基用時(shí)，可在250 m1三角瓶中加入150ml培養(yǎng)基，然后再加入3g瓊脂粉(按2計(jì)算)，滅菌時(shí)瓶中瓊脂粉同時(shí)被融化。（四）棉塞的制作及試管、三角瓶的包扎 為了培養(yǎng)好氣性微生物，需提供優(yōu)良通氣條件，同時(shí)為防止雜菌污染，則必須對通入試管或三角瓶內(nèi)空氣預(yù)先進(jìn)行過濾除菌。通常方法是在試管及三角瓶口加上棉花塞等。1試管棉塞的制作制棉塞時(shí)，應(yīng)選用大小、厚薄適中的普通棉花一塊，鋪展于左手拇指和食指扣成的團(tuán)孔上，用右手食指將棉花從中央壓入團(tuán)孔中制成棉塞然后直接壓入試管或三角瓶口。也可借用玻璃棒塞入，也可用折疊卷塞法制作棉塞。制作的棉塞應(yīng)緊貼管壁，不留縫隙，以防外界微生物沿縫隙侵入，棉塞不宜過緊或過松，塞好后以手提棉塞，試管不下落為準(zhǔn)。棉塞的23在試管內(nèi)，13在試管外。目前也有采用硅膠塞代替棉塞直接蓋在試管口上。將裝好培養(yǎng)基并塞好棉塞或硅膠塞的試管捆成一捆，外面包上一層牛皮紙。用記號筆注明培養(yǎng)基名稱及配制日期，滅菌待用。圖8-3 棉塞的制作圖8-4 正確與不正確的棉塞1.金屬塞 2正確 3、4不正確2三角瓶棉塞制作通常在棉塞外包上一層紗布，再塞在瓶口上。有時(shí)為了進(jìn)行液體振蕩培養(yǎng)加大通氣量，則可用8層紗布代替棉塞包在瓶口上，目前也有采用硅膠塞直接蓋在瓶口上。在裝好培養(yǎng)基并塞好棉塞或包扎八層紗布或蓋好硅膠塞的三角瓶口上，再包上一層牛皮紙并用線繩捆好，滅菌待用。（五）培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)基經(jīng)分裝包扎后，應(yīng)立即按配制方法規(guī)定的滅菌條件進(jìn)行進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。（六）斜面和平板的制作1斜面的制作將已滅菌裝有瓊脂培養(yǎng)基的試管，趁熱置于木棒或玻棒上，使成適當(dāng)斜度，凝固后即成斜面。斜面長度不超過試管長度l2為宜。如制作半團(tuán)體或固體深層培養(yǎng)基時(shí)，滅菌后則應(yīng)垂直放置至凝固。2平板的制作將裝在三角瓶或試管中已滅菌的瓊脂培養(yǎng)基融化后，待冷至50左右傾入無菌培養(yǎng)皿中。溫度過高時(shí)，皿蓋上的冷凝水太多；溫度低于50，培養(yǎng)基易于凝固而無法制作平板。平板的制作應(yīng)在火旁進(jìn)行，左手拿培養(yǎng)皿，右手拿三角瓶的底部或試管，左手同時(shí)用小指和手掌將棉塞打開，灼燒瓶口，用左手大拇指將培養(yǎng)皿蓋打開一縫，至瓶口正好伸入，傾入1015mL培養(yǎng)基，迅速蓋好皿蓋，置于桌上，輕輕旋轉(zhuǎn)平皿，使培養(yǎng)基均勻分布于整個(gè)平皿中，冷凝后即成平板。（七）培養(yǎng)基的滅菌檢查滅菌后的培養(yǎng)基，一般需進(jìn)行無菌檢查。最好取出12管(瓶)，置于37溫箱中培養(yǎng)12天，確定無菌后方可使用。（八）無菌水的制備在每個(gè)250mL的三角瓶內(nèi)裝100mL的蒸餾水并塞上棉塞或硅膠塞。在每支試管內(nèi)裝4.5mL蒸餾水，塞上棉塞或硅膠塞。再在棉塞上包上一張牛皮紙，高壓蒸汽滅菌。0.1MPa滅菌2030min。五、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1. 根據(jù)要求清洗各種玻璃器皿，并進(jìn)行包扎。2. 根據(jù)要求配制各種培養(yǎng)基。3. 用電熱鼓風(fēng)干燥箱對玻璃器皿進(jìn)行干熱滅菌。4. 用高壓蒸汽滅菌鍋對所配各培養(yǎng)基滅菌。六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1. 簡述移液管和培養(yǎng)皿的包扎注意事項(xiàng)。2. 簡述配制培養(yǎng)基的基本步驟及注意事項(xiàng)。3. 為什么微生物實(shí)驗(yàn)室所用的移液管口或滴管口的上端均需塞入一小段棉花，再用報(bào)紙包起來，經(jīng)高壓蒸汽滅菌后才能使用?4. 為什么微生物實(shí)驗(yàn)室所用的三角瓶口或試管口都要塞上棉塞（硅膠塞）才能使用？5. 配制培養(yǎng)基時(shí)為什么要調(diào)節(jié)pH？6. 高壓蒸汽滅菌為什么比干熱滅菌要求溫度低、時(shí)間短？附錄 滅菌技術(shù)一、目的要求了解消毒和滅菌的原理，并掌握各種滅菌方法的操作步驟。二、實(shí)驗(yàn)材料1. 儀器或其他用具：上述包扎的培養(yǎng)皿、試管、移液管等，電熱鼓風(fēng)干燥箱，高壓蒸汽滅菌鍋，微孔濾膜過濾器，0.22m濾膜，注射器，鑷子，玻璃涂棒。2. 培養(yǎng)基：上述配制的培養(yǎng)基及生理鹽水三、基本原理在微生物實(shí)驗(yàn)中，需要進(jìn)行純培養(yǎng)，不能有任何雜菌污染，因此必須對所用器材、培養(yǎng)基和工作場所進(jìn)行滅菌和消毒。滅菌是指殺死一定環(huán)境中的所有微生物，包括微生物的營養(yǎng)體、芽孢和孢子。實(shí)驗(yàn)室常用的滅菌方法包括直接灼燒、恒溫干燥箱滅菌、高壓蒸汽滅菌、間歇滅菌、煮沸滅菌等方法。這些方法的基本原理是通過加熱使微生物體內(nèi)蛋白質(zhì)凝固變性，從而達(dá)到滅菌的目的。四、操作步驟（一）干熱滅菌法干熱滅菌是在電熱干燥箱內(nèi)利用高溫干燥空氣（160170）進(jìn)行滅菌，它是利用高溫使微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌目的。此法適用于玻璃器皿如移液管、試管和培養(yǎng)皿的滅菌。培養(yǎng)基、橡膠制品、塑料制品不能采用干熱滅菌。細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固性與其本身的含水量有關(guān)，在菌體受熱時(shí)，當(dāng)環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)含水量越大，則蛋白質(zhì)凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢。因此，與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度高（160170），時(shí)間長（12h）。但干熱滅菌溫度不能超過180，否則，包器皿的紙或棉塞就會燒焦，甚至引起燃燒。干熱滅菌使用的是電熱干燥箱（干燥箱）。具體操作步驟如下：1.2. reality n. 真實(shí)；事實(shí)；現(xiàn)實(shí)裝入待滅菌物品：將包好的待滅菌物品放入電熱干燥箱內(nèi)，關(guān)好箱門。堆積時(shí)要留有空隙，物品不要擺放得太擠，以免妨礙空氣流通，滅菌物品不要接觸電熱干燥箱內(nèi)壁的鐵板、溫度探頭，以防包裝紙烤焦起火。3. 升溫：接通電源，打開開關(guān)，適當(dāng)打開電熱干燥箱頂部的排氣孔，旋動(dòng)恒溫調(diào)節(jié)器，使溫度逐步上升。當(dāng)溫度升至100時(shí)，關(guān)閉排氣孔。在升溫過程中，如果紅燈熄滅，綠燈亮，表示電熱干燥箱內(nèi)停止加溫，此時(shí)如果還未達(dá)到所需的160170，則需要轉(zhuǎn)動(dòng)溫度調(diào)節(jié)器使紅燈亮，如此反復(fù)調(diào)節(jié)，直至達(dá)到所需的溫度。4. 恒溫：當(dāng)溫度升到160170時(shí)，借助恒溫調(diào)節(jié)器的自動(dòng)控制，保持此溫度2h。干熱滅菌過程中，嚴(yán)防恒溫調(diào)節(jié)的自動(dòng)控制失靈而造成安全事故。5. 降溫：切斷電源，自然降溫。6. 開箱取物：待電熱干燥箱內(nèi)溫度降到60以下后，才能打開箱門，取出滅菌物品。同時(shí)，應(yīng)將溫度調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)到零點(diǎn)，并打開排氣孔。電熱干燥箱內(nèi)溫度未降到60以前，切勿自行打開箱門，以免驟然降溫導(dǎo)致玻璃器皿炸裂。（二）高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌是將物品放在密閉的高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，在一定的壓力下保持1530分鐘進(jìn)行滅菌。此法適用于培養(yǎng)基、無菌水、工作服等物品的滅菌，也可用于玻璃器皿的滅菌。將待滅菌的物品放在一個(gè)密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，通過加熱，使滅菌鍋夾套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽。待水蒸汽急劇地將鍋內(nèi)的冷空氣從排氣閥中排盡，然后關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱，此時(shí)由于蒸汽不能溢出，而增加了滅菌鍋內(nèi)的壓力，從而使沸點(diǎn)增高，獲得高于100的溫度，導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。在相同的溫度下，濕熱滅菌的效果好于干熱滅菌。有三點(diǎn)原因：在濕熱滅菌中菌體吸收水分，蛋白質(zhì)容易凝固變性，蛋白質(zhì)隨著含水量的增加，所需凝固溫度降低；濕熱滅菌中蒸汽的穿透力比干燥空氣大；蒸汽在被滅菌物體表面凝結(jié)，釋放出大量的汽化潛熱，能迅速提高滅菌物體表面的溫度，從而增加滅菌效力。實(shí)驗(yàn)室常用的滅菌鍋有非自控手提式高壓蒸汽滅菌鍋和自控式滅菌鍋，其結(jié)構(gòu)和工作原理是相同的。本實(shí)驗(yàn)介紹的是非自控手提式高壓蒸汽滅菌鍋，自控式滅菌鍋的使用可參考廠家說明書。具體操作步驟如下：1. 加水：首先將內(nèi)層鍋取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水，使水面沒過加熱蛇管，與三角擱架相平為宜。切勿忘記檢查水位，加水量過少，滅菌鍋會發(fā)生燒干引起炸裂事故。2. 裝料：放回內(nèi)層鍋，并裝入待滅菌的物品。注意不要裝得太擠，以免妨礙蒸汽流通而影響滅菌效果。裝有培養(yǎng)基的容器放置時(shí)要防止液體溢出，三角瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包扎的紙而透入棉塞。3. 加蓋：將蓋上與排氣孔相連的排氣軟管插入內(nèi)層鍋的排氣槽內(nèi)，擺正鍋蓋，對齊螺口，然后以對稱方式同時(shí)旋緊相對的兩個(gè)螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣，并打開排氣閥。4. 排氣：打開電源加熱滅菌鍋，將水煮沸，使鍋內(nèi)的冷空氣和水蒸汽一起從排氣孔中排出。一般認(rèn)為當(dāng)排出的氣流很強(qiáng)并有噓聲時(shí)，表明鍋內(nèi)的空氣已排盡，沸騰后約需5分鐘。5. 升壓：冷空氣完全排盡后，關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱，鍋內(nèi)壓力開始上升。6. 保壓：當(dāng)壓力表指針達(dá)到所需壓力時(shí)，控制電源，開始計(jì)時(shí)并維持壓力至所需的時(shí)間。如本實(shí)驗(yàn)中采用0.1Mpa，121.5，20分鐘滅菌。滅菌的主要因素是溫度而不是壓力，因此鍋內(nèi)的冷空氣必須完全排盡后，才能關(guān)閉排氣閥，維持所需壓力。7. 降壓：達(dá)到滅菌所需的時(shí)間后，切斷電源，讓滅菌鍋溫度自然下降，當(dāng)壓力表的壓力降至“0”后，方可打開排氣閥，排盡余下的蒸汽，旋松螺栓，打開鍋蓋，取出滅菌物品，倒掉鍋內(nèi)剩水。壓力一定要降到“0”后，才能打開排氣閥，開蓋取物。否則就會因鍋內(nèi)壓力突然下降，使容器內(nèi)的培養(yǎng)基或試劑由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出容器口，造成瓶口被污染，甚至灼傷操作者。8. 無菌檢查：將已滅菌的培養(yǎng)基放入37恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，檢查無雜菌生長后，即可使用。（三）過濾除菌有些物質(zhì)，如抗生素、血清、維生素、糖溶液等采用加熱滅菌法時(shí)，容易受熱分解而被破壞，因而要采用過濾除菌法。過濾除菌是通過機(jī)械作用濾去液體或氣體中細(xì)菌的方法，該方法最大的優(yōu)點(diǎn)是不破壞溶液中各種物質(zhì)的化學(xué)成分。過濾除菌法除實(shí)驗(yàn)室用于溶液、試劑的除菌外，在微生物工作中使用的凈化工作臺也是根據(jù)過濾除菌的原理設(shè)計(jì)的，可根據(jù)不同的需要來選用不同的濾器和濾板材料。應(yīng)用最廣泛的過濾器種類有：1. 微孔濾膜過濾器：是一種新型過濾器，它由上下二個(gè)分別具有出口和入口連接裝置的塑料盒組成，出口處可連接針頭，入口處可連接針筒，使用時(shí)將濾膜裝入兩塑料盒之間，旋緊盒蓋，當(dāng)溶液從針筒注入濾器時(shí)，各種微生物被阻留在微孔濾膜上面，而液體和小分子物質(zhì)通過濾膜，從而達(dá)到除菌的目的。其濾膜是由硝酸纖維素、醋酸纖維素等制成的薄膜，有孔徑大小不同的多種規(guī)格（如0.1m、0.22m、0.3m、0.45m等），實(shí)驗(yàn)室中用于除菌的微孔濾膜孔徑一般為0.22m。根據(jù)待除菌溶液量的多