高速逆流色譜技術(shù) 綜述.doc

高速逆流色譜技術(shù)1.概述高速逆流色譜（high-speed counter current chromatography，簡(jiǎn)稱 HSCCC），是20世紀(jì)70年代由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院（National Institute of Health，簡(jiǎn)稱NIH）Ito博士首創(chuàng)，并且在最近10年之內(nèi)發(fā)展迅速，是一種可在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)高效分離和制備的新型液-液分配色譜技術(shù)，這項(xiàng)技術(shù)可以達(dá)到幾千個(gè)理論塔板數(shù)的。它具有操作簡(jiǎn)單易行、應(yīng)用范圍很廣、無需固體載體、產(chǎn)品純度高、適用于制備型分離等特點(diǎn)。自1982年第一臺(tái)儀器問世，就開始了HSCCC的現(xiàn)代化進(jìn)程。HSCCC用于天然藥物化學(xué)成分的分離始于1985年，到1989年達(dá)到一個(gè)高潮。自2000年9月起國(guó)際逆流研究領(lǐng)域每隔2年舉行一次世界逆流色譜學(xué)術(shù)會(huì)議。近幾年, 人們對(duì)健康的認(rèn)識(shí)越來越深刻, 更多的人追求天然綠色的健康理念, 故HSCCC 作為一種對(duì)提取物污染小的制備技術(shù), 它的應(yīng)用越來越受到了人們的關(guān)注。鑒于HSCCC的顯著特點(diǎn), 此項(xiàng)技術(shù)已被應(yīng)用于生化、生物工程、醫(yī)藥、天然產(chǎn)物化學(xué)、有機(jī)合成、環(huán)境分析、食品、地質(zhì)、材料等領(lǐng)域。目前,HSCCC已從制備型發(fā)展到了分析型, 甚至是微量分析型, 應(yīng)用范圍也十分廣泛 2。高速逆流色譜技術(shù)在我國(guó)的應(yīng)用較早, 技術(shù)水平在國(guó)際領(lǐng)域也處于領(lǐng)先地位。目前, 我國(guó)是世界上為數(shù)不多的高速逆流色譜儀生產(chǎn)國(guó)之一。我國(guó)的深圳同田生化技術(shù)有限公司是全球第一家多分離柱高速逆流色譜儀專業(yè)生產(chǎn)企業(yè)。公司擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的高速逆流色譜專利技術(shù), 現(xiàn)已研制并生產(chǎn)出TBE 系列分析型, 半制備型TBE 300，300A, 制備型TBE1000高速逆流色譜儀設(shè)備。2.基本原理高速逆流色譜技術(shù)(HSCCC)是一種不用任何同態(tài)載體的液-液色譜技術(shù)，其分離原理是進(jìn)行分離純化時(shí)，首先選擇預(yù)先平衡好的兩相溶劑中的一相為固定相, 并將其充滿螺旋管柱, 然后使螺旋管柱在一定的轉(zhuǎn)速下高速旋轉(zhuǎn), 同時(shí)以一定的流速將流動(dòng)相泵入柱內(nèi)。在體系達(dá)到流體動(dòng)力學(xué)平衡后(即開始有流動(dòng)相流出時(shí)), 將待分離的樣品注入體系, 其中組分將依據(jù)其在兩相中分配系數(shù)的不同實(shí)現(xiàn)分離。HSCCC分離效率高，產(chǎn)品純度高；不存在載體對(duì)樣品的吸附和污染；制備量大和溶劑消耗少；操作簡(jiǎn)單，能從極復(fù)雜的混合物中分離出特定的組分。高速逆流色譜儀器的裝置如圖1所示，它的公轉(zhuǎn)軸水平設(shè)置，螺旋管柱距公轉(zhuǎn)軸R處安裝，兩軸線平行。通過齒輪傳動(dòng)，使螺旋管柱實(shí)現(xiàn)在繞儀器中心軸線公轉(zhuǎn)的同時(shí)，繞自轉(zhuǎn)軸作相同方向相同角速度的自轉(zhuǎn)。圖1 高速逆流色譜儀器的裝置示意圖(引自： 齊元英孟兆玲 柳仁民等 高速逆流色譜技術(shù)及其在天然產(chǎn)物研究中的應(yīng)用進(jìn)展）在達(dá)到穩(wěn)定的流體動(dòng)力學(xué)平衡態(tài)后，柱中呈現(xiàn)兩個(gè)絕然不同的區(qū)域：在靠近離心軸心大約有四分之一的區(qū)域，呈現(xiàn)兩相的激烈混合(混合區(qū))；其余區(qū)域兩溶劑相分成兩層(靜置區(qū))，較重的溶劑相在外部，較輕的溶劑相在內(nèi)部，兩相形成一個(gè)線狀分界面。如圖2所示：圖2 高速逆流色譜螺旋管溶劑體系的區(qū)域分布圖（引自李愛峰；劉寧寧；柳仁民等高速逆流色譜原理及其在天然產(chǎn)物化學(xué)成分分離中的應(yīng)用研究進(jìn)展 理化檢驗(yàn)-化學(xué)分冊(cè) 44(05)，95-98，（2008）圖3為旋轉(zhuǎn)一周混合區(qū)域的變化示意圖，每一混合區(qū)域以與柱旋轉(zhuǎn)速度相同的速度向柱端移動(dòng)。當(dāng)流動(dòng)相恒速通過固定相時(shí)，兩相溶劑都在反復(fù)進(jìn)行混合和靜置的分配過程，這一過程頻率極高，當(dāng)柱以800 r/min旋轉(zhuǎn)時(shí)，頻率超過13次/s，所以高速逆流色譜有相當(dāng)高的分配效率。（引自李愛峰；劉寧寧；柳仁民等高速逆流色譜原理及其在天然產(chǎn)物化學(xué)成分分離中的應(yīng)用研究進(jìn)展 理化檢驗(yàn)-化學(xué)分冊(cè) 44(05)，95-98，（2008）3.儀器裝置經(jīng)過多年的開發(fā)應(yīng)用，高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物以及生物活性樣品的分離分析等領(lǐng)域取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，儀器設(shè)備硬件技術(shù)也得到了顯著的發(fā)展。在逆流色譜技術(shù)發(fā)展的早期階段，人們主要側(cè)重于制備型儀器，近年來又對(duì)分析型HSCCC的應(yīng)用報(bào)道逐漸增多。由于分析型HSCCC儀器具有體積小、分離速度快、溶劑消耗小等優(yōu)點(diǎn)，因此在溶劑體系的快速優(yōu)化、樣品的小量制備以及分配系數(shù)的測(cè)定等方面得到了應(yīng)用。下表比較分析了分析型儀器與制備型儀器及其操作系數(shù)：項(xiàng)目分析型制備型儀器類型J形多層螺旋管離心分析儀J形多層螺旋管離心分析儀螺旋管內(nèi)徑/mm1,到3-4柱體積/ml1.5-5050，最大到1000流速/(ml/min)0.1-12.0-10轉(zhuǎn)速/(r/min)1500-40001200樣品量1g-10mg10mg-10g高速逆流色譜技術(shù)的基本系統(tǒng)結(jié)構(gòu)如圖4所示，主要由輸液泵、進(jìn)樣閥、螺旋管式離心分離管、檢測(cè)器等組成。由于其操作壓力并不高，用普通的中低壓泵即可。進(jìn)樣可用帶有樣品環(huán)管的六通進(jìn)樣閥進(jìn)樣。樣品的分離是在多層螺旋管式離心分離管內(nèi)完成。檢測(cè)器與液相色譜的檢測(cè)器相同，如紫外檢測(cè)器、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、質(zhì)譜檢測(cè)器等。圖4 HSCCC的基本系統(tǒng)結(jié)構(gòu)(引自鄧建朝；肖小華；李攻科等 高速逆流色譜儀器裝置的研究進(jìn)展，J 化學(xué)通報(bào)（印刷版）（2009）)圖5為高速逆流色譜原型的橫截面示意圖，由一個(gè)電機(jī)帶動(dòng)一對(duì)齒形皮帶輪，并由齒形皮帶帶動(dòng)轉(zhuǎn)動(dòng)框架，轉(zhuǎn)動(dòng)框架將管柱支持件和配重組件對(duì)稱地裝在離心儀中心軸兩邊，在每一個(gè)支持件的軸線上都裝有一個(gè)行星齒輪，與中心管上固定齒輪相嚙合，這幾個(gè)齒輪的尺寸和形狀完全一樣。為了保證儀器的機(jī)械穩(wěn)定性，用一根短偶聯(lián)管同軸地裝設(shè)在轉(zhuǎn)動(dòng)框架的自由端，偶聯(lián)管地另一頭通過球軸承靠?jī)x器的固定側(cè)壁件支撐，從繞制在支持件上的螺旋管引起的一對(duì)流通管，先穿過支持件轉(zhuǎn)軸地中心孔，再穿過偶聯(lián)管的側(cè)孔到達(dá)中心固定管地開口，然后穿過此固定管，從儀器地另一端引出。流通管外采用油脂潤(rùn)滑核塑料套管保護(hù)措施，以避免與金屬件直接摩擦。圖5 高速逆流色譜技術(shù)地橫截面示意圖(引自 李攻科、胡玉玲、阮貴華等，樣品前處理儀器與裝置，M 289,(2009) 圖6為改進(jìn)后的高速逆流色譜儀，這種儀器裝有3個(gè)柱支持件，每個(gè)支持件上有兩個(gè)齒輪，一個(gè)與裝在中心離心軸上地行星齒輪相嚙合，另一個(gè)與裝在管支持件軸線上地齒輪相嚙合，為避免流通管地打絞，管支持件軸相對(duì)于柱支持件做反向轉(zhuǎn)動(dòng)。 圖6 改進(jìn)后的高速逆流色譜儀(引自 李攻科、胡玉玲、阮貴華等，樣品前處理儀器與裝置，M 290,(2009)目前，國(guó)內(nèi)外商品化的高速逆流色譜技術(shù)儀多為在單柱分離系統(tǒng)的改進(jìn)型，主要可以分為以下幾類：1、 GS系列 由北京新技術(shù)應(yīng)用研究所張?zhí)煊咏淌陬I(lǐng)導(dǎo)的科研小組研制開發(fā)，是國(guó)內(nèi)最早的色譜儀器。主要包括GS10A半制備型HSCCC儀（柱體積為210250 ml，最高轉(zhuǎn)速為1000r/min，單分離柱加配重件結(jié)構(gòu)）以及GS20分析型HSCCC儀（柱體積35ml，最高轉(zhuǎn)速2000r/min），如圖7所示圖7 GS系列HSCCC儀(引自李攻科、胡玉玲、阮貴華等，樣品前處理儀器與裝置，M 301,(2009)2、 TBE系列 由深圳同田生物技術(shù)有限公司負(fù)責(zé)開發(fā)。包括TBE-300、TBE-300A以及TBE-1000三種類型，如圖8所示.采用三串聯(lián)柱分離系統(tǒng)，其中TBE-300以及TBE-300A的柱體積設(shè)計(jì)為300ml，PTFE管徑為1.6mm轉(zhuǎn)速為700-1000r/min，TBE-1000型柱體積為1000ml，PTFE管徑為2.6mm，轉(zhuǎn)速為400-600r/min。 圖8 TBE系列HSCCC儀(引自網(wǎng)頁/Product/detail/50753.html)3、 Quattro系列 由英國(guó)Brunel大學(xué)生物工程研究所lan Surherland教授領(lǐng)導(dǎo)的研究小組研究開發(fā)。該系列儀器設(shè)計(jì)了可以試想自我平衡的爽分離系統(tǒng)，且兩分離柱留有多個(gè)聚四氟乙烯管抽頭，用戶可以根據(jù)自己的需要，串聯(lián)或并聯(lián)出不同的柱體積（150ml-3L），同時(shí)還可以進(jìn)行兩個(gè)不同的分離過程（如圖9所示）圖9 Quattro系列HSCCC儀(引自李攻科、胡玉玲、阮貴華等，樣品前處理儀器與裝置，M 301,(2009) 另外，美國(guó)Pharma Tech Rearch 公司生產(chǎn)逆流色譜技術(shù)儀器也已經(jīng)有十幾年的歷史，如CCC-3000以及CCC-1000型儀器（如圖10所示）均帶有三分離柱串聯(lián)的自平衡系統(tǒng)，柱體積分別為50ml和120-850ml。CCC-1000也可以根據(jù)需要配置不同的分離柱。美國(guó)Conway Centrichrom公司生產(chǎn)的DU-1000型，同樣帶有三分離柱，其三柱體積并不相同，分別為480ml、85 ml、245 ml，PTFE管內(nèi)徑為1.6mm。圖10 Pharma Tech Rearch系列HSCCC儀(引自李攻科、胡玉玲、阮貴華等，樣品前處理儀器與裝置，M 301,(2009)4.應(yīng)用HSCCC技術(shù)已經(jīng)成為一種備受關(guān)注的新型分離純化技術(shù)。由于其具有較好的分辨性、固定相不需要載體、進(jìn)樣量大、分離完全等優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥、天然產(chǎn)物、食品和化妝品等諸多領(lǐng)域。我國(guó)還是繼美國(guó)、日本之后最早開展逆流色譜應(yīng)用的國(guó)家，也是世界上高速逆流色譜儀生產(chǎn)國(guó)之一，我國(guó)豐富的資源給HSCCC技術(shù)提供了廣闊的平臺(tái)。1 高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物領(lǐng)域中的應(yīng)用1.1黃酮類化合物 黃酮類化學(xué)物質(zhì)在自然界中廣泛存在于多種植物，且對(duì)于治療多種疾病有著重要的作用，是一類比較重要的植物化學(xué)成分。現(xiàn)已成功應(yīng)用HSCCC 技術(shù)分離提純?cè)擃惢衔锏膶?duì)照品。 常用的分離黃酮類化合物的溶劑系統(tǒng)為氯仿-甲醇-水（4:3:2），例如潘霞等以蘆薈全葉為原料，經(jīng)過一系列的預(yù)處理手段獲得蘆薈色酮粗提物，采用氯仿-甲醇-水(4:3:2)混合溶液和二氯甲烷 -甲醇-水(5:4:2)混合溶液為溶劑分離系統(tǒng)，經(jīng)過兩步HSCCC分離純化出純度在95%以上的蘆薈色酮單體。通過紫外檢測(cè)、快原子轟擊質(zhì)譜及核磁共振等方法的結(jié)構(gòu)分析鑒定證實(shí)分離所得物質(zhì)為肉桂酰基-C-葡萄糖苷蘆薈色酮。Yang F Q等用該體系成功分離了沙棘中的茨非醇。 馬曉豐等采用HSCCC法，以正己烷-氯仿-甲醇-水(1.5:3:3:2)組成的二相系統(tǒng)對(duì)黃芪的醋酸乙酯粗提物進(jìn)行了分離純化，分離出的毛蕊異黃酮純度可達(dá)95%以上，并可以初步純化芒柄花素；然后用正己烷-氯仿-甲醇-水 (4:4:5:4)組成的系統(tǒng)進(jìn)一步純化芒柄花素，其純度達(dá)95以上。Du Q Z以正己烷-醋酸乙酯-正丁醇-甲醇-醋酸-水(1:2:1:1:5:1)為溶劑分離了大豆中的黃豆苷、染料木苷，以正己烷-醋酸乙酯 -甲醇-水(1:3:2:4)為溶劑分離了Ampelopsis grossedentata中的（+）二氫楊梅黃酮。 1.2生物堿 大多數(shù)的生物堿都具有較活潑的生物活性，故生物堿的HSCCC提取文獻(xiàn)報(bào)道較多。較常用的溶劑系統(tǒng)主要是氯仿-甲醇-酸性改性劑體系。蔣凱等采用HSCCC分離純化黃花烏頭塊根中的生物堿類化學(xué)成分，其溶劑系統(tǒng)采用氯仿-甲醇 -0.2 molL-1鹽酸（10:3:3），從黃花烏頭塊根中一次性分離得到8個(gè)化合物，其中化合物13- diacetyl-14-hydroxyhetisine為新化合物，命名為關(guān)附未素（Guanfubase R）。洪波等采用HSC- CC對(duì)附子中的化學(xué)成分進(jìn)行研究，分離得到了 15-羥基新烏堿單體，溶劑系統(tǒng)為氯仿-甲醇-0.3 molL-1鹽酸（4:3:2）。顏繼忠等以氯仿-甲醇-0.2 molL-1鹽酸(2:1:1)為溶劑體系，用HSCCC成功分離出金果欖中的巴馬亭成分，經(jīng)測(cè)定組分純度大于99.6%，并由IR、1H- NMR和MS確定結(jié)構(gòu)。Fuquan Y等利用HSCCC 以氯仿-甲醇-0.3 molL-1鹽酸（4:1.5:2）為溶劑系統(tǒng)，從烏頭的總生物堿粗提物中分離出高烏堿、N-去乙酰基高烏堿。 1.3有機(jī)酸 有機(jī)酸類是分子結(jié)構(gòu)中含有羧基的一類化合物，在中草藥的葉、根特別是果實(shí)中廣泛分布，常見植物中的有機(jī)酸有脂肪族的一元、二元、多元羧酸，如酒石酸、草酸、蘋果酸、構(gòu)椽酸、抗壞血酸（即維生素C）等，亦有芳香族有機(jī)酸如苯甲酸、水楊酸、咖啡酸等。王鳳美等采用HSCCC，以正己烷 -醋酸乙酯-水-甲醇(1.5:5:5:1.5)為溶劑系統(tǒng)分離純化丹參水溶性成分丹酚酸類物質(zhì)，結(jié)果一次分離可制備63.4mg丹酚酸B，其純度為98.6%。該方法可作為高純度丹酚酸B化學(xué)對(duì)照品的制備分離方法。黃健光等以正己烷-醋酸乙酯-甲醇 -水(7:3:6:4)為溶劑系統(tǒng)，成功分離了鄰苯二酚和對(duì)苯二酚這一對(duì)同分異構(gòu)體。孫愛玲等建立了HSCCC分離制備厚樸的有效成分厚樸酚與和厚樸酚的新方法，溶劑系統(tǒng)為石油醚-醋酸乙酯-甲醇-1%醋酸(5:5:7:3)。從l00mg厚樸粗提物制得和厚樸酚33.3mg，厚樸酚19.5 mg，經(jīng)HPLC分析，純度均大于99.5%，其化學(xué)結(jié)構(gòu)由1H-NMR和 13C-NMR鑒定。Lu Haitao等應(yīng)用正丁醇-冰醋酸-水(4:1:5)系統(tǒng)從金銀花中分離得到綠原酸。 1.4蒽醌類及其他 陳存社等經(jīng)過分析得出，用氯仿-甲醇- 丙酮-水(9:8:1:8)為溶劑系統(tǒng)分離純化蘆薈有效成分蒽醌類物質(zhì)蘆薈大黃素和蘆薈大黃素苷的效果最佳。袁黎明等對(duì)蘆薈的乙醇粗提物在不同的溶劑系統(tǒng)比例下進(jìn)行了分離，當(dāng)采用氯仿-甲醇-水 (4:3.8:2)時(shí)，分離結(jié)果最好。王春燕等應(yīng)用 HSCCC法，以溶劑系統(tǒng)氯仿-甲醇-水 (9:10.5:8)的上相為固定相，下相為流動(dòng)相，從蘆薈生藥中一次性分離得到蘆薈苷（純度 99.99%）和蘆薈大黃素（純度95.83%）。實(shí)驗(yàn)中還分離得到一個(gè)未知物，其薄層色譜鑒別與蘆薈苷一致，經(jīng)HPLC測(cè)定其純度為99.26%，是否為蘆薈苷的異構(gòu)體，有待進(jìn)一步研究。Yang F Q等用氯仿-甲醇-水(4:3.8:2)分離了虎杖中的白藜蘆醇和白藜蘆醇苷。Weiduo Si等以正己烷- 醋酸乙酯-甲醇-水（2:8:2:8）為溶劑，用HSC- CC技術(shù)對(duì)綠茶粗提物中的殺菌成分進(jìn)行了分離，得到兩個(gè)活性成分。Qizhen Du等利用HSCCC技術(shù)從越桔粗提物中提取花青素，從500mg越桔粗提物得到cyanidin-3-O-sambubioside和delphini- din3-O-sambubioside提純品77 mg和130mg,其溶劑系統(tǒng)為三氟乙酸-水-正丁醇-叔丁基甲醚- 乙腈（0.01:5:4:1:1）。2 高速逆流色譜在藥物中的應(yīng)用與傳統(tǒng)的液相色譜法相比較，HSCCC具有分離效率高、溶劑用量少、無吸附、樣品回收率高、重現(xiàn)性好和適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。由于HSCCC的溶劑系統(tǒng)組成與配比可以是無限多的，理論上何極性范圍的樣品都可用它得到分離；而且HSCCC對(duì)樣品的預(yù)處理要求低，僅需簡(jiǎn)單的提取，甚至不用前處理都可達(dá)到很好的分離效果。它的這種特點(diǎn)非常適用于中藥成分的分離和分析。許多研究證明，HSCCC能分離用HPLC難以分離的成分。Schaufelberger等用正己烷-乙醇-水（體積比為6:5:5）溶劑系統(tǒng)分離含有長(zhǎng)春胺、長(zhǎng)春辛和長(zhǎng)春新堿等的樣品，與用HPLC的分離效果相似，這3種成分之間均能達(dá)到基線分離；但采用HSCCC還能將用HPLC難以分離的長(zhǎng)春新堿對(duì)映異構(gòu)體分開。HSCCC在中草藥研究方面的應(yīng)用尚處在起步階段，目前主要用于中草藥有效成分的分離和標(biāo)準(zhǔn)品的制備。2.1.1制備中藥化學(xué)成分對(duì)照品國(guó)內(nèi)外學(xué)者已采用HSCCC技術(shù)分離提純了許多中藥化學(xué)成分對(duì)照品, 如從金銀花中分離綠原酸（純度94.8%）, 從黃芪中分離異黃酮苷（95%），從紫草中分離紫草寧（98.9%），從二氫楊梅素粗提物中純化二氫楊梅素川(99%), 從虎仗中分離白黎蘆醇(99%), 從肉蓯蓉acleoside（98%），從丹參中分離隱丹參酮（98.8%），從大黃中分離大黃素甲醚、蘆薈大黃酸、大黃酸、大黃粉、大黃素（98%）, 從毛柳苷粗提物中純化毛柳苷（98%）等。2.1.2 分離蛋白質(zhì)和多肽HSCCC用于分離制備蛋白質(zhì)和多肽, 需要強(qiáng)極性并具有較高的粘度的溶劑系統(tǒng), 為了獲得合適的固定相保留值, 大部分都采用X型的CPC。目前, 聚合物雙水相溶劑體系、新型的PCCC以及ICCC的出現(xiàn)和發(fā)展則為成功分離蛋白質(zhì)和多肽提供了有利的條件。用HSCCC分離的有卵白蛋白、乙醇脫氫酶（ADH）、乳酸脫氫酶（LDH）、DNA結(jié)合蛋白、脂蛋白、短桿菌膚、桿菌膚、粘菌素、縮膽囊素等。2.1.3分離抗生素由于可以直接向HSCCC中進(jìn)粗品, 抗生素的分析和制備分離也可采用。美國(guó)FDA及世界衛(wèi)生組織也采用此項(xiàng)技術(shù)作為抗生素成分的分離檢定。HSCCC分離制備抗生素時(shí), 進(jìn)樣量通常為1mg5g，溶劑系統(tǒng)一般采用疏水性體系。用HSCCC分離的抗生素實(shí)例有環(huán)孢菌素、WAP8249A 、伊維菌素、螺旋霉素,、子囊霉素及依羅霉素、道諾紅菌素衍生物、普那霉素、放線菌素、殺念菌素、尼達(dá)霉素等。2.1.4 分離手性化合物隨著HSCCC技術(shù)的發(fā)展, 其應(yīng)用范圍逐步拓展。已有用HSCCC分離外消旋對(duì)映體手性化合物的報(bào)道。如已用于分離擷氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等手性氨基酸對(duì)映體, 也有報(bào)道從紫膠染料、喹啉黃、食品紅等染料中分離手性化合物。隨著高選擇性的手性添加劑的發(fā)現(xiàn), 相信將有更多的手性物質(zhì)通過HSCCC拆分。2.2 在藥物分析中的應(yīng)用2.2.1 HSCCC與其他色譜技術(shù)聯(lián)用進(jìn)行中藥的定性、定量分析分析型HSCCC與各種檢測(cè)器聯(lián)用可以用于中藥化學(xué)成分的定性、定量分析, 或者將分析型與制備型HSCCC聯(lián)用。還可以將HSCCC技術(shù)與其他色譜如HPLC、MS和NMR聯(lián)用, 從而充分發(fā)揮HSCCC高速、高效的優(yōu)點(diǎn)與其他色譜靈敏度高的優(yōu)點(diǎn), 更好地用于中藥的分析鑒定。2.2.2利用HSCCC建立中藥指紋圖譜 中藥質(zhì)量可控是中藥現(xiàn)代化的一個(gè)重要內(nèi)容，中藥以及復(fù)方因其復(fù)雜的成分和未明的作用機(jī)理，阻礙著中藥現(xiàn)代化的進(jìn)程。中藥指紋圖譜技術(shù)已成為研究中藥有效成分及作用機(jī)理，控制中藥質(zhì)量，推動(dòng)中藥業(yè)走向世界的關(guān)鍵技術(shù)。HSCCC具有很好的分辨率和重現(xiàn)性，加上不存在固體載體吸咐，對(duì)樣品的前處理要求不高或不用前處理，不存在分離過程丟失成分和成分變性的問題，因而可用于中藥有效成分的定性或半定量分析，并整理出中藥材的特征峰和指紋譜，制定標(biāo)準(zhǔn)圖譜，用于中藥的質(zhì)量控制和測(cè)定。在高速逆流色譜指紋圖譜研究方面，目前已對(duì)大黃、沙棘、何首烏等一些中藥進(jìn)行了研究。從20世紀(jì)90年代以來, HSCCC有關(guān)技術(shù)有了較大的發(fā)展, 且在天然藥物、生物醫(yī)藥研究中獲得了廣泛的應(yīng)用, 也有人研究用HSCCC分離手性化合物的外消旋對(duì)映體。有理由相信, HSCCC技術(shù)在藥物的分離鑒別、質(zhì)量控制、定量分析等方面會(huì)有更加廣闊的應(yīng)用前景。5.發(fā)展前景與評(píng)價(jià)5.1 高速逆流色譜技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)HSCCC技術(shù)雖僅有20余年的發(fā)展歷史，但作為一種具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)的液-液分配色譜技術(shù)，HSCCC的發(fā)展可謂迅猛，技術(shù)也日臻全面和完善，在天然產(chǎn)物有效成分的分離純化領(lǐng)域中有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)并且獲得了廣泛的應(yīng)用。逆流色譜分離技術(shù)在黃酮類化合物分離純化的應(yīng)用中幾乎沒有限制，可以用于各種黃酮類化合物的分離。這主要是由于HSCCC 技術(shù)有足夠多的兩相溶劑體系以供選擇應(yīng)用，其洗脫方式靈活多樣，既可以使用單一流動(dòng)相，也可以一次使用不同的流動(dòng)相，甚至可以使用兩相溶劑同時(shí)雙向流動(dòng)，實(shí)現(xiàn)真正連續(xù)的逆流色譜過程。此外，HSCCC 還可以實(shí)現(xiàn)多種形式的梯度洗脫過程，既可用于天然植物粗提物的去除雜質(zhì)，也可用于最后產(chǎn)物的精制，甚至直接從未經(jīng)處理的粗提物一步純化得到純品。所有這些優(yōu)點(diǎn)在上面所述的應(yīng)用實(shí)例中都有具體體現(xiàn)。作為一種新興的，備受關(guān)注的分離純化技術(shù)，隨著越來越多的研究者的加入，HSCCC 必將得到更加廣泛的應(yīng)用和發(fā)展。5.2 高速逆流色譜技術(shù)的缺點(diǎn)盡管HSCCC 具有其它色譜分離方法不可替代的優(yōu)點(diǎn)。但是HSCCC 的更廣泛的應(yīng)用還受到一些因素的制約。首先在溶劑體系的選擇上還沒有非常系統(tǒng)、成熟的理論來指導(dǎo)，雖然已經(jīng)有學(xué)者建立了幾種經(jīng)驗(yàn)性的溶劑系統(tǒng)篩選方法，但這些方法均為經(jīng)驗(yàn)性的規(guī)律總結(jié)，如何選擇一種具有良好分離效果的溶劑體系還依賴于操作者的經(jīng)驗(yàn)，通常都需要多次實(shí)驗(yàn)才能篩選出較佳的溶劑系統(tǒng)。另外盡管目前的HSCCC 已經(jīng)能實(shí)現(xiàn)上百毫克甚至數(shù)十克級(jí)的制備分離，但是還未達(dá)到數(shù)百克級(jí)甚至公斤級(jí)的制備能力。此外，HSCCC 在中試規(guī)模和產(chǎn)業(yè)化當(dāng)中的應(yīng)用還需要對(duì)逆流色譜的分離機(jī)理從理論上做更深入的探討，還需要解決現(xiàn)有儀器設(shè)備在放大過程中的一些關(guān)鍵性技術(shù)問題。目前，已有科技人員著手這方面的研究，相信在不久的將來HSCCC 將發(fā)展成為一種更加成熟的可產(chǎn)業(yè)化的高效分離技術(shù)。5.3 高速逆流色譜的應(yīng)用前景5.3.1 HSCCC 的微型化以及與多種分析技術(shù)的聯(lián)用近年來, 分析型HSCCC的柱系統(tǒng)越來越向微型化發(fā)展, 如螺旋管柱體積可小到35mL, 柱內(nèi)徑小到0.30.4mm, 并可以通過各種接口技術(shù)與多種檢測(cè)器和化合物結(jié)構(gòu)分析技術(shù)相結(jié)合。尤其是HSCCC與MS的聯(lián)用,把HSCCC分離的靈活性、多樣性與MS的高靈敏度檢測(cè)和結(jié)構(gòu)分析特性良好地結(jié)合在一起,在天然活性成分的快速分離和鑒定方面顯示了其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì), 很有發(fā)展前景。同時(shí),要將HSCCC 發(fā)展成為一種高通量分離技術(shù), HSCCC的微型化也是必需的。5.3.2 HSCCC 在藥物工業(yè)化制備方面的應(yīng)用和發(fā)展HSCCC 從根本上是一種制備性色譜分離技術(shù), 目前實(shí)驗(yàn)室HSCCC的制備能力已經(jīng)達(dá)到中試HPLC 的制備規(guī)模。HSCCC 與HPLC的放大過程相比, 其分離過程簡(jiǎn)單,所用溶劑量比HPLC 要少75%,且所得目標(biāo)成分在分離級(jí)分中的濃度較高, 易于回收或作進(jìn)一步的處理。HSCCC 的放大過程不會(huì)改變其分離原理。分離過程可以采用典型的色譜理論很好地進(jìn)行描述和模型化。這種分離過程的可預(yù)測(cè)性、分離物質(zhì)的高回收率以及不用固體支撐體等優(yōu)點(diǎn), 使得HSCCC成為一種可用于工業(yè)化分離的很有前途和吸引力的分離制備方法。但是, 逆流色譜的真正工業(yè)化應(yīng)用還有很多的問題需要研究解決。大制備量?jī)x器的研制首先要搞清放大倍數(shù)、產(chǎn)量、分離效率與柱體參數(shù)的關(guān)系, 在理論指導(dǎo)下進(jìn)行有目的的可預(yù)測(cè)的放大。近年來, 英國(guó)B runel大學(xué)生物工程研究所的Sutherland教授研究小組及其合作者在這方面進(jìn)行了一系列的研究, 他們對(duì)一些試驗(yàn)樣品的分離, 在分離柱體積從5mL放大到5L, 上樣量擴(kuò)大1000倍的情況下, 可以幾乎在同樣的時(shí)間( 10m in)內(nèi)，實(shí)現(xiàn)同等效率的分離結(jié)果, 分離譜圖基本吻合, 為HSCCC儀器的工業(yè)化放大奠定了良好的基礎(chǔ)。5.3.3 HSCCC 在生物藥物高效分離中的應(yīng)用和發(fā)展HSCCC 在大環(huán)內(nèi)酯類和環(huán)肽類等抗生素藥物的分離制備中的應(yīng)用早有報(bào)道。在氨基酸和肽類衍生物等生物藥物成分的分離純化方面也有應(yīng)用, 并且采用pH- 區(qū)帶精制逆流色譜等新型分離純化技術(shù)可以使酸性或堿性的這類物質(zhì)達(dá)到10g量級(jí)的制備。但是采用HSCCC對(duì)蛋白質(zhì)等生物大分子藥物的分離制備還存在一些問題。主要是目前商業(yè)化的HSCCC儀器對(duì)于分離小分子藥物所需要的含有機(jī)相兩相溶劑體系有較高的固定相保留, 而對(duì)于分離生物大分子所需要的聚合物雙水相體系的保留能力較差, 而固定相的保留值是關(guān)系到分離效率高低的重要參數(shù)之一。因此, 研究和開發(fā)高效的分離生物大分子的HSCCC儀器和方法是近年來人們研究關(guān)注的又一個(gè)熱點(diǎn)問題，是制約HSCCC在藥物研發(fā)中廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵問題。首先, HSCCC 是一種相對(duì)較新的分離純化技術(shù),盡管它具有許多與生俱來的優(yōu)點(diǎn)，但是人們對(duì)它的認(rèn)識(shí)和理解還需要一個(gè)逐步深入的過程, 因而從某種程度上影響了它的應(yīng)用; 其次, HSCCC 技術(shù)的廣泛應(yīng)用還需要有更為成熟穩(wěn)定的儀器設(shè)備條件的支撐。目前國(guó)內(nèi)只有一二家專門從事逆流色譜儀器研發(fā)和生產(chǎn)的機(jī)構(gòu), 主要生產(chǎn)可用于實(shí)驗(yàn)室半制備分離的儀器。另外國(guó)家對(duì)該項(xiàng)技術(shù)研發(fā)的投入和支持也很有限, 缺乏對(duì)該項(xiàng)技術(shù)和相關(guān)設(shè)備的系統(tǒng)性的研究, 目前國(guó)內(nèi)可用于大規(guī)模生產(chǎn)的商業(yè)化儀器設(shè)備研制和開發(fā)還處于起步階段。國(guó)外已有工業(yè)化儀器設(shè)備面世, 但由于技術(shù)保密等方面的顧慮, 目前還沒有投放國(guó)內(nèi)市場(chǎng), 且價(jià)格昂貴。因此, HSCCC 的工業(yè)化大規(guī)模應(yīng)用還需要國(guó)家和有關(guān)行業(yè)的投入