基因轉導技術.doc

一、基本概念(一)基因導入(或基因轉導)將外源性基因(或基因組DNA)采用分子生物學技術人工地導入細胞，觀察它在細胞中的表達，研究其生物學特性和功能，這種把基因導入細胞中的技術稱為基因轉導(gent transfer)或稱基因轉移，也簡稱為導入。是研究基因表達、結構和功能的重要研究手段。(二)基因轉導的種類：目前基因轉導技術很多，可根據研究目的、對象和實驗條件加以選擇。1、染色體轉導：將染色體(甚至是全套染色體)和分離提取的細胞核或DNA大分子片斷，可采用細胞融合或細胞顯微注射法將染色體或染色體片斷導入細胞內并與受體細胞(或稱宿主細胞)發(fā)生DNA整合，研究整合的細胞特性和功能，這種轉導稱為染色體轉導，這項技術在細胞融合和單克隆抗體雜交瘤技術中已介紹，本章從略。2、基因轉導：將已克隆到的目的基因（或基因的DNA片斷或序列），轉導入離體細胞中進行表達的方法稱基因轉導，它有兩類：一類是將目的基因轉導入體外培養(yǎng)的細胞，另一類是導入從體內取出的細胞中，觀察目的基因在細胞中表達，這項技術稱基因轉染(gene transfection)。體外培養(yǎng)的人體細胞可以是已建立的細胞系(株)包括二倍體正常細胞。如同體內細胞，如淋巴細胞、LAK細胞、TIL細胞等，基因導入后再回輸體內，已用于基因治療(gene treatment),另一類是將已克隆化的目的基因導入受精卵，導入基因后的受精卵植入子宮，發(fā)育成胚胎和個體，可在胚胎期和出生后觀察目的基因在整體內的表達，此項技術稱轉基因技術（transgenic technique）,轉基因技術所產生的動物稱轉基因動物(transgenic animal)。基因轉染的方法常用磷酸鈣法、脂質體介導法、電擊法(電穿孔技術)、DEAE葡聚糖法、細胞顯微注射法等，這均屬于物理、化學方法的轉基因技術，此法轉入至細胞內的基因一般均不與細胞染色體發(fā)生整合，而是在細胞質呈現暫時性表達，但不持久，隨時間推移而逐漸減弱或消失，為了使目的基因進入細胞后能與細胞基因組DNA發(fā)生整合、產生永久性的表達，常用病毒載體將目的基因導入細胞，并發(fā)生整合，如用逆轉錄病毒、皰疹、腺病毒等改建的病毒載體、因此基因細胞內轉導技術可歸納如下： 細胞融合技術 染色體轉導 染色體轉導(顯微注射法)基因細胞內轉導 基因轉染 磷酸鈣沉淀法、電擊法、脂質體法、 (體細胞) 顯微注射法、逆轉錄病毒等病毒介導法 基因轉導 其它 轉基因技術 (生殖細胞)(三)目的基因和受體細胞選擇1、目的基因的選擇：從基因來說，存在有功能性基因和誘發(fā)細胞轉化的基因及使癌細胞發(fā)生逆轉分化的抑癌基因，功能性基因表達時能產生特定的功能性蛋白，如細胞因子IFN、IFN、IFN、IL-2IL-18、TNF、CSFS、EPO、TPO等有功能性基因可選用來進行基因制藥。另一類是誘發(fā)轉化的基因，可誘生細胞發(fā)生無限制增殖，發(fā)生永生化和惡性化的細胞轉化，因此細胞轉化試驗應選用癌基因或原癌基因。還有一類基因可以誘導細胞分化，使腫瘤細胞逆轉向正常細胞分化。因此在研究對腫瘤細胞誘導分化時，應選用抑癌基因。細胞培養(yǎng)已成為研究基因、癌基因和抑癌基因表達的重要手段。2、受體細胞的選擇：不同的受體細胞對導入后基因表達有很大影響，同樣的目的基因進入不同的受體細胞中表達能力差異較大，有的為高表達，有的呈現低水平表達，有的甚至不能表達，如-球蛋白基因在導入MEL14(ATCC、HB132)細胞中能促進細胞發(fā)生分化，具有高表達功能，但導入HELA細胞中卻無表達，因此受體細胞的選擇也應引起關注?；驅爰毎蟮谋磉_與受體細胞性狀、細胞種類和細胞來源密切相關。此外，若目的在于獲取瞬時表達效果可采用磷酸鈣沉淀法、電擊法、脂質體法等；若目的要獲取永久性穩(wěn)定表達應選用逆轉錄病毒等病毒載體導入法。下面介紹幾種常用基因轉染方法。二、物理化學法基因轉染技術(一)磷酸鈣-DNA共沉淀法核酸以磷酸鈣-DNA共沉淀物的形式出現時，可使DNA附在細胞表面，利于細胞吞入攝取，或通過細胞膜脂相收縮時裂開的空隙進入細胞內，進入細胞的DNA僅有1%5%可以進入細胞核中，其中僅有不到1%的DNA可以與細胞DNA整合，在細胞中進行穩(wěn)定表達，基因轉導的頻率大約為10-4，這項技術能用于任何DNA導入哺乳類動物進行暫時性表達或長期轉化的研究。此方法對于貼壁細胞轉染是最常用并首選的方法。1、配液(1)2HBS 1.63g NaCl 1.19g Hepes 0.023g Na2PO4、2H2O 加水至100ml pH7.1過濾，4保存(2)2mmol/L CaCl2 過濾除菌(3)TE：0.1mmol/L EDTA 1mmol/L Tris-HCL PH8.0(4)G418(新霉素G418)液：1g G418溶于1mmol/L Hepes液中，加H2O至10mL過濾除菌4保存。(5)G418選擇培養(yǎng)基：用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配制G418，G418濃度為200800mg/L注意：對受體細胞先做預試驗，選用濃度為在1014天內能殺死細胞50%以上的最低濃度。2、操作步驟方法一：(1)供體DNA制備：方法按前介紹的DNA提取法提取，溶于TE中，40mg/L。(2)受體細胞的培養(yǎng)：研究癌基因轉移應選擇不含人類Alu序列的動物細胞系作為受體細胞。如小鼠NIH3T3胚成纖維細胞系等，該細胞有一定自發(fā)轉化傾向，一般在轉染前一天接種細胞，接種密度為2104/cm2,用含10%胎牛血清的DMEM液，37、5%CO2培養(yǎng)，待細胞占5070%瓶底面積時，用于轉染試驗。(3)DNA-磷酸鈣沉淀物的制備將供體細胞DNA和PSV2-neo質粒載體DNA用TE配制成40mg/L的DNA溶液，同時向供體細胞DNA液200l中加入帶基因neo質粒DNA液(20mg/L)220l和2HBS 250l(PSV2-neo為12mg/L的使用量)。取500l上述DNA溶液加入硅化試管中，緩慢加入3.1ml、2mol/L CaCl2混勻30秒。然后立即混旋，室溫下靜置30分鐘，待溶液輕度混濁后，吹打后即用于轉染受體細胞。(4)轉染受體細胞將處于對數生長期已占瓶底5070%的受體細胞，在轉染前4小時更換一次新鮮培養(yǎng)基，每瓶5ml（25ml培養(yǎng)瓶）。吸取0.5mLDNA-磷酸鈣沉淀，加入含5mL培養(yǎng)液的細胞瓶中搖勻。置37 5% CO2培養(yǎng)24h或更長，使細胞充分吸入DNA-磷酸鈣結晶顆粒。更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時，誘導轉染基因的表達。更換濃度800mg/L的G418選擇培養(yǎng)液進行篩選。同時設有未能轉染的對照細胞。培養(yǎng)大約35天，對照細胞大部分死亡，這時轉染細胞更換濃度為200mg/L的G418選擇培養(yǎng)基，每34天更換一次選擇培養(yǎng)基。2周后對照細胞死亡，在轉染的細胞瓶中可見有抗藥性的細胞克隆出現，待其增大后再進行克隆化和擴大培養(yǎng)，可建立轉化細胞株，并做進一步鑒定。本實驗要加入PSV2-neo、DNA與外源DNA共轉染受體細胞，這樣可使受體細胞獲得新霉素(neo)基因的抗藥性，這樣即使癌基因沒有出現明顯的“轉化灶”，也可測出轉入的外源性基因的抗neo的標記。而且還可利用被neo基因導入的受體細胞通過G418選擇培養(yǎng)篩選轉化的細胞建立細胞株。若以獲取“轉化灶”為目的，可不加入PSV2-neo DNA只需將從癌細胞中提取的基因組DNA導入受體細胞即可，其方法如下：3、基因組DNA轉染方法二：(1)配制磷酸轉染液 NaCl 8.0g Hepes 5.0g 用時現配，pH很重要一定要控制在6.950.65 Na2HPO4 0.099g 消毒滅菌 -20貯存?zhèn)溆?加溫水至 1000mL(2)按前面介紹的方法提取癌細胞基因組DNA。(3)取供體基因組DNA50100g,加3M NaCl或醋酸鈉，使最終濃度至0.3M混勻。(4)再加2倍體積無水乙醇3000r/min離心10分鐘，去上清。(5)加入轉染緩沖液，待DNA充分溶解后，再加入2.5MCaCl2,含最終濃度為125mM，用吸管輕輕吹打三次(不用攪拌器以防DNA袢結)，置室溫下1030分鐘，待液體透明度降低，出現微濁蘭色時，即可用于轉染細胞。(6)取生長狀態(tài)良好處于半匯合階段的對數生長期細胞，在轉染前4小時，更換培養(yǎng)液(5ml/瓶)1次。(7)轉染：向每瓶中加DNA-磷酸鈣沉淀物0.51mL/瓶，置37作用46小時。(8)培養(yǎng)：棄去培養(yǎng)液，用15%甘油處理3分鐘，無血清培養(yǎng)漂洗1次，接近匯合時血清用量降至5%，培養(yǎng)23周。(9)檢測：逐日觀察，待出現“轉化灶”后，克隆分離，擴大培養(yǎng)建立轉化細胞株。(二)脂質體介導DNA轉染法脂質體(lipofectin regeant,LR)試劑是陽離子脂質體N-1-2，3-Dioleyoxy, Propyl-n, n,n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物1:1(w/w)。它適用于把DNA轉染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細胞中，是目前條件下最方便的轉染方法之一。轉染率高，優(yōu)于磷酸鈣法，比它高5100倍，能把DNA和RNA轉染到各種細胞。用LR進行轉染時，首先需優(yōu)化轉染條件，應找出該批LR對轉染某一特定細胞適合的用量、作用時間等，對每批LR都要做：第一，先要固定一個DNA的量和DNA/LR混合物與細胞相互作用的時間，DNA可從15g和孵育時間6小時開始，按這兩個參數繪出相應LR需用量的曲線，再選用LR和DNA兩者最佳的劑量，確定出轉染時間(224小時)。因LR對細胞有一定的毒性，轉染時間以不超過24小時為宜。細胞種類：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一種細胞均可作為受體細胞。1、操作步驟方法一：(1)細胞培養(yǎng)：取6孔培養(yǎng)板(或用35mm培養(yǎng)皿)，向每孔中加入2mL含12105個細胞培養(yǎng)液，37CO2培養(yǎng)至40%60%匯合時(匯合過分，轉染后不利篩選細胞)。(2)轉染液制備：在聚苯乙稀管中制備以下兩液(為轉染每一個孔細胞所用的量)A液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋1-10g DNA，終量100L，B液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋2-50gLR，終量100L,輕輕混合A、B液，室溫中置10-15分鐘，稍后會出現微濁現象，但并不妨礙轉染(如出現沉淀可能因LR或DNA濃度過高所致，應酌情減量)。(3)轉染準備：用2mL不含血清培養(yǎng)液漂洗兩次，再加入1mL不含血清培養(yǎng)液。(4)轉染：把A/B復合物緩緩加入培養(yǎng)液中，搖勻，37溫箱置624小時，吸除無血清轉染液，換入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。(5)其余處理如觀察、篩選、檢測等與其它轉染法相同。注意：轉染時切勿加血清，血清對轉染效率有很大影響。2、快速脂質體轉染法操作步驟如下方法二：(1)以5105細胞/孔接種6孔板(或35mm培養(yǎng)皿)培養(yǎng)24小時，使其達到5060%板底面積。(2)在試管中配制DNA/脂質體復合物方法如下：在1mL無血清DMEM中稀釋PSV2-neo質粒DNA或供體DNA。旋轉1秒鐘，再加入脂質體懸液，旋轉。室溫下放置510分鐘，使DNA結合在脂質體上。(3)棄去細胞中的舊液，用1mL無血清DMEM洗細胞一次后棄去，向每孔中直接加入1mL DNA/脂質體復合物，37培養(yǎng)35小時。(4)再于每孔中加入20%FCS的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)1424小時，(5)吸出DMEM/DNA/脂質體混合物加入新鮮10%FCS的DMEM，2mL/孔，再培養(yǎng)2448小時。(6)用細胞刮或消化法收集細胞，以備分析鑒定。穩(wěn)定的脂質體轉染方法如下：(1)接種細胞同前，細胞長至50%板底面積可用于轉染。(2)DNA/脂質體復合物制備轉染細胞同前(2)、(3)步驟。(3)在每孔中加入1mL、20%FCS的DMEM，37培養(yǎng)48小時。(4)吸出DMEM，用G418選擇培養(yǎng)液稀釋細胞，使細胞生長一定時間，篩選轉染克隆，方法參照細胞克隆篩選法進行。(三)DEAE-葡聚糖轉染法DEAE-葡聚糖介導的轉染，其原理還不清楚，可能是通過內吞噬作用而使DNA轉導進入細胞核，此法只適合暫時轉染實驗，轉染效率與DEAE-葡聚糖濃度以及細胞與DNA/DEAE-葡聚糖混合液接觸時間的長短很有關系，可采用較高濃度的DEAE-葡聚糖(1g/L)作用較短時間(30分鐘-1.5小時)，又可用較低濃度(250g/L)的DEAE-葡聚糖作用較長時間(8小時)。方法如下：(1)接種鼠L成纖維細胞濃度為5105CO2/孔/皿生長23天，當達50%板底面積可用。(2)乙醇沉淀的4g的PSV2-neo質粒DNA，空氣干燥后溶于40L的TE中，或取供體DNA。(3)用10ml 1PBS、4mL、10%富合生長因子血清的DMEM洗板(皿)。(4)在80l熱的10g/L DEAE-葡聚糖中緩慢加入DNA，取120L DNA/DEAE-葡聚糖加到每孔(皿)細胞中，使其分布均勻輕輕轉動直到顯示均勻一致的紅色，培養(yǎng)4小時。(5)從孔(皿)中吸出DNA/DEAE-葡聚糖，加入5mL 10%DMSD，室溫放置1分鐘，吸出DMSO，用5mL 1PBS洗一次吸出，加入10mL培養(yǎng)液(10%血清的DMEM)。(6)培養(yǎng)細胞，在適當時間分析細胞，若含有抗藥基因，可用G418選擇培養(yǎng)液培養(yǎng)，方法同前。(四)電擊法(Electroporation)1、原理：本法需用特殊設置(電穿孔儀)，把懸浮狀態(tài)的受體細胞和供體DNA共同放入皿中(或杯中)，再施以高壓電脈沖，能夠促進DNA通過細胞膜而進入胞內，并可整合到細胞的DNA中，使細胞發(fā)生轉化。如轉移的DNA為帶有選擇標記基因的質粒，也可在選擇培養(yǎng)基中進行鑒定，方法如下：(1)DNA制備(同前)(2)細胞：離心收獲對數生長期細胞5106。(3)漂洗：吸除上清，加4PBS冰浴20分鐘，離心去上清。(4)重懸：于冷4PBS中重懸細胞，調成5106/ml PBS。(5)加DNA：加入已被酶切割的DNA 1-10g（原體積75l），裝入電擊小室中，把小室置于電擊器中。(6)電擊準備：接通電源，調至2000V和0.9mA極限，將瓦數和電流標度盤調到5%。(7)電擊：接通安全開關，使電源橫過電擊室放電，在無菌條件下，把電擊后細胞轉入培養(yǎng)瓶中，續(xù)加10ml培養(yǎng)液，置37CO2培養(yǎng)。(8)培養(yǎng)：如含有標記neo基因，可按前述篩選培養(yǎng)法處理。注意：上述電擊參數僅供參考，與其它方法一樣，因細胞轉染DNA不同，所需電擊條件可能需相應改變，因此為獲理想效果，以求得最佳條件。(五)細胞顯微注射轉染法本法是借助顯微注射器直接把DNA注射入核內，使之發(fā)生整合入受體細胞基因組中的技術。本技術需要有嚴密無菌的凈化室，以免敞開操作污染，同時要能有自動拉針儀以制備顯微針，一般用手動拉針器拉制時要能使針末端有一個0.6cm長的細部，太長易折斷，針尖開口為23m間，針口小于1m更佳，針尖開口大于5m易刺傷細胞。具體方法如下：(1)注射用DNA制備(同前)。(2)顯微注射針：取顯微注射針數個，鏡下挑選最佳者，高壓滅菌后，無菌吸入一定量的DNA，把注射針安裝在顯微針持針器上，調動控制器旋扭，選擇注入DNA壓力參數。(3)細胞：取一皿生長狀態(tài)良好的細胞，置于顯微針臺上(能自控調溫)，敞開皿蓋，調動持針器把顯微針移入培養(yǎng)皿內。(4)注射準備：調動持針器旋扭，把針尖調至接近細胞(相差鏡下觀察)使針的長軸與培養(yǎng)皿平面保持30左右。超過45注射時，針尖易折斷，小于30時，針的柄部會受培養(yǎng)皿邊緣阻擋，靠在皿邊上能有助于限制注射針的活動范圍。(5)注射：選健康完整的細胞(或受精卵)，把注射針尖調至對準細胞質邊緣（如接近中央或超過中央，注射時細胞易被針尖穿透），腳踏注射開關，則一定量的DNA即被注射入細胞內，可立見細胞微微膨張。說明DNA已被注入，如此反復注射至所需數量的細胞。(6)培養(yǎng)：其培養(yǎng)、觀測、篩選等方法與其它轉染法相同采用此法在大量細胞群中被注射的細胞僅為少數，由于注射損傷，需進行修復，增殖變慢，因此，難以從中克隆出被轉染的細胞，因此采用neo基因共轉染和G418篩選法是可行的或采用標記刮除法也可。細胞顯微注射法除適于注射DNA片斷、寡核苷酸外，也可用于注射蛋白質、抗體及各種對細胞有影響的藥物。三、逆轉錄病毒載體介導DNA轉染逆轉錄病毒載體屬RNA病毒，但可在受染細胞內反轉錄產生DNA互補鏈，此DNA單鏈可作為模板合成第二條DNA鏈，第二條DNA鏈可摻入細胞基因組DNA中。此病毒可利用宿主細胞的酶自行轉錄與復制，RNA可合成蛋白，再包裝病毒，RNA從胞內釋放，成為感染性病毒，該載體可經不同方式改變。介導過程可使病毒單拷貝基因組穩(wěn)定地進入細胞。首先，逆轉錄病毒的繁殖必須要有適當的包裝細胞系，以利于產生高滴度的病毒，同時還具有適當的結構。如：2、(第一代包裝細胞)，PA317(第二代包裝細胞) 1-CRIP、PG13、DA、CFA(第三代包裝細胞)，包裝細胞可提供逆轉錄病毒gag、pol和env蛋白才能使帶有包裝信號及目的基因的病毒載體RNA進行包裝，包裝細胞只提供gag、pol和env蛋白而不產生具有復制能力的野生型病毒(RCR)，而第一代包裝細胞可產生RCR，安全性較差；第二代包裝細胞，臨床上已廣泛應用，也未發(fā)現產生RCR，安全性好；第三代包裝細胞更加安全，第三代包裝細胞中主要區(qū)別是病毒結構基因中env不同。反轉錄病毒作為基因轉移的載體有如下特點：反轉錄病毒感染細胞的效率高，基因轉移率在10%-100%；病毒基因轉移能將外源基因整合到宿主細胞基因組中外源基因能穩(wěn)定存在而不丟失；外源基因整合的拷貝數一般只有一個；反轉錄病毒只選擇感染分裂細胞；病毒可容納外源基因的DNA長度為8Kb。反轉錄病毒載體的結構：已切除了病毒的結構基因gag，大部分pol和env，包括兩側的LTR，被選擇(標記)基因和目的基因插入的多聚位點所取代，同時還帶有包裝信號。(一)可產生特異性逆轉錄病毒細胞系的建立1、逆轉錄病毒載體進入包裝細胞系概術：從細胞質粒中產生感染性病毒包括將質粒導入包裝細胞系，可從穩(wěn)定感染細胞中選擇病毒產生細胞或用一個包裝細胞系暫時產生的病毒感染另一種有不同包裝的細胞系，從中選擇病毒的產生細胞。1.1準備工作用品：(1)適當的包裝細胞系及培養(yǎng)液(2)大多數包裝細胞系為鼠源的，含有鼠“Helpe病毒”，此病毒可幫助被去除某些功能結構基因的逆轉錄病毒復制，并包裝于蛋白衣殼中。(3)逆轉錄病毒質粒DNA常構建成含有抗藥基因neo新霉素基因的載體。(4)Hepes-緩沖液(HeBs)。(5)2mol/L CaCL2。(6)含血清及不含血清培養(yǎng)液。(7)HeBs+15%甘油（HeBs/甘油）。(8)800mg/L(100聚凝胺)(肝素對抗物)。(9)10%15%DMSO。(10)10cm、6cm培養(yǎng)皿。(11)24孔、6孔培養(yǎng)板。(12)克隆環(huán)。1.2 操作步驟：(1)轉染前，10cm培養(yǎng)皿中接種大約10%20%皿底面積的包裝細胞。(2)將10g含抗藥基因的逆轉錄病毒質粒DNA加入0.5mL HeBs中，加入32L 2mol/L CaCL2,輕振動，加蓋30分鐘，室溫下培養(yǎng)45分鐘，直到小的、模糊的蘭色沉淀產生。(3)從包裝細胞中棄去舊液，輕輕滴入HeBs-DNA沉淀于細胞培養(yǎng)皿中心，使細胞接觸DNA20分鐘，每10分鐘輕輕搖動培養(yǎng)皿，使溶液均勻，加入10mL培養(yǎng)液，并于37放置4小時。(4)完全吸出培養(yǎng)液，逐滴加入2.5mL的HeBs/甘油，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，如果使用的是2/YCRE/YCRIP/PA317包裝細胞系，需培養(yǎng)3.5分鐘，若為Q2bn包裝細胞系，需培養(yǎng)1.5分鐘，或根據不同包裝細胞選用不同時間。迅速棄去HeBs/甘油，用10mL培養(yǎng)液洗2次，加入含有血清的5ml培養(yǎng)液培養(yǎng)1824小時。(5)取出培養(yǎng)液用0.45m過濾，可獲得含有短期產生病毒的培養(yǎng)上清，-70或-80貯存，或立即用于其它包裝細胞系的感染。(6)加入10ml培養(yǎng)液于上述已感染的細胞，繼續(xù)培養(yǎng)23天，繼續(xù)步驟10。(7)另一包裝細胞受感染前1:10或1:20傳代。(8)倒去包裝細胞的培養(yǎng)液，加入步驟5獲得的病毒。方法如下：對于10cm培養(yǎng)皿，將0.1至1.0mL病毒貯存液稀釋至35mL的終體積，加入800mg/L聚凝胺至終濃度為8 mg/L，培養(yǎng)1小時以上。(9)若10cm培養(yǎng)皿加入10mL培養(yǎng)液，6mL培養(yǎng)皿中應加入4mL培養(yǎng)液，培養(yǎng)23天。(10)步驟6或步驟9得到的感染細胞，23天后按1:10或1:20傳代，接種于選擇培養(yǎng)液培養(yǎng)3天，更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)34天，直至克隆出現。(11)用克隆環(huán)挑出分離的克隆，每個克隆接種24孔板或6孔板中的二個孔，生長至5090%底部面積。(12)倒去培養(yǎng)液，換入1倍體積的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)13天，收取培養(yǎng)液，馬上滴定，或者貯存于-70或-80。(13)繼續(xù)傳代克隆細胞直到能被冷凍或被鑒定，若病毒產生克隆被鑒定，10%15%DMSO保護劑液氮凍存細胞。即產生病毒細胞系建立。2、病毒滴度鑒定在分離產生病毒的克隆后，需進行病毒滴度的測定，常用的方法是用病毒感染目的細胞，可根據載體RNA或蛋白的出現粗略定量分析。2.1準備工作：(1)病毒貯存液（步驟5所得）(2)目的細胞系(NIH3T3成纖維細胞)(3)G418或其它選擇性藥物2.2操作步驟：(1)目的細胞系NIH3T3細胞在感染前一天按1:10至1:20接種6cm培養(yǎng)皿。(2)感染當日，棄去目的細胞培養(yǎng)舊液，加入含病毒的貯存液(步驟5所得)，用12ml含0.010.1病毒貯存液感染6cm培養(yǎng)皿目的細胞(或者35ml用于10cm培養(yǎng)皿中的細胞)，加入800 mg/L聚凝胺至終濃度為8 mg/L，培養(yǎng)13小時，37。(3)加入培養(yǎng)液，稀釋聚凝胺至2 mg/L，再繼續(xù)培養(yǎng)23個細胞周期(NIH3T3細胞周期為23天)。(4)-a，如果病毒帶有組化標記基因，如LacZ,用X-gal染色感染細胞。按步驟6計算藍色克隆的數量以得到病毒的滴度。(4)-b，如果病毒攜帶抗藥基因，傳代細胞應選擇培養(yǎng)條件。如果抗藥基因為neo，細胞按1:10至1:20傳代，接種含有G418的兩個10cm(或6cm)培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)3天。(5)更換培養(yǎng)液(含選擇性G418藥物)共培養(yǎng)7-10天，此時克隆應該非常明顯，計算克隆數。(6)滴度計算公式 G418-RCFU(集落形成單位)/m=克隆數/病毒體積(mL)復制因子X接種率若為(4)-a中所敘，病毒攜帶LacZ,用X-gal染色細胞根據顯示的克隆數，計算病毒的滴度，其公式為： X-gal CFU/mL=X-gal陰性克隆數/病毒體積(mL)(7)其它方法再鑒定產生病毒的克隆，細胞所產生的病毒基因無重新排列或缺失。附注：X-gal對感染細胞的染色方法（此方法可使該病毒感染細胞著色，可用于直接測量病毒滴度）。準備工作：除以上各種實驗用品外，尚需：帶有LacZ編碼病毒的轉染(或感染)的細胞；固定液：0.05%戊二醛或2%多聚甲醛；Xgal染液。操作步驟：倒去培養(yǎng)液，向感染細胞的皿中加入固定液(6cm皿加2mL，10cm皿加5mL)，加2%多聚甲醛室溫固定60分鐘，或0.05%戊二醛固定515分鐘。去除固定液，用PBS洗3次，第二次洗滌時放置10分鐘，首次和末次洗滌時則快速。加入最小體積的X-gal溶液，蓋住細胞371小時或過夜，陽性細胞（病毒感染細胞）則成蘭色。(二)原代培養(yǎng)正常上皮細胞的逆轉錄病毒轉染通過將病毒基因轉染到上皮細胞中，使細胞可在體外無限生長，保持正常上皮細胞的特點。1、準備工作：(1)產生病毒的細胞系，方法見上。(2)DMEM培養(yǎng)液+谷氨酰胺 0.02g/mL 胰島素 0.25g/mL 轉鐵蛋白 0.12g/mL 葡萄糖 67.5g/mL 10%小牛血清 聚凝胺 1g/mL 氫化考的松 0.02g/mL(3)絲裂霉素C、胰酶、6cm培養(yǎng)皿2、操作步驟：(1)病毒產生細胞系暴露于絲裂霉素C(4 mg/L)2小時，洗干凈后，胰酶消化，按5106接種6cm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)液為DMEM。(2)待轉染的原代培養(yǎng)正常上皮細胞接種于鋪有以上細胞的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)3天。(3)更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。(4)取50L培養(yǎng)上清，進行病毒滴度檢測，方法同前，91037104集落形成單位/mL可用于轉染。(5)正常上皮原代培養(yǎng)10天后，取貼在飼養(yǎng)層細胞的上皮細胞，保留至上皮細胞數生長量足夠選擇。(6)在上皮細胞生長24周內，成活的克隆用克隆環(huán)挑出，再繼續(xù)使用三輪有限稀釋法建立單個細胞系克隆。3、鑒定：按病毒所帶有的抗藥基因進行選擇培養(yǎng)篩選，或其它方法鑒定轉染細胞，方法見后。4、注意事項：無論用什么方法將DNA導入細胞，暫時或穩(wěn)定的轉染率很大程度取決于細胞的