真核生物DNA的復(fù)制.doc

第八節(jié) 真核生物的DNA復(fù)制在上一節(jié)中,已經(jīng)從解決線形DNA復(fù)制終止問(wèn)題的角度講解了一種真核生物病毒一一腺病毒的DNA復(fù)制。本節(jié)將要講解真核生物的復(fù)制原點(diǎn),復(fù)制元和復(fù)制元族;真核生物的DNA聚合酶和引發(fā)酶;作為真核生物DNA復(fù)制模型的SV40的復(fù)制原點(diǎn)和大T抗原以及復(fù)制過(guò)程;真核生物染色體末端的DNA的復(fù)制F真核生物復(fù)制過(guò)程中的核小體結(jié)構(gòu)。一、真核生物的復(fù)制原點(diǎn),復(fù)制元和復(fù)制元族在E.coli中,DNA復(fù)制速度大約是105bp/分,而真核細(xì)胞的DNA聚合酶活性要低得多,復(fù)制速度大約為500bp/分500Obp/分。這樣,如果按典型的哺乳動(dòng)物染色體DNA(比E.coliDNA大50倍)來(lái)計(jì)算,則真核DNA的復(fù)制時(shí)間就會(huì)是E.Coli的1000倍即約一個(gè)月的時(shí)間。事實(shí)上,真核生物DNA復(fù)制時(shí)間一般為幾個(gè)小時(shí)。這是通過(guò)從許多復(fù)制原點(diǎn)同時(shí)開(kāi)始并雙向復(fù)制而實(shí)現(xiàn)的。用放射自顯影方法在哺乳動(dòng)物染色體上看到許多復(fù)制泡,每個(gè)復(fù)制泡都有固定的起點(diǎn)(復(fù)制原點(diǎn)),然后雙向伸展,與相鄰的復(fù)制泡會(huì)合。這樣一段段的DNA就稱為復(fù)制單元,簡(jiǎn)稱復(fù)制元（replion)。復(fù)制元的大小是不均一的,從1.3萬(wàn)bp90萬(wàn)bp不等。不同生物的復(fù)制元大小當(dāng)然不會(huì)相同；就是同一種生物在不同的生長(zhǎng)條件下,復(fù)制元的大小也不同。生長(zhǎng)快的時(shí)候,復(fù)制元就小。例如果蠅大約有5000個(gè)復(fù)制原點(diǎn),每個(gè)復(fù)制元平均大小約3萬(wàn)bpz而在卵受精后,復(fù)制起點(diǎn)增加到大約5萬(wàn)個(gè),僅需3分鐘就可以將整個(gè)基因組復(fù)制完畢。其調(diào)節(jié)機(jī)制目前毫無(wú)所知。幾個(gè)鄰近的復(fù)制元可組成復(fù)制元族,每個(gè)復(fù)制元族少至兩個(gè)復(fù)制元,多至250個(gè)復(fù)制元。不同的復(fù)制元族在復(fù)制起始的時(shí)間上有先有后,而同一復(fù)制元族內(nèi)各復(fù)制元基本上是同步的。真核生物的復(fù)制原點(diǎn)的DNA序列并無(wú)固定的模式,但大多包含一個(gè)富含AT的序列,可能還有一個(gè)特異性蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)。二、真核生物的DNA聚合酶和引發(fā)酶與真核細(xì)胞中多起點(diǎn)復(fù)制相應(yīng)的特點(diǎn)是細(xì)胞中DNA的聚合酶分子數(shù)目多。在E.Coli中,只有pol 10個(gè)20個(gè)分子,而一個(gè)典型的動(dòng)物細(xì)胞含有DNA聚合酶2000個(gè)60000個(gè)分子。DNA聚合酶可能是真核生物的主要的DNA聚合酶,此外還有DNA聚合酶和。現(xiàn)將四種DNA聚合酶的性質(zhì)總結(jié)于下表。大多數(shù)真核生物DNA聚合酶都只有聚合活性,而不像細(xì)菌DNA聚合酶那樣除了聚合活性外還有外切酶活性。而新近發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶不但有聚合酶活性,而且還有35外切酶活性。DNA聚合酶與DNA引發(fā)酶結(jié)合得相當(dāng)緊密,甚至在用DNA聚合酶的抗體進(jìn)行親和層析時(shí),這個(gè)緊密的復(fù)合物也一同被吸附;但DNA引發(fā)酶可以被50%乙二醇(ethylene glycol)所洗脫。因此前幾年人們認(rèn)為DNA聚合酶兼具引發(fā)酶的活性是不恰當(dāng)?shù)摹?shí)驗(yàn)表明,DNA聚合酶和DNA引發(fā)酶的復(fù)合物是復(fù)制體系所必需的。DNA聚合酶和在體外都可以被一種霉菌的抗菌素aphidicolin所抑制,在體內(nèi)該抗菌素則抑制細(xì)胞DNA的復(fù)制。實(shí)驗(yàn)表明,在細(xì)胞DNA合成期(S期),DNA聚合酶的含量急劇增加。而對(duì)于DNA聚合酶,控制細(xì)胞周期的蛋白質(zhì)cyclin則是它不可缺少的輔助成分(亞基?)。據(jù)此,人們推測(cè),真核生物的DNA復(fù)制是由DNA聚合酶和協(xié)同進(jìn)行的。DNA聚合酶。在細(xì)胞周期中含量變化不大,可能與損傷DNA的修復(fù)有關(guān)。DNA聚合酶的功能主要是負(fù)責(zé)線粒體DNA的復(fù)制，而它在核內(nèi)的功能還不清楚。 四種DNA聚合酶的性質(zhì) DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶位置核內(nèi)核內(nèi)線粒體及核內(nèi)核內(nèi)活性比例80%10%-15%2%-15%未計(jì)算分子量KDa110-1204560？aphidicolin抑制反應(yīng)+-+BUPdGTP抑制反應(yīng)+-DNA引發(fā)酶活性+-35外切核酸酶活性-+亞基數(shù)多亞基單亞基單亞基多亞基前面,我們介紹了真核生物的DNA聚合酶。現(xiàn)在,我們還必須了解真核生物DNA引發(fā)酶的性質(zhì)。引發(fā)酶分子量大約5OKDa-6OKD。首先,正如上面所說(shuō),引發(fā)酶能夠與DNA聚合酶形成緊密的復(fù)合物。這種復(fù)合物不但是復(fù)制所必需的,而且與結(jié)合于復(fù)制原點(diǎn)的特異性蛋白質(zhì)構(gòu)成了復(fù)制體.系的種族特異性。例如,來(lái)自人類(lèi)HeLa細(xì)胞的復(fù)制體系,如果用DNA聚合酶抗體去除體系中的DNA聚合酶和引發(fā)酶的復(fù)合物,則復(fù)制體系的其余組分不能支持SV40復(fù)制原點(diǎn)在體外的復(fù)制(在大T抗原存在時(shí))。如果加人人類(lèi)HeLa細(xì)胞中的這種復(fù)合物或猴子COS細(xì)胞中的復(fù)合物,均能恢復(fù)復(fù)制能力。而加入小鼠或牛的復(fù)合物以及E.coli DNA聚合酶I或聚合酶全酶均不能奏效。這可能是該復(fù)合物與大T抗原之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的特異性作用有關(guān)。其次,真核生物的DNA引發(fā)酶的引物合成方式較為特別。它的作用是陣發(fā)式的,每次作用能拷貝6個(gè)-15個(gè)核苷酸。當(dāng)DNA聚合酶缺少時(shí),首次陣發(fā)性合成產(chǎn)物可以被下幾次陣發(fā)性合成所延長(zhǎng)成為很長(zhǎng)的多聚核苷酸。但是在有活性的DNA聚合酶和足夠的dNTP存在時(shí),引物僅是第一次陣發(fā)性合成產(chǎn)物。最后,DNA引發(fā)酶不但能利用rNTP為合成前體,而且還利用dNTP為合成前體。在一次陣發(fā)性合成的引物中,第一個(gè)核苷酸總是rA；而以后的核苷酸要么都是核糖核苷酸,要么都是脫氧核糖核苷酸,而不能是二者都有。由于引發(fā)酶能夠合成少量的脫氧核糖核苷酸,因此精確確定DNA聚合酶何時(shí)接替引發(fā)酶是很困難的。然而,引物一般只有6個(gè)-15個(gè)核苷酸,對(duì)于SV40體外DNA復(fù)制情況的分析,發(fā)現(xiàn)它的引物仍然主要為6個(gè)-9個(gè)核苷酸的RNA。三、真核生物染色體未端DNA的復(fù)制真核生物同樣面臨著線形DNA復(fù)制結(jié)束時(shí)所產(chǎn)生的5末端隱縮的問(wèn)題。這一問(wèn)題的解決有賴于端粒的結(jié)構(gòu)和能夠識(shí)別或結(jié)合端粒的蛋白質(zhì)和酶。關(guān)于端粒蛋白質(zhì)的研究正在進(jìn)展之中,已發(fā)現(xiàn)的幾種端粒蛋白質(zhì)（見(jiàn)前述）。Blackburn等人首先發(fā)現(xiàn)四膜蟲(chóng)端粒中存在一種端粒酶(telomerase),這種酶能夠?qū)⑺哪はx(chóng)端粒結(jié)構(gòu)中單鏈尾巴5TTGGGG3延長(zhǎng),延長(zhǎng)的部分仍然是5TTGGGG3了。事實(shí)上,各種端粒中這一富含G的序列總是突出12個(gè)16個(gè)核昔酸。后來(lái)又發(fā)現(xiàn)原生動(dòng)物游仆蟲(chóng)euplotes和尖毛蟲(chóng)的端粒酶也能延長(zhǎng)其富含G序列5TTTTGGGG3。這種酶是一種核糖核蛋白,由RNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成。1990年,Blackburn等人又證明了端粒酶中的RNA是富含G序列的模板。例如游仆蟲(chóng)的端粒酶RNA含有5CAAAACCCCAAAACC3這樣的序列,對(duì)于拷貝出富含G序列所必需的部分為5CAAAACCCCAAAA3了。這樣,端粒酶實(shí)際上是一種逆轉(zhuǎn)錄酶,與還原病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的差異只在于這個(gè)模板是在酶分子內(nèi)。端粒酶中的RNA可能還有別的作用。這一富含G的單鏈尾巴的長(zhǎng)度是如何控制的以及這一單鏈尾巴在復(fù)制中的功能都還不清楚。這種單鏈尾巴可能彎轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)作為引物復(fù)制5末端。另一種可能性是某種端粒結(jié)合蛋白有可能像腺病毒pTP那樣結(jié)合于最末端的單鏈重復(fù)序列,并作為蛋白質(zhì)引物復(fù)制DNA的5末端（右圖）。四、真核生物復(fù)制過(guò)程中的核小體結(jié)構(gòu)真核生物細(xì)胞核的體積是很小的,而復(fù)制過(guò)程完全局限于核內(nèi)進(jìn)行,因此DNA必然是處于高度壓縮狀態(tài)下進(jìn)行復(fù)制的。而復(fù)制時(shí)必然涉及到核小體的轉(zhuǎn)移與分配,因?yàn)镈NA是半保留復(fù)制。由于空間狹小,復(fù)制可能是分區(qū)進(jìn)行的,這就是各復(fù)制元族不同步的原因。現(xiàn)在人們已經(jīng)用溴尿嘧啶脫氧核苷酸代替胸腺嘧啶核苷酸滲入到DNA,再用溴尿嘧啶脫氧核苷酸的抗體進(jìn)行免疫雜交而證實(shí)了染色體的分區(qū)復(fù)制。組蛋白八聚體是以全保守的方式傳給子代分子的,這一結(jié)論的實(shí)驗(yàn)過(guò)程是：組蛋白的合成是在細(xì)胞核中與DNA復(fù)制同步進(jìn)行的,因而細(xì)胞并不含有明顯多余的組蛋白分子。其精聯(lián)的機(jī)制目前還不清楚。這個(gè)事實(shí)對(duì)于我們證明組蛋白八聚體的解離與否卻有很大的幫助。老的八聚體是否解離以及如果解離又如何與新合成的組蛋白重組?將細(xì)胞置于輕培養(yǎng)基(12C,14N,lH)中生長(zhǎng)很長(zhǎng)時(shí)間。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到重培養(yǎng)基(14C, 15N,3H)中生長(zhǎng)約1小時(shí),分離組蛋白八聚體,在甲酸飽和的密度梯度中進(jìn)行平衡離心。如果是全保留裝配的話,則得到一個(gè)高密度的放射性帶p如果是隨機(jī)的話,則得到一個(gè)高密度到低密度的彌散的放射性帶;如果是半保留的話,則在中等密度處得一個(gè)單一的放射性帶;結(jié)果表明,組蛋白八聚體的裝配是全保守的。這些老的八聚體和新的八聚體在兩條子代DNA分子上是如何排列的呢?用上述密度梯度平衡離心的辦法分析交聯(lián)的相鄰八聚體(16單體聚合物)同樣可以證明半保留分布是正確的。用蛋白質(zhì)合成的抑制劑放線菌酮(cycloheximide可以得到同樣的結(jié)論。將這種抑制劑加到正在生長(zhǎng)的細(xì)胞中,在此之前開(kāi)始的一輪DNA復(fù)制將繼續(xù)下去。組蛋白是現(xiàn)用現(xiàn)造,在加人蛋白質(zhì)合成的抑制劑后,就沒(méi)有新生的組蛋白八聚體了。這樣在兩個(gè)復(fù)制叉的兩邊,有一個(gè)分校的DNA是裸露的。另一個(gè)分枝繼承