蛋白免疫印跡技術(shù)研究概述.doc

蛋白免疫印跡技術(shù)研究概述摘要：蛋白免疫印跡技術(shù)是一種簡單的、高效的蛋白免疫檢測技術(shù)，特別是對蛋白含量低的樣品，效果更佳。這種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是在一個生物樣品中使用特定的抗體檢測多種蛋白質(zhì)。蛋白免疫印跡技術(shù)已經(jīng)得到的很大的發(fā)展，現(xiàn)在已經(jīng)出現(xiàn)多種轉(zhuǎn)移方法。至今，蛋白免疫印跡技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于科研和診斷檢測結(jié)果檢測、在免疫組化中鑒定特定的抗體等領(lǐng)域。關(guān)鍵字：蛋白印記；轉(zhuǎn)??；標(biāo)記The Overview of Research of Western BlottingAbstract:Despite its overall simplicity,protein blotting or western blotting has be-en proven to be a powerful procedure for the immunodetection of proteins,especially those that are of low abundance.The usefulness of this procedure stems from its abilit- y to provide simultaneous resolution of multiple immunogenic antigens within a sam- ple for detection by specific antibodies.Protein blotting has evolved greatly since its inception and researchers have a variety of ways and means to carry out this transfe- r.This procedure is used to provide confirmation of results both in research and diagnostic testing.Specificity of antibodies used for immunohistochemistry is of critical importance.Key words:western blotting;Transfer printing; mark1 引言 蛋白質(zhì)印跡技術(shù)1（western blotting）中文一般稱為，是繼DNA印跡（southern blotting）和RNA（northern blotting）之后發(fā)展起來的，集電泳、轉(zhuǎn)印和免疫標(biāo)記為一體的一項蛋白質(zhì)分離檢測技術(shù)。它是分子生物學(xué)2、生物化學(xué)3和免疫遺傳學(xué)4中常用的一種實驗方法。與其他蛋白分離技術(shù)相比具有靈敏度高，可達(dá)ng級，用Ecl顯色法時理論上可達(dá)pg級，且操作方便，特異性高5、可進(jìn)行定性和半定量分析等優(yōu)點(diǎn)的特點(diǎn)。因此，蛋白印跡技術(shù)獲得了較好的成果，受到越來越多研究者的青睞。Western Blot實驗技術(shù)在諸多方面有著廣泛的應(yīng)用，具有良好的應(yīng)用前景。2 蛋白免疫印跡技術(shù)簡介 蛋白質(zhì)印跡的發(fā)明者一般認(rèn)為是美國斯坦福大學(xué)的喬治斯塔克（George Stark）。在尼爾伯奈特（Neal Burnette）于1981年所著的分析生物化學(xué)（Analytical Biochemistry）中首次被稱為Western Blot6。然只有二、三十年的歷史，但由于其靈敏度高、操作方便、特異性高、可進(jìn)行定性和半定量分析等優(yōu)點(diǎn)的特點(diǎn)，目前，已成功的應(yīng)用于鑒定蛋白質(zhì)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)域分析、蛋白質(zhì)復(fù)性、抗體純化、氨基酸組成分析和序列分析及蛋白質(zhì)表達(dá)水平7等中。 Western Blot由三大部分組成7：SDS-PAGE凝膠電泳將分子量大小不同的蛋白分離開；將蛋白條帶轉(zhuǎn)移到固相支持物上；用特異性的抗體檢測出固相支持物上的研究對象，也就是相應(yīng)抗原如圖（2.1）。圖2.1蛋白印跡操作流程3 蛋白印跡技術(shù)步驟 蛋白印跡采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗8。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分，主要步驟如下。 （1）電轉(zhuǎn)移常用的幾種印跡法有：點(diǎn)印跡、擴(kuò)散印跡、溶劑流印跡和電泳印跡。目前，最廣泛使用的印跡方法是半干式電轉(zhuǎn)印(電轉(zhuǎn)印也稱電轉(zhuǎn)移)，即在電場作用下將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移液浸濕的膜上。電轉(zhuǎn)印速度快，轉(zhuǎn)移效率離，條件容易控制，重復(fù)性好，可保持膠的分辨率。 （2）封閉 蛋白質(zhì)分子從膠上轉(zhuǎn)移到膜上，為減少探針的非特異結(jié)合，用非反應(yīng)活性分子封阻轉(zhuǎn)移膜上未吸附臻巍質(zhì)的區(qū)域，以降低檢測的背景信號。（3）免疫結(jié)合反應(yīng) 用目的綴白的抗體與轉(zhuǎn)移膜上的目的蛋白(靶蛋白)進(jìn)行特異性免疫結(jié)合反應(yīng)，再用標(biāo)記過的二抗與膜上的一抗反應(yīng)。（4）檢測 根據(jù)連接二抗標(biāo)識物檢出，如：化學(xué)發(fā)光、顯色和放射性同位素測定等，間接檢測出網(wǎng)的蛋白的存在。目前常用的的檢測方法是化學(xué)發(fā)光法，即當(dāng)結(jié)合在膜上的HRP標(biāo)記過的抗體與熒光底物結(jié)合，經(jīng)HRP酶的純化學(xué)氧化產(chǎn)生激發(fā)態(tài)發(fā)光產(chǎn)物。4 蛋白印跡技術(shù)原理4.1 SDS凝膠電泳 蛋白印跡與一般的蛋白質(zhì)分離技術(shù)相似，使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）分離不同分子量的蛋白質(zhì)。 聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳是以聚丙烯酰胺凝膠做支持物的一種區(qū)帶電泳，由于此種凝膠具有分子篩的性質(zhì)，所以本法對樣品的分離作用，不僅決定于樣品中各組分所帶凈電荷的多少，也與分子的大小有關(guān)9。其次，聚丙烯酰胺凝膠電泳還有一種獨(dú)特的濃縮效應(yīng)，即在電泳開始階段，由于不連續(xù)pH 梯度的作用，將樣品壓縮成一條狹窄區(qū)帶，從而提高了分離效果10。聚丙烯酰胺凝膠具有網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)，很少帶有離子的側(cè)基，惰性好，電泳時，電滲作用小，幾乎無吸附作用，對熱穩(wěn)定，呈透明狀，易于觀察結(jié)果11。聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(簡稱Acr)和交聯(lián)劑亞甲基雙丙烯酰胺(簡稱Bis)在催化劑的作用下，聚合交聯(lián)而成的含有酰胺基側(cè)鏈的脂肪族大分子化合物。PAGE的濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)一起可以將不同分子量，不同電荷的蛋白質(zhì)分離開來。4.2 蛋白印跡轉(zhuǎn)印技術(shù) 在PAGE凝膠上的蛋白質(zhì)需要經(jīng)過轉(zhuǎn)膜才能被進(jìn)一步檢測，其原理是在電流的作用下，帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)從凝膠上解聚，隨電流轉(zhuǎn)移到固相載體膜上12。膜的選擇：印跡中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龍膜、PVDF等。常用的膜材料是PVDF膜，其具有更好的蛋白吸附、物理強(qiáng)度，以及具有更好的化學(xué)兼容性。 蛋白免疫印跡法成敗的關(guān)鍵是首先必須將分離的蛋白，從非變性或SDS-PAGE凝膠上轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素(NC)膜、聚偏乙烯氟化物(PVDF)膜等固相膜上，PVDF膜較NC膜具有更高的蛋白結(jié)合性能、物理強(qiáng)度和化學(xué)穩(wěn)定性。轉(zhuǎn)印方法主要有以下兩種。4.2.1 簡單擴(kuò)散 此法最初用于等電聚焦電泳凝膠，后被擴(kuò)展于其他凝膠電泳系統(tǒng)的轉(zhuǎn)印，操作簡單，在電泳膠上依次平鋪轉(zhuǎn)印膜、濾紙、玻璃片和一定重量的物體，借助重壓和擴(kuò)散將凝膠內(nèi)分離的蛋白條帶印跡到固相膜上13。簡單擴(kuò)散的特點(diǎn)是可在一塊膠上轉(zhuǎn)印多張膜14，這也是簡單擴(kuò)散較電轉(zhuǎn)印的優(yōu)越之處?；罨z電泳是一種主要用于檢測酶分子(如核酸酶或蛋白酶)的電泳技術(shù)。首先，酶分子在含有相應(yīng)底物(如III型膠原或酪蛋白B)的凝膠中進(jìn)行非連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后用含25Triton X-100的溶液洗去膠中的SDS，使酶復(fù)性以催化底物，用考馬斯亮藍(lán)(CBB)復(fù)染凝膠后便可在藍(lán)色的背景下觀測到清晰的被酶分解的底物染色帶15。將此法運(yùn)用到免疫印跡技術(shù)中，先將凝膠簡單擴(kuò)散至PVDF膜再按上法對凝膠進(jìn)行活化膠染色，可同時進(jìn)行膜免疫印跡反應(yīng)和凝膠的酶催化反應(yīng)。圖4.1蛋白轉(zhuǎn)印圖4.2.2 電轉(zhuǎn)印 電轉(zhuǎn)印主要優(yōu)點(diǎn)是快速，可靠、轉(zhuǎn)印徹底。電轉(zhuǎn)印又分濕轉(zhuǎn)印和半干轉(zhuǎn)印兩種。 (1)濕轉(zhuǎn)?。╳et transfer）16,17 將整個夾心式轉(zhuǎn)印體系(支持墊-濾紙-轉(zhuǎn)印膜一凝膠-濾紙-支持墊)垂直地直接浸入緩沖液內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)印。其裝置多采用Towbin設(shè)計的垂直式不銹鋼/鉑電極轉(zhuǎn)印槽。 (2)半干轉(zhuǎn)印(semi-dry transfer)16,17 所謂半干轉(zhuǎn)印或水平式轉(zhuǎn)印，是事先將轉(zhuǎn)印體系中的凝膠、膜、濾紙及支持墊浸泡在轉(zhuǎn)移緩沖液中，浸濕片刻后直接進(jìn)行轉(zhuǎn)印，而無須將其浸入緩沖液內(nèi)。半干轉(zhuǎn)印優(yōu)于垂直轉(zhuǎn)印，因為水平轉(zhuǎn)印儀一次可以轉(zhuǎn)印多塊膠，而且所需電壓較低。4.3 蛋白免疫印跡檢測 轉(zhuǎn)印在膜上的蛋白抗原雖可直接用有機(jī)染料染色，但主要還是采用基于抗原-抗體反應(yīng)原理的免疫學(xué)檢測。根據(jù)抗體標(biāo)記物不同，可分為以下幾種方法。4.3.1 同位素標(biāo)記技術(shù) 將125I標(biāo)記葡萄球菌A蛋白或G蛋白(SPA、SPG)或其他二抗，與結(jié)合在膜上的抗原一抗體(一抗)復(fù)合物發(fā)生反應(yīng)，通過檢測放射性同位素活性來驗證相應(yīng)抗原的特異性18,19。放射性標(biāo)記有兩個優(yōu)點(diǎn)，一是顯色條帶通過閃爍計數(shù)儀可以進(jìn)行定量分析，二是重復(fù)性較好18,19。4.3.2 非同位素標(biāo)記技術(shù) (1)酶標(biāo)記20 酶標(biāo)記法的優(yōu)點(diǎn)是簡便，不需特殊儀器設(shè)備，不足是不易精確定量分析，而且膜上非特異性反應(yīng)較強(qiáng)，使結(jié)果難以判斷和分析。隨著酶化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)的問世和發(fā)展，酶標(biāo)記免疫印跡技術(shù)得到了更加廣泛而有效地應(yīng)用。 (2)化學(xué)發(fā)光標(biāo)記 化學(xué)發(fā)光不像熒光和磷光那樣需要激發(fā)光源，僅需一個單色光檢測儀?；瘜W(xué)發(fā)光雖不如激發(fā)光譜學(xué)應(yīng)用廣泛，但其檢測極限卻比其他發(fā)光技術(shù)要低10100倍。大部分化學(xué)發(fā)光技術(shù)均需采用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，應(yīng)用得較多的是魯米諾21。當(dāng)結(jié)合在膜上的HRP或AKP標(biāo)記的抗體與熒光底物發(fā)生結(jié)合后，底物經(jīng)酶的化學(xué)氧化產(chǎn)生激發(fā)態(tài)產(chǎn)物，后者隨即發(fā)出光信號。例如，HRP在過氧化氫存在下，能催化魯米諾氧化使其進(jìn)入激發(fā)態(tài)，進(jìn)而衰變而發(fā)光。膜上抗原一抗體特異性反應(yīng)條帶可通過曝光系統(tǒng)在x光膠片上得到顯影，曝光時間通常不到1min。該法的檢測敏感性可達(dá)lpg?；瘜W(xué)發(fā)光法的另一個優(yōu)勢之處是，可以在同一張膜上分別檢測不同的抗原。其做法是，當(dāng)一次曝光檢測結(jié)束后，用抗體去除液(pH6.7，20g/LSDS，100mmoL/L，2-巰基乙醇，62.5mmol/LTris-HCl)除去轉(zhuǎn)印膜上已結(jié)合的抗體，按常法洗滌、封閉后，加另外一種一抗和酶標(biāo)二抗，進(jìn)行再次曝光，顯色。用同法可在同張膜上進(jìn)行多次抗體結(jié)合和檢測。特別適合于檢測細(xì)胞裂解液中相應(yīng)蛋白的表達(dá)情況。目前化學(xué)發(fā)光檢測已有成套試劑盒供應(yīng)(ECLTM蛋白免疫印跡detection reagents，Amersham Pharmaeia Biotech)，大大簡化了實驗操作。Krajewski等22建立了一種多重抗原檢測(MAD)法舊，可在不需去除抗體的前提下在同一張膜上相繼檢測多種抗原。具體方法是，第一種抗原一抗體-酶標(biāo)二抗發(fā)光底物相繼反應(yīng)后，經(jīng)過曝光系統(tǒng)將轉(zhuǎn)印膜顯色帶轉(zhuǎn)移至X光膠片上，保留轉(zhuǎn)印膜，使膜上的抗原抗體復(fù)合物與底物(如DAB)發(fā)生反應(yīng)，以終止HRP活性，這樣抗原一抗體酶復(fù)合物便不能與隨后加入的第二種抗體系統(tǒng)發(fā)生反應(yīng)。按此法操作，能在同張膜上相繼使用至少12種不同的抗體。 (3)金標(biāo)記 標(biāo)記也可用于檢測轉(zhuǎn)印膜上的抗原抗體復(fù)合物，其敏感性為1050ng，顯色帶呈紅色。當(dāng)用銀染液復(fù)染后，顯色帶變?yōu)楹谏?，抗原檢測敏感性可達(dá)110ng，接近同位素標(biāo)記法23。 (4)熒光素標(biāo)記熒光素 尼羅紅(Nile red)可對SDS-PAGE凝膠上的蛋白條帶進(jìn)行染色，被染凝膠可直接轉(zhuǎn)印至PVDF膜，這是考馬斯亮藍(lán)和銀染法所不具有的特性。轉(zhuǎn)印在PVDF膜上的蛋白條帶隨即可用熒光素2-甲氧-2，4二苯基呋喃(MDPF)進(jìn)行染色，染色后的PVDF膜可進(jìn)一步做免疫標(biāo)記以檢測特異性抗原。此法可使凝膠上蛋白帶染色、轉(zhuǎn)印膜上蛋白帶顯色以及膜上特異性蛋白的免疫標(biāo)記檢測在一次蛋白免疫印跡中同時進(jìn)行24。 最近，有學(xué)者應(yīng)用熒光素藻膽素(異藻藍(lán)蛋白)標(biāo)記抗鼠IsG建立敏感的熒光檢測技術(shù)檢測尼龍膜上結(jié)合的鼠IgG。其敏感性高于酶放大反應(yīng)和化學(xué)發(fā)光標(biāo)記技術(shù)。由于去除了底物反應(yīng)、X光膠片曝光時間，因而比化學(xué)發(fā)光法縮短了操作時間25。為進(jìn)一步縮短二抗反應(yīng)和底物顯色時間，最近Bergendahlpl26等建立了一種直接熒光素標(biāo)記技術(shù)，利用熒光素的琥珀酰亞胺基團(tuán)能選擇性地與抗體分子中的賴氨酸殘基發(fā)生結(jié)合的原理，將強(qiáng)熒光團(tuán)染料青色素(cyanine dye)IC5直接標(biāo)記在一抗，當(dāng)?shù)鞍捉?jīng)SDSPAGE電泳、轉(zhuǎn)印及封閉后，直接將膜浸入1C5標(biāo)記的一抗，室溫反應(yīng)560min，PBS洗滌后即可用熒光檢測儀在紅熒光掃描模式中進(jìn)行測定。此法從電泳、轉(zhuǎn)印、到免疫檢測，僅需3h，而普通化學(xué)發(fā)光標(biāo)記法往往需要12d時間。5 結(jié)語 蛋白分離技術(shù)正在持續(xù)發(fā)展，而且不斷涌現(xiàn)出多種轉(zhuǎn)移檢測蛋白質(zhì)的方法。因為是通過特定的蛋白抗體檢測，所以此種蛋白分離技術(shù)可以解決一種蛋白樣品中多種蛋白的檢測。這使得Western Blot技術(shù)在蛋白分離方面非凡的價值，特別是在免疫組化方面的檢測特定的蛋白意義深遠(yuǎn)。參 考 文 獻(xiàn)：1武建國.實用臨床免疫學(xué)檢驗M.南京:江蘇科學(xué)技術(shù)出版社，1990.67-70.2于爽,王蕾,耿秋娜,等.牛血紅蛋白印跡聚合物研究J.2008-2008年全國生物醫(yī)藥色譜交流 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