蔗糖合成酶的測定方法.doc

蔗糖合成酶的測定方法一、儀器設(shè)備冷凍離心機(jī)、恒溫水浴、分光光度計二、試劑HEPES-NaOH（50mmol/L，pH7.5）緩沖液，包括50mmol/L MgCI2；2mmol/LEDTA；0.2%(W/V)BSA；2%PVP；0.1%間苯二酚：稱取0.1g溶解并定溶于100ml 95%乙醇中。30%鹽酸、2mol/L NaOH、100mmol/L UDPG、100mmol/L6-磷酸果糖、100mmol/L果糖三、操作方法1、粗酶液制備稱取0.5g樣品（植物葉片去掉主葉脈），洗凈剪碎，置于預(yù)冷的研缽中，加3ml Hepes-NaOH緩沖液，冰浴研磨，10000g離心10min。2、酶活性測定依次加入 50L粗酶液，50LHepes-NaOH緩沖液pH7.5，20L 50 mmol/LMgCI2，20L 100mmol/L UDPG，20L 100mmol/L6-磷酸果糖（20L 100mmol/L果糖），30中反應(yīng)30min后，加入200L 2mol/L NaOH終止反應(yīng)，沸水煮10min，流水冷卻，加入1.5ml 30%鹽酸和0.5ml 0.1% 間苯二酚，搖勻后置于80水浴保溫10min，冷卻后置于480nm處，以提前殺死酶活性為空白比色測定蔗糖含量。同時取50L粗酶液，加入200L 2mol/L NaOH，以下同上操作，測定蔗糖含量。3、蔗糖標(biāo)線制作：取0、40、80、120、160、200g/ml的蔗糖溶液50L，操作同上，然后以蔗糖濃度為縱坐標(biāo)，以吸光值為橫坐標(biāo)，得方程。4、計算樣品中酶活性（gg1h1）= 式中 C反應(yīng)液催化產(chǎn)生的蔗糖總量（g）； V1提取酶液時加入的緩沖液體積（ml）； V2酶反應(yīng)時加入的粗酶液體積（ml）淀粉酶活性的測定1方法1.1試劑配制淀粉酶提取緩沖液：0.1mol/L-1檸檬酸溶液(pH 5.6);1%的淀粉溶液：用0.1mol/L-1的檸檬酸緩沖液(pH 5.6)配制；標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖溶液(1mg/mL-1);3,5-二硝基水楊酸試劑(DNS試劑):稱取6.5 g 3,5-二硝基水楊酸溶于少量水中，移入1000 mL容量瓶中，加入325 mL 2molL-1 NaOH溶液，再加入45g丙三醇，搖勻，冷卻后定容到1000 mL。淀粉和麥芽糖為Sigma產(chǎn)品，其余試劑為國產(chǎn)分析純試劑。1.2測定方法1.2.1酶液的提取 將每一個重復(fù)的3個果實(shí)去皮后切碎混勻，稱取其果肉1g，置于預(yù)冷的研缽中，加2mL預(yù)冷的0.1mol/L-1檸檬酸溶液(pH5.6)和少量石英砂研磨，將勻漿移入7mL的離心管中，再分別用1mL的0.1mol/L-1檸檬酸緩沖(pH 5.6)沖洗2次,于4下以15000g離心15min，上清液轉(zhuǎn)移入另一個5mL離心管中，作為酶提取液備用。1.2.2酶活性的測定取潔凈的試管18支，作標(biāo)記，每一個樣品設(shè)1個對照?？偡磻?yīng)體積為0.5mL，測定管含0.2mL的酶提取液和0.3mL的1%淀粉溶液；對照管含0.2 mL的酶提取液和0.3mL的0.1mol/L-1檸檬酸溶液(pH 5.6,不含底物淀粉)將試管放入恒溫40的水浴鍋中，保溫30min后取出，立即加入1.5mL的DNS試劑終止反應(yīng)再將試管置于沸水浴中10min，取出后冰浴冷卻。取反應(yīng)液稀釋10倍，測定波長520nm處的吸光值，同上做麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出麥芽糖的含量，計算淀粉酶的總活性。周蓓云.-和-淀粉酶活性的測定.見：中國科學(xué)院上海植物生理研究所，上海市植物生理學(xué)會編.現(xiàn)代植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指南.北京：科學(xué)出版社，1999.123124酸性轉(zhuǎn)化酶活性的測定1.酶的制備和活性測定酶的制備參照Miron&schaffer(199l)以及王永章等(2。02)的方法，稍做修改。提取緩沖液為:150mmol/lTris一Hcl(pH8.0)，10mmol/lMgC12，10mmol/l抗壞血酸，2mmol/LEDTA一Na，lmmol/LBenzadine(苯甲脒)，0.1mmol/LPMSF和0.2%(v/v)一疏基乙醇，視發(fā)育階段不同加入3%(w/，)PvPP。稱取一定量的果肉，加入2-3倍體積冷的提取緩沖液，于高速勻漿器中快速破碎組織至勻漿，16000*g離心20min，上清液對稀釋10倍的提取緩沖液(不含PvPP)透析20h，其間更換透析液3次。經(jīng)透析的上清液用于可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶活性和數(shù)量的測定。離心得到的沉淀物用一定體積的提取緩沖液(不含PVPP)洗滌3遍，離心去上清液，沉淀用23倍體積的含0.5mol/LNaCI的提取緩沖液充分懸浮后，低溫(4)下振蕩浸提24h，16000*g離心20min，上清液透析后用于細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶活性和數(shù)量的測定。透析方法同上?？扇苄运嵝赞D(zhuǎn)化酶和細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶活性的測定參照Miron&Schaffer(1991)的方法，測定反應(yīng)液為0.1mol/L乙酸一乙酸鈉緩沖液(pH4.8)，0.1mol/L蔗糖。用3，5一二硝基水楊酸測定其生成還原糖的量。蔗糖合成酶的測定方法蔗糖是重要的光合產(chǎn)物，為植物體內(nèi)運(yùn)輸?shù)闹饕镔|(zhì)，又是碳水化合物的暫貯形式之一。蔗糖合成酶（SS）、（SPS）是植物體內(nèi)催化其合成的兩種酶。這兩種酶在生物體內(nèi)的功能有所不同。蔗糖合成酶（SS）以游離果糖為受體，蔗糖磷酸合成酶（SPS）以果糖-6-磷酸為受體。后者形成的蔗糖磷酸，在蔗糖磷酸合成酶的作用下形成蔗糖。一般把蔗糖磷酸酯合成酶-蔗糖磷酸酶系統(tǒng)看作是蔗糖合成的主要途徑，而把蔗糖合成酶看作是蔗糖分解或形成核苷酸葡萄糖的系統(tǒng)。UDPG是合成蔗糖的葡萄糖供體，故催化UDPG合成的UDPG焦磷酸化酶活力的高低與蔗糖合成的速率有十分密切的關(guān)系。蔗糖的合成（二條途徑）： 1、蔗糖合成酶 （非光合組織）UDPG+果糖 蔗糖+UDP2、磷酸蔗糖合成酶（光合組織）UDPG+F-6-P 磷酸蔗糖+UDP 磷酸蔗糖+H2O 蔗糖+Pi一、儀器設(shè)備冷凍離心機(jī)、恒溫水浴、分光光度計二、試劑HEPES-NaOH（50mmol/L，pH7.5）緩沖液，包括50mmol/L MgCI2；2mmol/LEDTA；0.2%(W/V)BSA；2%PVP；0.1%間苯二酚：稱取0.1g溶解并定溶于100ml 95%乙醇中。30%鹽酸、2mol/L NaOH、100mmol/L UDPG、100mmol/L6-磷酸果糖、100mmol/L果糖三、操作方法1、粗酶液制備稱取0.5g樣品（植物葉片去掉主葉脈），洗凈剪碎，置于預(yù)冷的研缽中，加3ml Hepes-NaOH緩沖液，冰浴研磨，10000g離心10min。2、酶活性測定依次加入 50L粗酶液，50LHepes-NaOH緩沖液pH7.5，20L 50 mmol/LMgCI2，20L 100mmol/L UDPG，20L 100mmol/L6-磷酸果糖（20L 100mmol/L果糖），30中反應(yīng)30min后，加入200L 2mol/L NaOH終止反應(yīng)，沸水煮10min，流水冷卻，加入1.5ml 30%鹽酸和0.5ml 0.1% 間苯二酚，搖勻后置于80水浴保溫10min，冷卻后置于480nm處，以提前殺死酶活性為空白比色測定蔗糖含量。同時取50L粗酶液，加入200L 2mol/L NaOH，以下同上操作，