課題2　土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)

課題2土壤中分解尿素的細菌的分離和計數(shù) 專題2微生物的培養(yǎng)和應用 思考1 農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中 尿素被利用的特點 思考2 土壤中的細菌能利用尿素的原因及反應式 思考3 學習本課題要達到哪兩個目的 一 課題背景 1 尿素的利用 2 細菌利用尿素的原因 3 本課題的目的 二 研究思路 思考6 什么是選擇培養(yǎng)基 美國黃石國家公園的一個熱泉 思考6 什么是選擇培養(yǎng)基 從物理性質(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類 在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源 氮源 這種培養(yǎng)基如何對分解尿素的細菌進行選擇 篩選菌株 1 自然界篩選菌株 例子 原因 啟示 2 實驗室篩選菌株 原理 方法 利用選擇培養(yǎng)基分離 選擇培養(yǎng)基的概念 分解尿素的細菌的選擇培養(yǎng)基的分析 A 屬于固體培養(yǎng)基 瓊脂是凝固劑 B 碳源 葡萄糖 唯一氮源 尿素C 培養(yǎng)基名稱 以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基 常見的一些選擇培養(yǎng)基 思考9 常見的微生物生長計數(shù)的方法有哪兩種 常見的測定微生物數(shù)量的方法 顯微鏡直接計數(shù)法 先將待測樣品制成懸液 然后取一定量的懸液放在顯微鏡下進行計數(shù) 根據(jù)在顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來計算出單位體積內(nèi)的微生物總數(shù) 此法計得的是活菌體和死菌體的總和 故又稱為總菌計數(shù)法 顯微鏡直接計數(shù)是測定微生物的方法公式 觀察到的紅細胞平均數(shù) 觀察到的細菌平均數(shù) 紅細胞含量 細菌含量優(yōu)點 設備簡單 能觀察微生物的形態(tài)特征 缺點 難以計數(shù)微小的細菌 此法計得的是活菌體和死菌體的總和 故又稱為總菌計數(shù)法 一般用于純培養(yǎng)懸浮液中各種單細胞菌體的計數(shù) 間接計數(shù)法 最常用稀釋涂布平板計數(shù)法應用 統(tǒng)計樣品中活菌的數(shù)目 原理 當樣品的稀釋度足夠高時 培養(yǎng)基表面生長的一個菌落 來源于樣品稀釋液中的一個活菌 通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù) 就能推測出樣品中大約含有多少活菌 從平板上的菌落數(shù)推測出每克樣品中的菌落數(shù)的計算方法是 平均菌落數(shù) 涂布的稀釋液體積 稀釋倍數(shù) 思考11 完成表格 比較兩種計數(shù)法的異同 思考14 請嘗試歸納總結出兩種計數(shù)法的注意事項 統(tǒng)計菌落數(shù)目 1 方法 2 稀釋涂布平板法 間接計數(shù)法 統(tǒng)計的是活菌數(shù) 原理 計算公式 注意事項 為了使結果接近真實值 要設置重復實驗 求菌落的平均值 至少3個平板 成功的關鍵是恰當?shù)南♂尪?3 顯微鏡直接計數(shù)法 統(tǒng)計的是總菌數(shù) 特點 4 兩種計數(shù)法的比較 顯微鏡 血細胞計數(shù)板 培養(yǎng)基 菌體本身 菌落數(shù) 方便 簡單 計數(shù)的是活菌 死菌 活菌都在內(nèi) 復雜 有誤差 M C V 統(tǒng)計的是活菌體和死菌體的總和 故又稱為總菌計數(shù)法 難以計數(shù)微小的細菌 統(tǒng)計方法類似于 培養(yǎng)液中酵母菌種群數(shù)量的變化 思考15 設置對照組的目的是什么 思考16 分析書上案例 回答相關問題 設置對照的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結果的影響 提高實驗結果的可信度 對照實驗的相關知識 常用設置對照的方法 空白對照 不給對照組任何處理因素 條件對照 給對照組施以部分實驗因素 但不是所要研究的處理因素 自身對照 對照組和實驗組都在同一研究對象上進行 相互對照 不單設對照組 而是幾個實驗組相互對照 對照實驗 是指除了被測試的條件外 其他條件都相同的實驗 實例 在做分解尿素的細菌的篩選與統(tǒng)計菌落數(shù)目的實驗時 A同學從對應的106倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約150個菌落 但是其他同學在同樣的稀釋度下只選擇出大約50個菌落 分析其原因 原因 土樣不同 培養(yǎng)基污染或操作失誤 或者是混入了其他的含氮物質(zhì) 思考16 分析書上案例 回答相關問題 思考 請嘗試分析A同學的實驗結果與其他組不同的原因 思考 請你通過設置對照 幫助A同學排除上述因素的影響 另一種方案 空白對照 將A同學配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進行培養(yǎng) 作為空白對照 以證明培養(yǎng)基是否受到污染 實驗方案有兩種 一種方案 相互對照 可以由其他同學用與A同學一樣的土樣進行實驗 增加實驗組數(shù) 如果結果與A同學一致 則證明A無誤 如果結果不同 則證明A同學存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題 小結 通過這個事例可以看出 實驗結果要有說服力 對照的設置是必不可少的 設置對照 1 目的 2 本實驗的對照組設置 用與A同學相同的土壤進行至少3次的重復實驗 用與A同學相同的培養(yǎng)基不接種作為空白對照進行實驗 思考17 實驗設計的內(nèi)容包括哪些 思考18 結合書上圖2 7 你能說出該實驗的流程嗎 思考19 你能歸納總結出該實驗操作的哪些注意事項 操作流程 二 實驗的具體操作 土壤取樣從肥沃 濕潤的土壤中取樣 先鏟去表層土3cm左右 再取樣 將樣品裝入事先準備好的信封中 取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌 制備培養(yǎng)基 制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基 應在火焰旁稱取土壤10g 在稀釋土壤溶液的過程中 每一步都要在火焰旁進行 分離不同的微生物采用不同的稀釋度原因 不同微生物在土壤中含量不同目的 保證獲得菌落數(shù)在30 300之間 適于計數(shù)的平板 三 樣品的稀釋 為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度 測定土壤中細菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細菌的數(shù)量 選用的稀釋范圍相同嗎 原因 土壤中各類微生物的數(shù)量 單位 株 kg 是不同的 例如在干旱土壤中的上層樣本中 好氧及兼性厭氧細菌數(shù)約為2185萬 放線菌數(shù)約為477萬 霉菌數(shù)約為23 1萬 結論 為獲得不同類型的微生物 就需要按不同的稀釋度進行分離 同時還應當有針對性地提供選擇培養(yǎng)的條件 取樣涂布 實驗時要對培養(yǎng)皿作好標記 注明培養(yǎng)基類型 培養(yǎng)時間 稀釋度 培養(yǎng)物等 如果得到了2個或2個以上菌落數(shù)目在30 300的平板 則說明稀釋操作比較成功 并能夠進行菌落的計數(shù) 如果同一稀釋倍數(shù)的三個重復的菌落數(shù)相差較大 表明試驗不精確 需要重新實驗 微生物的培養(yǎng)與觀察 在菌落計數(shù)時 每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目 選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結果 以防止因培養(yǎng)時間不足而導致遺漏菌落的數(shù)目 培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度 細菌 30 37 培養(yǎng)1 2d放線菌 25 28 培養(yǎng)5 7d霉菌 25 28 的溫度下培養(yǎng)3 4d 計數(shù) 微生物的培養(yǎng)與觀察 菌落的特征 思考17 實驗設計的內(nèi)容包括哪些 思考18 結合書上圖2 7 你能說出該實驗的流程嗎 思考19 你能歸納總結出該實驗操作的哪些注意事項 三 實驗設計 1 實驗設計的內(nèi)容 2 實驗流程 3 具體操作過程 四 操作提示 無菌操作 1 2 3 4 做好標記 制定計劃 注意事項 1 樣品稀釋液的最佳濃度為保證每個平板有30 300個菌落 3 每一個稀釋度至少要涂布3個平板作為重復實驗 5 菌落的特征 4 為了排除培養(yǎng)基本身的影響 應設置相同培養(yǎng)基未接種進行空白對照 自主學習6 閱讀教材P25 26頁剩余內(nèi)容 完成下列思考 思考20 如何判斷有無雜菌污染 思考21 如何判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用 思考