黃傘子實(shí)體多糖免疫活性的研究-本科畢業(yè)論文

中中華華人人民民共共和和國國教教育育部部 東東北北林林業(yè)業(yè)大大學(xué)學(xué) 畢 業(yè) 論 文 論文題目 黃傘子實(shí)體多糖免疫活性的研究 學(xué) 生 王志強(qiáng) 指導(dǎo)教師 李德海 講師 學(xué) 院 林學(xué)院 專 業(yè) 食品科學(xué)與工程 2006 級 1 班 2010 年 6 月 東北林業(yè)大學(xué) 畢 業(yè) 論 文 任 務(wù) 書 論文題目 黃傘子實(shí)體多糖免疫活性的研究 學(xué) 生 王志強(qiáng) 指導(dǎo)教師 李德海 講師 專 業(yè) 食品科學(xué)與工程 2006 級 1 班 2010 年 3 月 15 日 題目名稱題目名稱 黃傘子實(shí)體多糖免疫活性的研究 任務(wù)內(nèi)容 包括內(nèi)容 計(jì)劃 時(shí)間安排 完成工作量與水平具體要求 任務(wù)內(nèi)容 包括內(nèi)容 計(jì)劃 時(shí)間安排 完成工作量與水平具體要求 研究內(nèi)容 研究內(nèi)容 研究黃傘子實(shí)體多糖純化及免疫活性 實(shí)驗(yàn)部分采用水提醇沉法 料液比 1 20 提取時(shí)間 2h 提取溫度 90 的提取條件 提取次數(shù) 2 次 合并兩次的提取液 粗多糖 經(jīng) Sevag 中性蛋白酶 法除去蛋白質(zhì) 并比較兩種方法除蛋白的效率 多糖免疫活性 的測定指標(biāo)為 小鼠臟體比 遲發(fā)型超敏反應(yīng) 血清溶血素和小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能 研究計(jì)劃與時(shí)間安排 研究計(jì)劃與時(shí)間安排 2009 03 20 2009 04 15 查找與課題有關(guān)的文獻(xiàn)和資料 2009 04 16 2009 05 20 翻譯外文文獻(xiàn) 資料整理 2009 05 21 2009 05 30 確定實(shí)驗(yàn)方案并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)材料及儀器藥品的訂購 2009 06 01 2009 06 10 黃傘子實(shí)體多糖的提取及多糖含量的測定 2009 06 11 2009 06 30 黃傘子實(shí)體多糖中去除蛋白效率比較及多糖含量的測定 2009 07 01 2009 08 10 黃傘子實(shí)體多糖動(dòng)物免疫試驗(yàn) 2009 08 11 2009 08 20 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理 2009 08 21 2009 10 10 撰寫論文 修改論文至定稿 2010 05 11 2010 06 13 整理文檔 準(zhǔn)備答辯 完成工作量與水平要求 完成工作量與水平要求 要求在實(shí)驗(yàn)過程中 能夠運(yùn)用所學(xué)專業(yè)基本知識 基本理論獨(dú)立的分析問題 解決 問題 能夠熟練的查閱中英文資料 并準(zhǔn)確把握資料的有效信息 最終獨(dú)立的完成黃傘 子實(shí)體多糖純化及免疫活性的研究 并對實(shí)驗(yàn)結(jié)果作基本的分析討論 論文撰寫符合東 北林業(yè)大學(xué)畢業(yè)論文要求 其中 參考文獻(xiàn)篇數(shù) 20 篇以上 論文字?jǐn)?shù) 20 000 字左右 外文翻譯 3 篇以上 學(xué)科負(fù)責(zé)人意見學(xué)科負(fù)責(zé)人意見 東北林業(yè)大學(xué)畢業(yè)論文 2 簽名 年 月 日 黃傘子實(shí)體多糖免疫活性的研究黃傘子實(shí)體多糖免疫活性的研究 摘 要 黃傘學(xué)名 Pholiota adiposa Fr Quel 在分類學(xué)上屬真菌門 Eumycota 擔(dān)子菌 亞門 Basidiomycotina 層菌綱 Hymenomy2cetes 傘菌目 Agaricales 球蓋菇科 StropHariaceae 環(huán)銹傘屬 GenusPHolipta 又名柳蘑 是一種藥食同源植物 黃傘 子實(shí)體含有 21 64 粗蛋白 1 22 粗脂肪 8 04 粗纖維 4 11 多糖 5 88 灰分 本文探討了黃傘子實(shí)體多糖的初步純化及對小鼠免疫力提高的影響 黃傘子實(shí)體多 糖經(jīng)中性蛋白酶和 Sevag 法聯(lián)合除蛋白 其多糖含量為 72 88 試驗(yàn)動(dòng)物分為五組 空 白組 模型組 黃傘子實(shí)體多糖高 400mg kg 中 200mg kg 低 100mg kg 劑量組 空白組和模型組每天灌胃等量生理鹽水 給藥組灌胃相應(yīng)劑量的提取物 小鼠腹腔注射 120 mg kg 環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)免疫抑制小鼠模型 35d 后進(jìn)行小鼠臟體比 遲發(fā)型超敏反應(yīng) DTH 碳廓清試驗(yàn)和血清凝集試驗(yàn) 結(jié)果表明黃傘子實(shí)體多糖能顯著提高免疫器官 重量 P 0 05 P 0 01 提高 DTH 提高小鼠血清溶血素的效價(jià) 增強(qiáng)吞噬細(xì)胞吞噬能 力 P 0 05 關(guān)鍵詞 關(guān)鍵詞 黃傘 多糖 免疫活性 小鼠 Study of polysaccharide immunological active from the fruit body of Pholiota adipose Abstract Pholiota adipose Fr Quel is a plant belonging to Eumycota Basidiomycetes Homobasidiae A garicales Strophariaceau which is drug combination of fungal food It has been reported that fruit body of Pholiota adipose has abundant nutrients for instance it contains 21 64 crude protein 1 22 crude fat 8 04 crude fiber 4 11 polysaccharide 5 88 ash This study was designed to investigate the immunomodulatory effect of polysaccharides from the fruit body of PHoliota adipose Polysaccharides were administered orally at different dose 400 200 and 100 mg kg body weight to three group of mice 1 normal 2 NS control group and 3 the model of immune depressive group with cylopHospHamide respectively For evaluation of immunomodulatory effect the weights of spleen and liver delayed type hypersensitivity DTH the hemolysin in serum test and the carbon expurgation test were performed Polysaccharide content was up to 72 88 in the mixtrue extracted from fruit body of PHoliota adipose Polysaccharides at all tested doses heavy middle and slight significantly improved the weight of the mice s spleen and liver P 0 05 or P 0 01 DTH and the hemolysin in serum The level of the carbon expurgation in any dose groups has been significantly improved P 0 05 as well Key words PHoliota adipose polysaccharides immunomodulation mice 東北林業(yè)大學(xué)畢業(yè)論文 2 目目 錄錄 摘要摘要 Abstract 1 1 緒論緒論 1 1 1 黃傘簡介 1 1 1 1 黃傘營養(yǎng)成分分析 1 1 1 2 黃傘栽培歷史和發(fā)展現(xiàn)狀 2 1 2 植物多糖的不同提取方法的研究進(jìn)展 2 1 2 1 溶劑提取法 2 1 2 2 酶提取法 2 1 2 3 微波提取法 3 1 2 4 超聲波提取法 3 1 2 5 其他提取方法 3 1 3 食用菌多糖的純化 3 1 3 1 除蛋白 3 1 3 2 脫色 4 1 3 3 除小分子雜質(zhì) 4 1 3 4 多糖的分級純化 4 1 4 多糖及其功能性質(zhì) 6 1 4 1 多糖的概念及來源 6 1 4 2 真菌活性多糖 6 1 4 3 活性多糖的生理功能 7 1 5 植物多糖的開發(fā)利用 9 1 6 論文研究的目的和意義 9 1 7 主要研究內(nèi)容 9 2 2 材料與方法材料與方法 10 東北林業(yè)大學(xué)畢業(yè)論文 2 2 1 試驗(yàn)材料 10 2 1 1 試驗(yàn)原料 10 2 1 2 試驗(yàn)試劑 10 2 1 3 試驗(yàn)主要儀器 10 2 2 試驗(yàn)方法 11 2 2 1 黃傘子實(shí)體多糖的提取 11 2 2 2 黃傘子實(shí)體多糖的初步純化 11 2 2 3 多糖含量的測定 11 2 2 4 動(dòng)物 11 2 2 5 劑量選擇與飼喂 11 2 2 6 免疫器官重量試驗(yàn) 12 2 2 7 遲發(fā)型超敏反應(yīng) DTH 12 2 2 8 血清溶血素試驗(yàn) 12 2 2 9 單核 吞噬細(xì)胞功能試驗(yàn) 12 2 3 統(tǒng)計(jì)分析 13 3 3 結(jié)果與討論結(jié)果與討論 14 3 1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 14 3 2 黃傘子實(shí)體多糖的初步純化 14 3 3 黃傘多糖提高免疫力的研究 14 3 3 1 免疫器官重量試驗(yàn) 14 3 3 2 遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn) 16 3 3 3 血清溶血素試驗(yàn) 17 3 3 4 單核 吞噬細(xì)胞功能試驗(yàn) 17 4 4 結(jié)論結(jié)論 19 4 1 黃傘子實(shí)體多糖的初步純化 19 4 2 黃傘子實(shí)體多糖免疫活性的測定 19 4 3 試驗(yàn)建議 19 參考文獻(xiàn) 致謝 東北林業(yè)大學(xué)畢業(yè)論文 1 黃傘子實(shí)體多糖免疫活性的研究黃傘子實(shí)體多糖免疫活性的研究 1 緒論 1 1 黃傘簡介 黃傘學(xué)名 PHoliota adiposa Fr Quel 在分類學(xué)上屬真菌門 Eumycota 擔(dān)子 菌亞門 Basidiomycotina 層菌綱 Hymenomy2cetes 傘菌目 Agaricales 球蓋菇 科 StropHariaceae 環(huán)銹傘屬 GenusPHolipta 又名柳蘑 是一種秋季多生于楊 柳 及樺樹上的大型真菌 在我國絕大部分地區(qū)皆有分布 1 黃傘具有較高的營養(yǎng)和藥用價(jià) 值 除含有大量蛋白質(zhì)外 已知在子實(shí)體表面有粘液狀核酸物質(zhì) 其有利于人體腦力和 體力的恢復(fù) 黃傘多糖對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞有激活效應(yīng) 對小鼠肉瘤和艾氏腹水癌有抑 制作用 可預(yù)防葡萄球菌 大腸桿菌 肺炎桿菌和結(jié)核桿菌感染 2 此外還有抗疲勞的 生化特性 3 食用菌多糖因大多具有獨(dú)特的生物學(xué)活性而日益受到人們重視 其眾多的 藥用價(jià)值不斷被發(fā)現(xiàn)和證實(shí) 已成為開發(fā)新一代營養(yǎng)保健品及生物制藥的研究熱點(diǎn) 1 1 1 黃傘營養(yǎng)成分分析 惠豐立等以1973年聯(lián)合國糧農(nóng)組織 FAO 和世界衛(wèi)生組織 WHO 規(guī)定的必需氨基酸 均衡模式為標(biāo)準(zhǔn) 對黃傘深層發(fā)酵菌絲體與子實(shí)體中必需氨基酸組成及氨基酸進(jìn)行了評 價(jià) 發(fā)現(xiàn)黃傘子實(shí)體中粗蛋白質(zhì) 粗纖維和灰分的含量與 食物成分表 中一般食用菌 的含量相當(dāng) 粗脂肪含量低于一般食用菌 多糖含量為14 11 高于一般食用菌 4 黃傘子實(shí)體中氨基酸種類齊全 18種 總含量與其他食 藥 用菌相比較高 總氨基酸 中谷氨酸 天冬氨酸 異亮氨酸 賴氨酸 纈氨酸和丙氨酸含量的比例較高 黃傘子實(shí) 體蛋白質(zhì)的必需氨基酸總量6 32 非必需氨基酸總量為10 37 氨基酸總量為16 69 必需 氨基酸占氨基酸總量 E E N 的37 87 必需氨基酸與非必需氨基酸比值 E N 為0 61 已達(dá)到FAO WHO 1973 提出的理想蛋白質(zhì)必需氨基酸 E 應(yīng)達(dá)總量40 左右 EN值應(yīng)在 0 6以上的要求 黃傘子實(shí)體中含有鉀 鈉 鈣 磷 鎂 鐵 鋅 錳等多種人體必需的 礦質(zhì)元素 其中人體容易缺乏的微量元素鐵 鋅 錳含量較高 為一般食用菌的2倍左右 黃傘子實(shí)體中含有VB1 VB2和VPP 其中VB2含量為1 5mg 100g 高于47種干菇的平均含 量1 229mg 100g 此外黃傘子實(shí)體中還含有大量的麥角固醇 麥角固醇是VD2的前體 在 紫外線照射下可轉(zhuǎn)變成VD2 黃傘子實(shí)體的營養(yǎng)成分較為齊全 除含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì) 如蛋白質(zhì) 脂肪 纖維素及多種維生素和無機(jī)鹽外 還含有氨基酸 多糖 麥角固醇等 多種生物活性物質(zhì) 惠豐立 5 研究表明 黃傘深層發(fā)酵菌絲體與子實(shí)體粗蛋白含量較高 粗脂肪含量較低 并含有多種礦質(zhì)元素及多種維生素 深層發(fā)酵菌絲體氨基酸總量比子實(shí)體高46 25 礦 質(zhì)元素在深層發(fā)酵菌絲體中Na P Mg Zn含量高于子實(shí)體 但K Ca Fe Mn含量低 于子實(shí)體 深層發(fā)酵菌絲體VB1和VB2含量比子實(shí)體高 但VPP的含量比子實(shí)體低 黃傘 深層發(fā)酵菌絲體與子實(shí)體具有相近的營養(yǎng)組成 其中部分營養(yǎng)成分含量甚至超過了子實(shí) 體 因此具有較高營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值 由于黃傘人工栽培子實(shí)體生產(chǎn)周期長 產(chǎn)量低 東北林業(yè)大學(xué)畢業(yè)論文 2 而利用農(nóng)產(chǎn)品的副產(chǎn)物 通過深層發(fā)酵技術(shù)工廠化生產(chǎn)黃傘菌絲體的產(chǎn)量高 成本低 周期短 具有顯著優(yōu)勢 因此以深層發(fā)酵菌絲體代替子實(shí)體開發(fā)具有醫(yī)療保健功效的食 品 保健品或作為藥品的原料是切實(shí)可行的 因此 黃傘不僅具有較高的營養(yǎng)價(jià)值 還 具有重要的藥用價(jià)值 1 1 2 黃傘栽培歷史和發(fā)展現(xiàn)狀 黃傘作為著名的醫(yī)用食用菌已眾所皆知 但是有關(guān)黃傘提取多糖的純化和多糖的高 級結(jié)構(gòu)國內(nèi)外也均未見報(bào)道 因此目前對黃傘多糖的研究還剛剛起步 仍有許多方面值 得我們?nèi)ヌ剿?對其固有的醫(yī)藥價(jià)值和特殊的藥理功效卻重視不夠 有必要從醫(yī)藥學(xué)角 度進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究 6 今后 應(yīng)在合理利用子實(shí)體資源的同時(shí) 著重功能性的應(yīng)用開發(fā) 將黃傘資源的開 發(fā)研究真正列入科研的重要日程 1 2 植物多糖的不同提取方法的研究進(jìn)展 1 2 1 溶劑提取法 溶劑提取法 7 是從植物中提取多糖的常用方法 溶劑提取法首先要考慮的因素是選 擇溶劑 一般都應(yīng)遵循相似相溶的原則 即極性強(qiáng)的有效成分選擇極性強(qiáng)的溶劑 極性 弱的有效成分選擇極性弱的溶劑 多糖是極性大分子化合物 應(yīng)選擇水 醇等極性強(qiáng)的 溶劑 在所有溶劑中 水是典型的強(qiáng)極性溶劑 對植物組織的穿透力強(qiáng) 提取效率高 在生產(chǎn)上使用安全 它能用于各種植物多糖 被廣泛應(yīng)用 用水作溶劑來提取多糖時(shí) 可以用熱水浸煮提取 也可以用冷水浸提 水提取的多糖多數(shù)是中性多糖 一般植物多 糖提取多數(shù)采用熱水浸提法 該法所得多糖提取液可直接或離心除去不溶物 或者利用 多糖不溶于高濃度乙醇的性質(zhì) 用高濃度乙醇沉淀提純多糖 但由于不同性質(zhì)或不同相 對分子質(zhì)量的多糖沉淀所需乙醇濃度不同 它也可以用于樣品中不同多糖組分的分級分 離 還可按多糖不同性質(zhì)在粗分階段利用混合溶劑提取法對植物中不同的多糖進(jìn)行分離 其中 以乙醇沉淀最為普遍 8 李宏燕 9 在紫菜粗多糖提取方式研究中 熱水提取控制條件為 溫度為20 100 水與紫菜的液固質(zhì)量比 20 50 提取時(shí)間30 240min 最終得率為2 05 1 2 1 2 酸提取法 有些多糖適合用稀酸提取 并且能得到更高的提取率 孟憲元等 10 在茜草多糖提取 研究中 發(fā)現(xiàn)相對于水提 以稀酸提取茜草多糖 產(chǎn)品純度較高 但酸提法有其特殊 性 只在一些特定的植物多糖提取中占有優(yōu)勢 目前報(bào)道的并不多 而且即使有優(yōu)勢 在操作上還應(yīng)嚴(yán)格控制酸度 因?yàn)樗嵝詶l件下可能引起多糖中糖苷鍵的斷裂 1 2 1 3 堿取法 與酸提類似 有些多糖在堿液中有更高的提取率 尤其是提取含有糖醛酸的多糖 8 及酸性多糖 如Hayashi Katsuhiko 10 發(fā)明了一種從綠色藻類中提取酸性多糖的方法 而 這種多糖用常規(guī)的熱水法是無法得到的 同樣 堿提優(yōu)勢也是因多糖類的不同而異 與 酸提類似 堿提中堿的濃度也應(yīng)得到有效控制 因?yàn)橛行┒嗵窃趬A性較強(qiáng)時(shí)會水解 11 另外稀酸 稀堿提取液應(yīng)迅速中和或迅速透析 濃縮與醇析而獲得多糖沉淀 1 2 2 酶提法 酶技術(shù)是近年來廣泛應(yīng)用到有效成份提取中的一項(xiàng)生物技術(shù) 在多糖的提取過程中 使 用酶可降低提取條件 在比較溫和的條件中 東北林業(yè)大學(xué)畢業(yè)論文 3 分解植物組織 加速多糖的釋放或提取 此外 使用酶還可分解提取液中淀粉 果膠 蛋白質(zhì)等非目的產(chǎn)物 常用的酶有蛋白酶 纖維素酶 果膠酶等 7 酶提法的優(yōu)勢越來越受到研究人員的關(guān)注 因此有眾多關(guān)于各種酶在多種植物多糖 提取中的應(yīng)用的報(bào)道 此外 新酶的開發(fā)利用也有著廣闊的前景 1 2 3 微波提取法 微波是頻率介于300MHz和300GHz之間的電磁波 微波提取的原理是微射線輻射于溶 劑并透過細(xì)胞壁到達(dá)細(xì)胞內(nèi)部 由于溶劑及細(xì)胞液吸收微波能 細(xì)胞內(nèi)部溫度升高 壓 力增大 當(dāng)壓力超過細(xì)胞壁的承受能力時(shí) 細(xì)胞壁破裂 位于細(xì)胞內(nèi)部的有效成份從細(xì) 胞中釋放出來 傳遞轉(zhuǎn)移到溶劑周圍被溶劑溶解 此法提取時(shí)間短 提取率高 是強(qiáng)化 固液提取過程頗具發(fā)展?jié)摿Φ囊豁?xiàng)新型輔助提取技術(shù) 王自軍等 19 首次運(yùn)用微波技術(shù)從白芥子中提取出多糖 反應(yīng)速度大大加快 收率提 高 半枝蓮 20 金櫻子 21 運(yùn)用微波技術(shù)提取多糖的高效性也相繼被證實(shí) 1 2 4 超聲波提取法 超聲提取法是應(yīng)用超聲波強(qiáng)化提取植物多糖的方法 是一種物理破碎過程 超聲波 是頻率在20KHz以上的聲波 對媒質(zhì)主要產(chǎn)生獨(dú)特的機(jī)械振動(dòng)作用和空化作用 當(dāng)超聲波 振動(dòng)時(shí)能產(chǎn)生并傳遞強(qiáng)大的能量 引起媒質(zhì)以大的速度加速進(jìn)入振動(dòng)狀態(tài) 使媒質(zhì)結(jié)構(gòu) 發(fā)生變化 促使有效成分進(jìn)入溶劑中 同時(shí) 超聲波在液體中還會產(chǎn)生空化作用 即在有 相當(dāng)大破壞應(yīng)力的作用下 液體內(nèi)形成空化泡的現(xiàn)象 空化泡在瞬間漲大并破裂 破裂 時(shí)吸收的聲場能量在極短的時(shí)間和極小的空間內(nèi)釋放出來 形成高溫和高壓的環(huán)境 同 時(shí)伴隨有強(qiáng)大的沖擊波和微聲波 從而破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu) 使其在瞬間破裂 植物細(xì)胞內(nèi) 的有效成份得以釋放 直接進(jìn)入溶劑并充分混合 從而提高提取率 此外 超聲波還產(chǎn) 生許多次級效應(yīng)如熱效應(yīng) 乳化 擴(kuò)散 擊碎 化學(xué)效應(yīng) 生物效應(yīng) 凝聚效應(yīng)等也能 加速植物有效成份在溶劑中的擴(kuò)散釋放 有利于提取 與常規(guī)提取法相比 超聲波提取 可縮短提取時(shí)間 提高提取率 所以超聲提取在植物多糖的提取中得到廣泛應(yīng)用 李軍生等 15 發(fā)現(xiàn) 超聲處理可使南瓜多糖的提取時(shí)間縮短 在一定范圍內(nèi)隨著超聲波 的使用功率的增大 提取所得的南瓜總糖 還原糖和多糖的產(chǎn)量也隨之提高 溫度與超 聲波可以協(xié)同作用 共同提高南瓜多糖的提取率 1 2 5 其他提取方法 隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步 越來越多的提取方法應(yīng)用到植物多糖的提取中 如超濾法 12 膜過濾法等 植物多糖的提取方法和技術(shù)在不斷革新 對于同一種方法和技術(shù)又不斷在不同的植 物多糖中研究 考察 本文僅為研究和生產(chǎn)工作者提供參考 在選取方法時(shí) 研究和生 產(chǎn)人員應(yīng)當(dāng)關(guān)注目標(biāo)多糖的性質(zhì) 特點(diǎn) 綜合比較 進(jìn)行實(shí)驗(yàn) 才能選取最佳方法和 工藝 1 3 食用菌多糖的純化 現(xiàn)代研究普遍認(rèn)為多糖類物質(zhì)只有大分子才具有生物活性 因此要得到較純的多糖 就必須去除粗多糖中所含有的無機(jī)離子 有機(jī)小分子 各種單糖類物質(zhì) 色素和游離蛋 白等 食用菌多糖粗品脫蛋白的方法主要有Sevag法 三氯乙酸法 酶法等 前兩者多作 用于生物多糖 Sevag法是經(jīng)典的除蛋白方法 復(fù)雜 費(fèi)時(shí)且樣品損失較大 通過逆向流 水透析除去低聚糖等小分子雜質(zhì) 這樣得到的就是多糖的半精品 食用菌多糖純化的方 法主要有分級沉淀法 季銨鹽沉淀法 鹽析法 金屬絡(luò)合物法 柱層析 超濾等 現(xiàn)在 東北林業(yè)大學(xué)畢業(yè)論文 4 關(guān)于多糖的分離 純化以及組成分析的研究已經(jīng)廣泛展開 1 3 1 除蛋白 天然植物中多糖與蛋白質(zhì)兩種高分子成分共存 且分子量相近 另外糖常常與蛋白形 成糖蛋白復(fù)合物 使蛋白質(zhì)的脫除更加困難 但也許正是結(jié)合了這部分蛋白質(zhì) 多糖才 具有眾多獨(dú)特的生理功能 如各種蛋白質(zhì)聚糖 糖蛋白具有生理功能一樣 常用的除蛋 白質(zhì)的方法有Sevage 法 三氯乙酸法 三氟三氯乙烷法 酶法等Sevag法為實(shí)驗(yàn)室常用 法 該法以正丁醇與氯仿 1 4 1 5 混合再進(jìn)行萃取 蛋白酶法是目前認(rèn)為較好的方 法 將蛋白質(zhì)水解再透析去除 1 3 2 脫色 對于植物多糖可能會有酚類化合物而顏色較深 對其進(jìn)行脫色可使其應(yīng)用范圍更加 廣泛而常用的脫色方法有 離子交換法 氧化法 金屬絡(luò)合物法 吸附法 纖維素 硅藻 土 活性炭等 LDEA E 纖維素是目前最常用的脫色劑 通過離子交換柱不僅達(dá)到脫色 的目的 而且還可以分離多糖 1 3 3 除小分子雜質(zhì) 選用不同規(guī)格的超濾膜和透析袋進(jìn)行超濾和透析可以將不同分子大小的多糖進(jìn)行分 離和純化 22 該法在除去小分子物質(zhì)十分實(shí)用 同時(shí)能滿足大生產(chǎn)的需要 具有廣闊的 應(yīng)用前景 至此 得到的提取液基本上是沒有蛋白質(zhì)與小分子雜質(zhì)的多糖混合物 這樣 得到的就是多糖的半精品 1 3 4 多糖的分級純化 采用一般方法提取的多糖通常是多糖的混合物 即是多分散性的而其不均一性表現(xiàn) 在化學(xué)組成 聚合度 分子形狀等的不同 分級的方法可達(dá)到純化的目的可按分子大小 和形狀分級 如分級沉淀 超濾 分子篩 層析等 也可按分子所帶基因的性質(zhì)分級 如 按電荷性質(zhì)分級的電泳 離子交換層析等 1 3 4 1 分級沉淀法 不同多糖在不同濃度的低級醇或酮中溶解度不同 可用不同濃度的有機(jī)溶劑分級沉 淀分子大小不同的多糖 該方法適用于分離各種溶解度相差較大的多糖 并逐漸應(yīng)用于 更多的純化領(lǐng)域 孟雅等 17 在馬鈴薯多酚氧化酶的提取純化中發(fā)現(xiàn) 硫酸銨沉淀和凝膠 層析相結(jié)合的方法能夠大大提高多酚氧化酶的活性 且在最佳 PH 值 7 0 和最適溫度 30 的條件下多酚氧化酶的活性達(dá)到 1560U 程忠玲等 18 在海帶中褐藻糖膠的提取中 研究 發(fā)現(xiàn) 在提取溫度 70 PH 2 5 70 乙醇濃度提取 3h 提取率 7 3 乙醇分級沉淀法 提取率高于氯化鎂法 1 3 4 2 季銨鹽沉淀法 多糖能與一些陽離子表面活性劑和鹽形成不溶性化合物 常用的季銨鹽是十六烷基 三甲基胺溴化物 CTAB 及其堿 CTA OH 和十六烷基吡啶 CPC 一般地說 酸性多 糖或相對分子質(zhì)量大的多糖首先沉淀出來 所以控制季銨鹽的濃度能分離各種不同的酸 性多糖 該法可用于分離酸性及中性多糖 何偉珍等 在銀耳多糖的提取分離與純化 中發(fā)現(xiàn) 銀耳水煮提取后 粗產(chǎn)品采用季銨鹽沉淀法 純化后精品中銀耳多糖的含量達(dá) 76 28 劉群 20 在海帶硫酸多糖的分離純化研究中夜采用了季銨鹽沉淀法 酶解海帶液 東北林業(yè)大學(xué)畢業(yè)論文 5 的回收率達(dá) 60 提取率為 3 2 1 3 4 3 鹽析法 常用的鹽析劑有硫酸銨 氯化鈉 氯化鉀 醋酸鉀等 主要應(yīng)用于果膠的提取和純 化 果膠中的羧基很容易與金屬離子如鉀 鈉 鋁等反映而生成鹽 為此 要將果膠溶 液先調(diào)至一定的PH 加入適量的金屬鹽 使其與果膠中的羧基反應(yīng)而生成果膠酸鹽 由 于果膠酸鹽不溶于水 因而在溶液中以絮狀物的沉淀析出 經(jīng)過濾后 用酸化的醇將金 屬離子置換出來 而金屬離子則形成可溶物而溶于水中 以達(dá)到 脫鹽 再經(jīng)過濾 干燥粉碎后而制得果膠 任吉君等 21 在提取紅秋葵果膠的研究中 利用鹽析法對紅秋葵果實(shí)中的果膠進(jìn)行了 提取 研究結(jié)果表明 明礬用量12g PH 2 0 水解時(shí)間60min 溫度85 水量500ml條 件下 果膠提取量最高 可達(dá)5 375g 其中明礬的用量對果膠的提取量影響較大 孔瑾 等 22 在南瓜皮中提取果膠的技術(shù)研究中發(fā)現(xiàn) 料液比為1 7 萃取液的PH 值為2 萃取 溫度為95 萃取時(shí)間為90min 并用硫酸鋁作沉淀劑 果膠得率13 6 與酒精法相比 鹽析法提取果膠具有成本底 得率高 果膠制品純潔等特點(diǎn) 1 3 4 4 金屬絡(luò)合物法 金屬絡(luò)合物法是利用多糖能與銅 鋇 鈣 鉛離子形成絡(luò)合物而沉淀 常用的絡(luò)合 劑有費(fèi)林溶液 氯化銅 氫氧化鋇和醋酸鉛等 這種方法尤其重金屬的影響 所以應(yīng)用 的比較少 多應(yīng)用于環(huán)境中污染物的檢測 23 1 3 4 5 超濾法 超濾法是一種膜分離法 常用于除去多糖中的小分子物質(zhì) 由于操作條件溫和 不添加 化學(xué)試劑 不損壞熱敏性物質(zhì)而具優(yōu)勢 膜分離不僅節(jié)約能源 而且具有無污染且保留 生物活性成分的高效價(jià) 因而得到廣泛的應(yīng)用 不同的超濾膜具有允許不同相對分子質(zhì) 量和形狀的物質(zhì)通過的性質(zhì) 多糖溶液通過各種已知的超濾膜就能達(dá)到分離 近年來使 用外場強(qiáng)化使超濾效果得以提高 如王芳等 24 利用超濾法對綠原酸的提取 最終純化液 干浸膏中綠原酸高達(dá)44 10mg g 李季文等 25 利用超濾法純化葫蘆巴中葫蘆巴皂苷的工藝 研究 操作壓力為2Kg m 2膜孔徑10000 藥液濃度為生藥量1 0g m 1 藥液溫度為25 時(shí)純化效果最好 膜分離技術(shù)純化葫蘆巴中葫蘆巴總皂苷的工藝操作簡單可靠 純化率 高 劉長江等 26 超濾法分離鹿胎盤多肽的研究 研究了中空纖維超濾膜對鹿胎盤多肽中 小分子活性因子的截留 考察了壓力 溫度 流速 濃縮倍數(shù)及操作時(shí)間對分離效果的 影響 最終確定最佳工藝操作條件為操作壓力為0 06MPa 溫度為30 流速為 2 25mL s 濃縮倍數(shù)為2 倍 操作時(shí)間為3min 隨著膜分離技術(shù)的成熟 現(xiàn)在越來越 多的應(yīng)用于植物活性成分的分離 其中膜分離法已經(jīng)應(yīng)用于香菇多糖等的分離提取中 1 3 4 6 柱層析 多柱層析較為常用 需要手動(dòng)裝填層析柱 平衡 加樣 逐管檢測各管組分 可分 為兩類 一般凝膠柱層析和離子交換層析 1 一般凝膠柱層析 27 凝膠層析也稱為排阻層析 凝膠過濾 分子篩層析和凝膠滲透層析 它是 60 年代發(fā) 展起來的 該方法可根據(jù)多糖分子的大小和形狀不同進(jìn)行分離 以不同濃度的鹽溶液和 緩沖溶液作為展開劑 離子強(qiáng)度最好不低于 0 02 從而使不同大小的多糖分子得到分離 純化 凝膠層析法適用于分離和提純蛋白質(zhì) 酶 多肽 激素 多糖 核酸類等物質(zhì) 分 東北林業(yè)大學(xué)畢業(yè)論文 6 子大小彼此相差 25 的樣品 只要通過單一凝膠床就可以完全將它們分開 利用凝膠的分 子篩特性 可對這些物質(zhì)的溶液進(jìn)行脫鹽 濃縮 去熱源和脫色 凝膠是由膠體溶液凝結(jié)而成的固體物質(zhì) 不論是天然凝膠還是人工合成的凝膠 它 們的內(nèi)部都具有很細(xì)微的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) 凝膠層析的機(jī)理是分子篩效應(yīng) 如同過篩那樣 不同交聯(lián)度的凝膠具有不同孔徑 而不同形狀和大小的多糖分子在凝膠層析柱中移動(dòng)速 度不同 因此達(dá)到分離純化的目的 凝膠顆粒在合適溶劑中浸泡 充分吸液膨脹 然后 裝入層析柱內(nèi) 加入欲分離的混合物后 在以同一溶劑洗脫 在洗脫過程中 大分子不 能進(jìn)入凝膠內(nèi)部而沿凝膠顆粒間的空隙最先流出柱外 而小分子可以進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部 的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) 流速緩慢 以致最后流出柱外 從而使樣品中分子大小不同的物質(zhì)得 到分離 常用的凝膠有葡聚糖凝膠 SepHadex 瓊脂糖凝膠 SepHarose 以不同濃度的鹽 溶液和緩沖溶液作為洗脫劑 從而使不同大小的多糖分子得到分離純化 葡聚糖凝膠常 用 G X 代表 X 數(shù)字既代表交聯(lián)度 也代表持水量 X 數(shù)字越小 交聯(lián)度越大 網(wǎng)孔越小 吸水膨脹就越小 適用于分離低分子質(zhì)量生化產(chǎn)品 相反 X 數(shù)字越大 交聯(lián)度越小 該 方法的特點(diǎn)是 凝膠層析操作簡便 所需設(shè)備簡單 分離介質(zhì)凝膠完全不需要像離子交 換劑那樣復(fù)雜的再生過程便可重復(fù)使用 分離效果較好 重復(fù)性高 最突出的是樣品回 收率高 接近 100 分離條件溫和 分離的分子量范圍也很寬 這種方法不適用于粘多 糖的分離 董宏坡等 28 應(yīng)用柱層析從壇紫菜中純化出別藻藍(lán)蛋白的研究發(fā)現(xiàn) 采用30 35 飽 和硫酸銨沉淀 Tris HCl pH 8 0 作為洗脫緩沖液 DEAE SepHadex A 50作為層析介質(zhì) 所獲得的別藻藍(lán)蛋白的純度和回收率分別為3 50和70 2 SDS PAGE表明別藻藍(lán)蛋白有 和 兩個(gè)亞基 分子量分別為18 9 kD和17 7 kD 2 離子交換層析 29 離子交換層析 是在具有離子交換性能的物質(zhì)作固定相 液體為流動(dòng)相的系統(tǒng)中進(jìn) 行的 如帶負(fù)電荷的多糖可在陰離子 DEAE 纖維素 二乙基氨基乙基纖維素 柱或 DEAE SepHadex 柱上達(dá)到分級 酸性多糖可在陽離子型的羧甲基 CM SepHadex 等凝膠柱上分 離 洗脫劑可采用不同濃度堿溶液 硼砂溶液以及鹽溶液 此法優(yōu)點(diǎn)是可吸附雜質(zhì) 純 化多糖 并適用于分離各種酸性 中性多糖和粘多糖 由于酸性多糖常含有糖醛酸和各 種硫酸基 在溶液中以聚陰離子形式存在 因而適用此法 多糖在交換柱上的吸附力與 多糖結(jié)構(gòu)有關(guān) 一般隨酸性基團(tuán)的增加而增加 對于線狀分子 分子量較大的多糖吸附 力強(qiáng) 直鏈多糖較分支多糖易吸附 雖然不同食用菌多糖分離純化的具體方法有所差異 但它們的基本步驟卻是相似的 如預(yù)處理 主要去除脂類 提取 真空濃縮 醇沉 除蛋白 有機(jī)溶劑洗滌 乙醇 丙 酮 乙醚 柱或膜進(jìn)一步分離 冷凍干燥等 1 4 多糖及其功能性質(zhì) 1 4 1 多糖的概念及來源 多糖又稱多聚糖 Pulysacchde 它是由醛糖或酮糖通過糖苷鍵連接在一起的多聚物 通常多糖中的單糖分子都在一百個(gè)以上 多的可高達(dá)數(shù)千個(gè) 其性質(zhì)與單糖 低聚糖相 比己經(jīng)發(fā)生了很大的變化 如不溶于水 甜味和還原性消失等 其分子量一般為數(shù)萬甚至 達(dá)數(shù)百萬 是一類天然高分子化合物 是構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)之一 多糖不僅是構(gòu) 成生命有機(jī)體的重要組分 而且在控制細(xì)胞分裂 調(diào)節(jié)細(xì)胞生長以及維持生命有機(jī)體正 常代謝等方面具有重要作用 某些不溶性多糖 如植物的纖維素和動(dòng)物的幾丁質(zhì) 即殼多 糖 是構(gòu)成植物細(xì)胞壁和動(dòng)物外殼的組分 淀粉和糖原等則是儲存形式的多糖 當(dāng)生物體 東北林業(yè)大學(xué)畢業(yè)論文 7 需要時(shí)可被分解 釋放出單糖 還有許多多糖 具有調(diào)節(jié)人體免疫力 抗腫瘤和抗放射等 復(fù)雜的生理功能 被稱為功能多糖或活性多糖 發(fā)現(xiàn)最早的功能多糖 是從細(xì)菌中得到 的莢膜多糖 它在醫(yī)藥上主要用于疫苗 隨著對這類多糖研究的不斷深入 人們在人和 動(dòng)物的多種組織 分泌液及某些植物 微生物中也發(fā)現(xiàn)了功能多糖的存在 其中研究比 較多和比較清楚的主要是來自各種植物多糖 例如 人參多糖 刺五加多糖 當(dāng)歸多糖 構(gòu)祀多糖 黃茂多糖和黃精多糖等 來自食藥用真菌的多糖 例如 香菇多糖 銀耳多糖 靈芝多糖 云芝多糖 獲荃多糖 猴頭菇多糖和冬蟲夏草多糖等 植物活性多糖植物活 性多糖的來源廣泛 不同種的植物 活性多糖的結(jié)構(gòu) 分子構(gòu)成及分子量各不相同 生 物活性也不同 植物多糖雖種類繁多 但都是由許多相同或不同的單糖以 a 或 糖苷鍵 所組成的化合物 我國是中藥的起源之地 而糖類是中藥材中普遍存在的成分 在對各 種中藥材的化學(xué)成分研究的過程中 人們都少不了對其中多糖的關(guān)注 植物活性多糖的 主要科屬分布有五加科的人參多糖 刺五加多糖 豆科的黃蔑多糖 茄科的構(gòu)祀多糖 鼠李 科棗仁內(nèi)多糖 桔?？频狞h參多糖等 此類活性多糖具有補(bǔ)中益氣 養(yǎng)血生津的功效 而 且具有增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能 促進(jìn)體內(nèi)淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化 在體內(nèi)不僅可以提高常規(guī) 淋巴因子激活殺傷細(xì)胞 LAK 的活性 而且可提 高快速 LAK 的活性 對 T B 細(xì)胞的功能 均有促進(jìn)作用 并能增強(qiáng)免疫監(jiān)視能力 減輕抗腫瘤化療藥物對免疫功能的影響 1 4 2 真菌活性多糖 真菌活性多糖是從真菌子實(shí)體 菌絲體 發(fā)酵液中分離出的 能夠控制細(xì)胞分裂 分 乞 調(diào)節(jié)細(xì)胞生長 衰老的一類活性多糖 有關(guān)真菌多糖的研究既深又廣 如酵母菌多 糖 獷用菌多糖 特別是食用菌多糖的研究 報(bào)道的頻率是相當(dāng)?shù)母?其中以香菇多糖 研究的比較清楚 它們均含有某一特有的保守結(jié)構(gòu)序列 且此結(jié)構(gòu)不屬于高等生物體的 正常組分 三類多糖具有免疫調(diào)節(jié)的功能 可能是由于高等動(dòng)物非特異防御系統(tǒng)逐漸進(jìn) 化 從而識別二些微生物的保守結(jié)構(gòu) 30 與動(dòng) 植物多糖不同的是 真菌多糖分子單體 主要以 1 3 與 1 6 糖苷鍵結(jié)合 形成鏈狀分子 具有螺旋狀的立體構(gòu)型 且具 有四級萬構(gòu) 這一點(diǎn)與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)類似 真菌多糖按單糖成分組成種類可以分為雜多糖 和均多糖 真菌多糖在免疫功能的調(diào)節(jié) 癌癥的診斷與治療 抗衰老及解除機(jī)體疲勞等 方面都有著重要的作用 且得到大量國內(nèi)外科學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí) 31 日本及歐美等國在真 菌多糖的研究方面始于 20 世紀(jì) 30 年代 積累了大量的科研資料 隨著科研人員對真菌 多糖療效的更深層次了解 真菌多糖勢必將被應(yīng)用于更多領(lǐng)域 尤其是制藥及保健品行 業(yè) 1 4 3 活性多糖的生理功能 多糖的藥理作用廣泛 參與人體細(xì)胞的各種生命過程及生理功能的調(diào)節(jié) 并以獨(dú)特 的活性和低毒性的特點(diǎn)使其在臨床應(yīng)用中具有很大的潛力 近幾年來 大量藥理及臨床 研究證實(shí) 多糖有調(diào)節(jié)免疫 抗癌 抗病毒 抗衰老 抗肥胖 控制血糖 降膽固醇 降血脂等生理功能 是健康食品及營養(yǎng)保健食品的添加劑 多糖類藥物研究正由一般藥 理學(xué)向作用機(jī)理深入 由細(xì)胞水平向分子水平 基因水平深入 由單獨(dú)用藥向聯(lián)合用藥 與 細(xì)胞因子 放療 化療聯(lián)合用藥 以及結(jié)構(gòu)修飾和新劑型等方面深入 調(diào)節(jié)免疫功能從細(xì) 菌 真菌 酵母 地衣和高等植物 海洋植物中提取的多糖均對免疫系統(tǒng)有重要的調(diào)節(jié) 作用 多糖作為一種免疫增強(qiáng)劑 不僅能激活巨噬細(xì)胞 MU T 淋巴細(xì)胞 B 淋巴細(xì)胞 自然殺傷細(xì)胞伽 K 細(xì)胞毒 T 細(xì)胞 CTL 淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞 LAK 等免疫細(xì)胞的 活性 激活網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng) REs 吞噬 清除老化細(xì)胞和異物以及病原體的作用 還能促進(jìn) 東北林業(yè)大學(xué)畢業(yè)論文 8 細(xì)胞因子生成 活化補(bǔ)體 從而在抗腫瘤 抗病毒以及抗衰老等的防治上具有獨(dú)特的功 效 作為免疫調(diào)節(jié)劑 刺五加多糖可促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖 使之代謝活躍 功能增強(qiáng) 以 此形態(tài)學(xué)改變?yōu)榛A(chǔ) 促進(jìn)了機(jī)體的免疫功能 1 4 3 1 多糖增強(qiáng)免疫功能 現(xiàn)已證實(shí) 很多多糖具有增強(qiáng)機(jī)體免疫的功能 如香菇多糖即是一種很好的免疫促 進(jìn)劑 具有高度特異性免疫增強(qiáng)功能 在帶癌情況下 一方面 它能活性腹腔巨噬細(xì)胞 的殺傷還原能力 另一方面 能恢復(fù)己降低的免疫功能 特別是能恢復(fù) T 一協(xié)助細(xì)胞的 活性 同時(shí) 近百倍的提高抗胸腺依賴性抗原的體液性抗體 靈芝子實(shí)體多糖能增強(qiáng)小 鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬活力 誘導(dǎo)細(xì)胞色素 P 450 的形成 有利于增強(qiáng)機(jī)體的防御功能 提高機(jī)體保持穩(wěn)態(tài)的能力 銀耳多糖能促進(jìn)淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化 增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的 吞噬功能 明顯促進(jìn)肝臟蛋白質(zhì)核酸合成 促進(jìn)骨髓造血功能 提高體液免疫力 黑木 耳多糖可有效的提高小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)和吞噬百分率 豬答菌核中的一種水溶性 多糖能顯著提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬活力 促進(jìn)抗體形成 是一種良好的免疫調(diào)節(jié) 劑 1 4 3 2 多糖降血糖功能 Kouno等 32 從人參中提得的五種多糖 Panaxan A B C D E給正常小鼠注射 可 產(chǎn)生隨劑量加大而增強(qiáng)的降血糖作用 其中主要的PanaxanA和B也可使糖尿病小鼠血糖下 降 刺五加具有降糖作用 同時(shí)具有降血脂 改善氧自由基代謝紊亂的藥理活性 有助 于糖尿病并發(fā)癥的防治 1 4 3 3 免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用 這是大多數(shù)活性多糖的共同特性 也是它們發(fā)揮其他生理和藥理作用 如抗腫瘤 的 基礎(chǔ) 許多多糖都是哺乳動(dòng)物的免疫調(diào)節(jié)劑 33 真菌多糖作為一類免疫增強(qiáng)劑 他們的 抗腫瘤作用源與其免疫增強(qiáng)功能 34 研究認(rèn)為多糖的抗腫瘤作用表現(xiàn)在兩個(gè)方面口 14 一是表現(xiàn)為對腫瘤發(fā)生的預(yù)防 二是對已產(chǎn)生的腫瘤細(xì)胞的殺傷作用 多糖在這兩方面 的作用是很顯著的 這也是多糖能夠得到廣泛應(yīng)用的重要原因 1 4 3 4 抗腫瘤試驗(yàn) 近幾十年來 人們做了很多關(guān)于多糖抗腫瘤的試驗(yàn) 這些實(shí)驗(yàn)有體內(nèi)的也有體外的 體內(nèi)試驗(yàn)大部分是在各種動(dòng)物 大小鼠 兔等 身上進(jìn)行 所使用的瘤株也多集中在常用 的幾個(gè)試驗(yàn)瘤株上 如實(shí)體瘤s 180 S 37 艾氏腹水瘤 宮頸癌U14 人白血病K582等 香菇多糖 松口菇多糖和羊脾RNA注入荷瘤小鼠內(nèi) 不僅增強(qiáng)免疫活性 同時(shí)使脾 瘤等 組織的cAMP增高 且該增高與抑瘤率成正相關(guān) 可以說 真菌多糖既可以作預(yù)防腫瘤的 保健食品 也可以在腫瘤發(fā)生以后作為治療腫瘤的輔助藥物 1 4 3 5 抗病毒活性 研究表明 許多多糖對各種病毒有抑制作用 如艾滋病毒 Hlv l 單純疤疹病毒 巨細(xì)胞病毒 流感病毒 囊狀胃炎病毒 勞斯肉瘤病毒和鳥肉瘤病毒 35 多糖的抗病毒 作用現(xiàn)已引起醫(yī)藥界的高度重視 尤其是硫酸多糖的強(qiáng)抗病毒活性 顯示了多糖廣闊的 藥用前景 多糖在抗病毒藥的研究中也常常作為佐劑 許多研究結(jié)果發(fā)現(xiàn) 多糖與其他 藥物聯(lián)用具有協(xié)同作用 將多糖作為佐劑聯(lián)合用藥可以防止或推遲耐藥株的出現(xiàn) 提高 藥物的抗病毒活性 減少用藥量 例如硫酸右旋糖苷與疊氮胸昔具有協(xié)同作用 可以減 少用藥量 降低不良反應(yīng) 提高患者的耐受性 1 4 3 6 抗衰老活性 如螺旋藻多糖 PSP 是從螺旋藻中分離純化獲得的平均分子量為16 6kDa的酸性多糖 對D 半乳糖所導(dǎo)致的衰老小鼠模型有如下作用 抗小鼠肝 腦組織單胺氧化酶 MAO B 的 東北林業(yè)大學(xué)畢業(yè)論文 9 活性明顯提高 抗Na K ATP酶活性降低 對抗小鼠淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化降低的效應(yīng) 拮抗 小鼠皮膚細(xì)胞中輕脯氨酸含量降低 從而防止膠原蛋白多膚鏈之間交聯(lián)度的增加 代謝 率降低 防止皮膚組織彈性降低 此外多糖還具有抗氧化 17 降血糖降血脂 38 41 抗炎癥 39 抑制細(xì)菌 40 等多種活 性 1 5 植物多糖的開發(fā)利用 隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展 多糖及其綴合物作為支持組織和能量來源的 傳統(tǒng)觀念早已被突破 而被認(rèn)為是生物體內(nèi)除核酸以外的又一類重要的信息分子 而 且由于它們常是細(xì)胞表面信號識別 抗原抗體反應(yīng) 細(xì)胞間信息的傳遞和感受的關(guān)鍵因 子 因此 具有生物活性的活性多糖的研究日益受到重視 隨著研究的深入 越來越多的發(fā)現(xiàn)植物多糖具有很多特殊的功能 如藥用功能 研 究表明 黃芪多糖 34 為易溶于水的白色粉末 它對免疫抑制劑造成的免疫低下有明顯的 保護(hù)作用 是具有雙向作用的免疫調(diào)節(jié)劑 因而對臨床腫瘤放療患者 慢性放射患者及 各種原因造成免疫功能低下患者是一種很有效的輔助治療藥 同時(shí)具有雙向調(diào)節(jié)血糖作 用 21世紀(jì)人們更希望吃的健康 所以有很多多糖應(yīng)用于食品領(lǐng)域 如愛玉多糖用于濃 縮果汁 提高果汁的稠度和穩(wěn)定性等 還有些多糖應(yīng)用于面制品 肉制品 冰激凌 果 凍中等等 1 6 論文研究內(nèi)容和意義 黃傘 PHoliota adipose Fr ouel 是一種生長于柳樹上的大型真菌 黃傘子實(shí)體進(jìn) 行營養(yǎng)成分分析 發(fā)現(xiàn)黃傘子實(shí)體中粗蛋白質(zhì) 粗纖維和灰分的含量與 食物成分表 中一般食用菌的含量相當(dāng) 粗脂肪含量低于一般食用菌 多糖含量為 4 11 高于一般 食用菌 營養(yǎng)價(jià)值極高 目前已確定黃傘多糖具有抗腫瘤 抗疲勞 抗微生物活性等生 物功能 因此引起了人們越來越多的關(guān)注 黃傘營養(yǎng)保健價(jià)值高 但國內(nèi)對黃傘的研究起步較晚 且主要停留在對黃傘的野生 馴化 生物學(xué)特性及人工栽培技術(shù)等方面 42 44 目前關(guān)于黃傘子實(shí)體純化多糖的研究很 少 本文以小鼠免疫力的提高功能來確定黃傘子實(shí)體多糖的生物活性 對進(jìn)一步研究黃 傘多糖的生物功能具有重要的意義 我國菌物資源豐富 但食用菌資源大都處于野生狀態(tài) 并沒有得到有效的利用與開 發(fā) 食用菌保健品種類比較單一 主要以飲料 沖劑 膠囊和保健酒為主 而研究表明 食用菌具有的生物活性 可以提高人體的免疫力 抗衰老 抗癌 特別是野生食用菌功 效更顯著 因此 馴化野生食用菌 開發(fā)食用菌新產(chǎn)品 具有深遠(yuǎn)的意義 1 7 主要研究內(nèi)容 1 研究黃傘子實(shí)體粗多糖的初步純化 實(shí)驗(yàn)部分采用水提醇沉法 采用料液比 1 20 提取時(shí)間 2h 提取溫度 90 的提取條件 提取次數(shù) 2 次 合并兩次的提取液的 提取條件 粗多糖經(jīng) Sevag 中性蛋白酶 法除去蛋白質(zhì) 并比較兩種方法除蛋白的效率 2 研究黃傘子實(shí)體多糖的免疫活性 試驗(yàn)中采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方法 小鼠分 1 2 批 免疫 1 批進(jìn)行臟體比測定 遲發(fā)型超敏反應(yīng) 血清溶血素的測定 免疫 2 批進(jìn)行小鼠碳 廓清試驗(yàn) 東北林業(yè)大學(xué)畢業(yè)論文 10 2 材料與方法 2 1 試驗(yàn)材料 2 1 1 試驗(yàn)原料 黃傘 PHolita adiposa 東北林業(yè)大學(xué)森林保護(hù)實(shí)驗(yàn)室從野外分離得到 2 1 2 試劑試劑 印度墨水 北京市西中化工廠 注射用環(huán)磷酰胺 山西普德藥業(yè)有限公司 綿羊紅細(xì)胞 SRBC 哈爾濱潤博生物科技公司 中性蛋白酶 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司 無水乙醇 苯酚 正丁醇 乙醚 氯仿 硫酸 丙酮 葡萄糖等以上均為分析純試 劑 水提法提取的黃傘多糖 灰白色粉狀固體 配成高中低三個(gè)濃度的多糖溶液 即 100mg kg 200 mg kg 400 mg kg 置于 4 條件下儲存 2 1 3 試驗(yàn)主要儀器 可見光分光光度計(jì) 722 PC 上海精密科學(xué)儀器有限公司 紫外可見分光光度計(jì) 765 PC 上海精密科學(xué)儀器有限公司 循環(huán)水多用真空泵 SHB 3 鄭州杜甫儀器廠 臺式低速大容量離心機(jī) TDL 40B W 湖南星科科學(xué)儀器有限公司 電熱恒溫水浴鍋 DK S12 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司 電子精密天平 JA2003 上海良平儀器儀表有限公司 分析天平 ALC 1104 北京賽多利藏拙儀器系統(tǒng)有限公司 鼓風(fēng)干燥箱 DHG 9240 上海恒科學(xué)儀器有限公司 高速萬能粉碎機(jī) FW100 天津市泰斯特儀器有限公司 真空泠凍干燥機(jī) CHRIST 1 2 德國 Christ 公司 臺式離心機(jī) TDL 5 上海安亭科學(xué)儀器廠 微量血凝試驗(yàn)板 96 孔 東北林業(yè)大學(xué)畢業(yè)論文 11 游標(biāo)卡尺 精密度 0 02mm 哈爾濱量具刃具廠 微量注射器 1mL 血色素吸管 20 L 計(jì)時(shí)器 灌胃針 恒溫 CO2 培養(yǎng)箱 HF151 Heal Force Development Ltd 漩渦混合機(jī) XW 80A 江蘇海南市其林貝爾儀器制造有限公司 2 2 試驗(yàn)方法 2 2 1 黃傘子實(shí)體多糖的提取 黃傘子實(shí)體經(jīng)粉碎過 60 目篩 醇沉過夜除去小分子多糖 以料液比 1 20 提取時(shí) 間 2h 提取溫度 90 的條件 45 得到多糖提取液 殘?jiān)谏鲜鰲l件下復(fù)提 得到二次提 取液 合并兩次提取液 在 60 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原體積的 1 4 濃縮后冷卻至室溫 加入 3 倍體積的 90 乙醇 醇沉過夜 于 4000r min 條件下離心 10min 棄去上清液 沉淀物經(jīng) 凍干得黃傘粗多糖 2 2 2 黃傘子實(shí)體粗多糖的初步純化 2 2 2 1 Sevag 法 在 60 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原體積的 1 4 濃縮后冷至室溫 加入 3 倍體積的 90 乙醇 醇沉 過夜 于 4000r min 條件下離心 10min 棄去上清液 冷至室溫 按 Sevag 法 氯仿 正 丁醇 4 1 除去游離蛋白質(zhì) 醇沉過夜 離心 沉淀經(jīng)有機(jī)溶劑洗滌 洗滌的順序?yàn)?丙酮 乙醚 無水乙醇 凍干得黃傘子實(shí)體多糖 2 1 2 2 中性蛋白酶 Sevag 在 60 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原體積的 1 4 濃縮后冷至室溫 加入 3 倍體積的 90 乙醇 醇沉 過夜 于 4000r min 條件下離心 10min 棄去上清液 按 2 加入中性蛋白酶 45 最佳溫 度為 50 時(shí)間 2h PH 7 0 2h 后升溫至 80 滅酶 10min 其余同 2 2 2 1 2 2 3 多糖含量的測定 苯酚 硫酸法因方法簡單 快速 無需多糖純品等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于多糖含量的測 定 因此本實(shí)驗(yàn)采用此法 得回歸方程 Y aX b 多糖提取得率計(jì)算公式 多糖提取得率 85 9993 W CDV C a b OD490 其中 C 為供試液濃度 g mL D 為供試液的稀釋倍數(shù) V 為浸提液體積 mL W 為供試品干重 g 東北林業(yè)大學(xué)畢業(yè)論文 12 85 9993 為黃傘回流之后的平均