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蔗糖合成酶的測定方法一、儀器設(shè)備冷凍離心機(jī)、恒溫水浴、分光光度計二、試劑HEPES-NaOH(50mmol/L,pH7.5)緩沖液,包括50mmol/L MgCI2;2mmol/LEDTA;0.2%(W/V)BSA;2%PVP;0.1%間苯二酚:稱取0.1g溶解并定溶于100ml 95%乙醇中。30%鹽酸、2mol/L NaOH、100mmol/L UDPG、100mmol/L6-磷酸果糖、100mmol/L果糖三、操作方法1、粗酶液制備稱取0.5g樣品(植物葉片去掉主葉脈),洗凈剪碎,置于預(yù)冷的研缽中,加3ml Hepes-NaOH緩沖液,冰浴研磨,10000g離心10min。2、酶活性測定依次加入 50L粗酶液,50LHepes-NaOH緩沖液pH7.5,20L 50 mmol/LMgCI2,20L 100mmol/L UDPG,20L 100mmol/L6-磷酸果糖(20L 100mmol/L果糖),30中反應(yīng)30min后,加入200L 2mol/L NaOH終止反應(yīng),沸水煮10min,流水冷卻,加入1.5ml 30%鹽酸和0.5ml 0.1% 間苯二酚,搖勻后置于80水浴保溫10min,冷卻后置于480nm處,以提前殺死酶活性為空白比色測定蔗糖含量。同時取50L粗酶液,加入200L 2mol/L NaOH,以下同上操作,測定蔗糖含量。3、蔗糖標(biāo)線制作:取0、40、80、120、160、200g/ml的蔗糖溶液50L,操作同上,然后以蔗糖濃度為縱坐標(biāo),以吸光值為橫坐標(biāo),得方程。4、計算樣品中酶活性(gg1h1)= 式中 C反應(yīng)液催化產(chǎn)生的蔗糖總量(g); V1提取酶液時加入的緩沖液體積(ml); V2酶反應(yīng)時加入的粗酶液體積(ml)淀粉酶活性的測定1方法1.1試劑配制淀粉酶提取緩沖液:0.1mol/L-1檸檬酸溶液(pH 5.6);1%的淀粉溶液:用0.1mol/L-1的檸檬酸緩沖液(pH 5.6)配制;標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖溶液(1mg/mL-1);3,5-二硝基水楊酸試劑(DNS試劑):稱取6.5 g 3,5-二硝基水楊酸溶于少量水中,移入1000 mL容量瓶中,加入325 mL 2molL-1 NaOH溶液,再加入45g丙三醇,搖勻,冷卻后定容到1000 mL。淀粉和麥芽糖為Sigma產(chǎn)品,其余試劑為國產(chǎn)分析純試劑。1.2測定方法1.2.1酶液的提取 將每一個重復(fù)的3個果實(shí)去皮后切碎混勻,稱取其果肉1g,置于預(yù)冷的研缽中,加2mL預(yù)冷的0.1mol/L-1檸檬酸溶液(pH5.6)和少量石英砂研磨,將勻漿移入7mL的離心管中,再分別用1mL的0.1mol/L-1檸檬酸緩沖(pH 5.6)沖洗2次,于4下以15000g離心15min,上清液轉(zhuǎn)移入另一個5mL離心管中,作為酶提取液備用。1.2.2酶活性的測定取潔凈的試管18支,作標(biāo)記,每一個樣品設(shè)1個對照??偡磻?yīng)體積為0.5mL,測定管含0.2mL的酶提取液和0.3mL的1%淀粉溶液;對照管含0.2 mL的酶提取液和0.3mL的0.1mol/L-1檸檬酸溶液(pH 5.6,不含底物淀粉)將試管放入恒溫40的水浴鍋中,保溫30min后取出,立即加入1.5mL的DNS試劑終止反應(yīng)再將試管置于沸水浴中10min,取出后冰浴冷卻。取反應(yīng)液稀釋10倍,測定波長520nm處的吸光值,同上做麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出麥芽糖的含量,計算淀粉酶的總活性。周蓓云.-和-淀粉酶活性的測定.見:中國科學(xué)院上海植物生理研究所,上海市植物生理學(xué)會編.現(xiàn)代植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指南.北京:科學(xué)出版社,1999.123124酸性轉(zhuǎn)化酶活性的測定1.酶的制備和活性測定酶的制備參照Miron&schaffer(199l)以及王永章等(2。02)的方法,稍做修改。提取緩沖液為:150mmol/lTris一Hcl(pH8.0),10mmol/lMgC12,10mmol/l抗壞血酸,2mmol/LEDTA一Na,lmmol/LBenzadine(苯甲脒),0.1mmol/LPMSF和0.2%(v/v)一疏基乙醇,視發(fā)育階段不同加入3%(w/,)PvPP。稱取一定量的果肉,加入2-3倍體積冷的提取緩沖液,于高速勻漿器中快速破碎組織至勻漿,16000*g離心20min,上清液對稀釋10倍的提取緩沖液(不含PvPP)透析20h,其間更換透析液3次。經(jīng)透析的上清液用于可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶活性和數(shù)量的測定。離心得到的沉淀物用一定體積的提取緩沖液(不含PVPP)洗滌3遍,離心去上清液,沉淀用23倍體積的含0.5mol/LNaCI的提取緩沖液充分懸浮后,低溫(4)下振蕩浸提24h,16000*g離心20min,上清液透析后用于細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶活性和數(shù)量的測定。透析方法同上??扇苄运嵝赞D(zhuǎn)化酶和細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶活性的測定參照Miron&Schaffer(1991)的方法,測定反應(yīng)液為0.1mol/L乙酸一乙酸鈉緩沖液(pH4.8),0.1mol/L蔗糖。用3,5一二硝基水楊酸測定其生成還原糖的量。蔗糖合成酶的測定方法蔗糖是重要的光合產(chǎn)物,為植物體內(nèi)運(yùn)輸?shù)闹饕镔|(zhì),又是碳水化合物的暫貯形式之一。蔗糖合成酶(SS)、(SPS)是植物體內(nèi)催化其合成的兩種酶。這兩種酶在生物體內(nèi)的功能有所不同。蔗糖合成酶(SS)以游離果糖為受體,蔗糖磷酸合成酶(SPS)以果糖-6-磷酸為受體。后者形成的蔗糖磷酸,在蔗糖磷酸合成酶的作用下形成蔗糖。一般把蔗糖磷酸酯合成酶-蔗糖磷酸酶系統(tǒng)看作是蔗糖合成的主要途徑,而把蔗糖合成酶看作是蔗糖分解或形成核苷酸葡萄糖的系統(tǒng)。UDPG是合成蔗糖的葡萄糖供體,故催化UDPG合成的UDPG焦磷酸化酶活力的高低與蔗糖合成的速率有十分密切的關(guān)系。蔗糖的合成(二條途徑): 1、蔗糖合成酶 (非光合組織)UDPG+果糖 蔗糖+UDP2、磷酸蔗糖合成酶(光合組織)UDPG+F-6-P 磷酸蔗糖+UDP 磷酸蔗糖+H2O 蔗糖+Pi一、儀器設(shè)備冷凍離心機(jī)、恒溫水浴、分光光度計二、試劑HEPES-NaOH(50mmol/L,pH7.5)緩沖液,包括50mmol/L MgCI2;2mmol/LEDTA;0.2%(W/V)BSA;2%PVP;0.1%間苯二酚:稱取0.1g溶解并定溶于100ml 95%乙醇中。30%鹽酸、2mol/L NaOH、100mmol/L UDPG、100mmol/L6-磷酸果糖、100mmol/L果糖三、操作方法1、粗酶液制備稱取0.5g樣品(植物葉片去掉主葉脈),洗凈剪碎,置于預(yù)冷的研缽中,加3ml Hepes-NaOH緩沖液,冰浴研磨,10000g離心10min。2、酶活性測定依次加入 50L粗酶液,50LHepes-NaOH緩沖液pH7.5,20L 50 mmol/LMgCI2,20L 100mmol/L UDPG,20L 100mmol/L6-磷酸果糖(20L 100mmol/L果糖),30中反應(yīng)30min后,加入200L 2mol/L NaOH終止反應(yīng),沸水煮10min,流水冷卻,加入1.5ml 30%鹽酸和0.5ml 0.1% 間苯二酚,搖勻后置于80水浴保溫10min,冷卻后置于480nm處,以提前殺死酶活性為空白比色測定蔗糖含量。同時取50L粗酶液,加入200L 2mol/L NaOH,以下同上操作,
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