生化測(cè)量系統(tǒng)的校準(zhǔn)-南京.ppt

生化測(cè)量系統(tǒng)的校準(zhǔn) 南通大學(xué)附屬醫(yī)院王惠民 一 與校準(zhǔn)相關(guān)的一些基本問題 校準(zhǔn) Calibration 重要嗎 實(shí)驗(yàn)室中測(cè)量不合格約15 由校準(zhǔn)誤差所致臨床醫(yī)生往往認(rèn)為檢驗(yàn)結(jié)果的 不準(zhǔn) 是由不正確的校準(zhǔn)造成的陳文祥主任認(rèn)為 檢驗(yàn)結(jié)果互認(rèn)的前提是 測(cè)量結(jié)果是否具有可比性 溯源 方法性能評(píng)價(jià) 校準(zhǔn) 可比性的標(biāo)準(zhǔn)參考測(cè)量區(qū)間 一致化問題 校準(zhǔn)受到重視了嗎 一般由組長(zhǎng)進(jìn)行校準(zhǔn)一般無SOP 或SOP不夠詳細(xì)CLSI或去其他的國(guó)際組織尚未有相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)或指南一般的實(shí)驗(yàn)室無校準(zhǔn)的記錄科主任一般不過問校準(zhǔn)的正確與否 校準(zhǔn)什么 測(cè)量?jī)x器 測(cè)量系統(tǒng) 調(diào)標(biāo) 或 定標(biāo) 測(cè)量?jī)x器 單獨(dú)或與輔助設(shè)備組合 用于測(cè)量的裝置 測(cè)量系統(tǒng) 由一臺(tái)或多臺(tái)測(cè)量?jī)x器所組成的用于特定測(cè)量的成套系統(tǒng) 包括試劑和電源等 校準(zhǔn)實(shí)際上就是將測(cè)量系統(tǒng)與 參考系統(tǒng) 進(jìn)行比較 并將測(cè)量系統(tǒng)調(diào)整至參考系統(tǒng)相一致水平的過程 實(shí)際上 有些情況下不需要對(duì)測(cè)量系統(tǒng)進(jìn)行校準(zhǔn)臨床化學(xué)測(cè)量常根據(jù)系數(shù)進(jìn)行計(jì)算例 酶催化活性濃度的測(cè)量 F值又稱為K值 校準(zhǔn)K值與理論K值的比較 DiaSysRandox 為什么用校準(zhǔn)品后得到的K值與理論K值不一致 校準(zhǔn)品是如何定值的 方法不一樣 參考方法 儀器不一樣 最好的儀器 每次定值前都必須對(duì)儀器進(jìn)行校準(zhǔn) 試劑不一樣 最好的試劑 參考方法與常規(guī)方法測(cè)量?jī)x器的差異 二 校準(zhǔn)前的準(zhǔn)備 1 生化分析儀的準(zhǔn)備生化分析儀的校準(zhǔn)或檢定生化分析儀的性能驗(yàn)證2 試劑的準(zhǔn)備試劑是否獲準(zhǔn)入試劑的性能驗(yàn)證3 水的準(zhǔn)備 1 生化分析儀的準(zhǔn)備生化分析儀的校準(zhǔn)或檢定由廠家根據(jù)其標(biāo)準(zhǔn)對(duì)生化分析儀進(jìn)行校準(zhǔn)由有關(guān)計(jì)量部門根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) JJG494 2005 對(duì)儀器進(jìn)行檢定 生化分析儀的性能驗(yàn)證 根據(jù)中華人民共和國(guó)生化分析儀檢定規(guī)程JJG494 2005進(jìn)行 零點(diǎn)漂移波長(zhǎng)準(zhǔn)正確度及重復(fù)性雜散光吸光度正確度吸光度重復(fù)性吸光度線性誤差交叉污染率溫度正確度比色杯間差距 生化分析儀檢定用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 用于吸光度正確度與重復(fù)性檢定的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)雜散光檢定的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)吸光度線性檢定的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)交叉污染檢定的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院 北京市北三環(huán)東路18號(hào) 電話 010 64524710 64278838 零點(diǎn)漂移 開機(jī)30min 用蒸餾水調(diào)吸光度至0 000處 10min內(nèi)吸光度的最大變化值應(yīng)符合下表規(guī)定 復(fù)興儀器的零點(diǎn)飄移 復(fù)興儀器340nm零點(diǎn)漂移 復(fù)興儀器340nm零點(diǎn)漂移 復(fù)興儀器405nm零點(diǎn)漂移 復(fù)興儀器405nm零點(diǎn)漂移 復(fù)興儀器340 405nm零點(diǎn)漂移 復(fù)興儀器340 405nm零點(diǎn)漂移 復(fù)興儀器405 505nm零點(diǎn)漂移 出現(xiàn)零點(diǎn)飄移可能原因 電壓不穩(wěn)光電倍增管或光接收元件老化儀器靈敏度過高儀器設(shè)計(jì)與制造的缺陷 波長(zhǎng)的正確度 波長(zhǎng)正確度的測(cè)定方法根據(jù)分光原理不同而異分光式儀器 光柵由于不需傳動(dòng)調(diào)節(jié)波長(zhǎng) 一般不需校準(zhǔn) 低壓汞燈 氘燈 干涉濾光片鐠釹濾光片 氧化鈥濾光片濾光式儀器將濾光片拆下在已校準(zhǔn)的分光光度計(jì)上進(jìn)行波長(zhǎng)掃描 測(cè)定波長(zhǎng)和半波寬一般儀器不容易拆卸 特征譜線 低壓汞燈 253 7nm氘燈 486nm 656 1nm鐠釹濾光片 529nm 808nm 400nm 900nm內(nèi)至少有10個(gè)吸收峰 氧化鈥濾光片 200 700nm共12條譜線干涉濾光片 長(zhǎng)波通濾光片 200 1100nm 光學(xué)分辨率為1nm短波通濾光片 400 700nm 光學(xué)分辨率為1nm 波長(zhǎng)的重復(fù)性 指多次波長(zhǎng)測(cè)試數(shù)據(jù)的離散性 或者多次波長(zhǎng)測(cè)試數(shù)據(jù)的符合程度 一般取波長(zhǎng)正確度的3次測(cè)試結(jié)果中最大值與最小值之差作為波長(zhǎng)重復(fù)性 波長(zhǎng)正確度及重復(fù)性的要求 nm 雜散光 雜散光與波長(zhǎng)的半波寬有關(guān) 半波寬越大 雜散光越多 測(cè)定50g L亞硝酸鈉 NaNO2 標(biāo)準(zhǔn)溶液相對(duì)于蒸餾水在340nm處的吸光度 了解雜散光的多少 亞硝酸鈉溶液的配制方法將分析純亞硝酸鈉固體試劑放入稱量瓶置于烘箱中 在箱溫為105 5 下烘2h 取出置于干燥器中冷卻至室溫 在分析天平上 精度為0 1mg 精確稱取10g 置于200mL燒杯中 用小半杯蒸餾水溶解后移入200mL容量瓶中 以少量蒸餾水沖洗燒杯三次 均倒入容量瓶中 然后用蒸餾水稀釋至刻度線反復(fù)搖勻 置于陰涼干燥處備用 雜散光 1 在波長(zhǎng)340nm 第一個(gè)試劑位放入蒸餾水 以蒸餾水為樣本 重復(fù)測(cè)定5次吸光度值 第二個(gè)試劑位放入NaNO2溶液 以NaNO2溶液為樣本 重復(fù)測(cè)定5次吸光度值 或?qū)⒄麴s水和NaNO2溶液分別加入同一比色杯讀取吸光度 可消除比色杯誤差 重復(fù)測(cè)定5次 共得5個(gè)蒸餾水和5個(gè)NaNO2溶液的吸光度 2 最小NaNO2溶液吸光度 最大蒸餾水吸光度 2 3 復(fù)興儀器的雜散光測(cè)定 復(fù)興儀器的雜散光測(cè)定 復(fù)興儀器的雜散光測(cè)定 空白 吸光度正確度 指吸光度實(shí)際測(cè)定值與理論值之差 該偏差越小吸光度正確度越高 間接說明波長(zhǎng)的正確度與雜散光的多少 1 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)法2 己糖激酶法 吸光度正確度 1 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)法 使用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心制備的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液 其吸光度分別為0 5和1 0 在340nm波長(zhǎng) 比色杯光徑1cm時(shí) 以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)示的參比液作參比 測(cè)吸光度值 重復(fù)測(cè)量3次 計(jì)算3次測(cè)量值的算術(shù)平均值與標(biāo)準(zhǔn)值之差 0 5的標(biāo)準(zhǔn)液允許誤差為 0 025 1 0的標(biāo)準(zhǔn)液 允許誤差為 0 07 測(cè)定結(jié)果 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的吸光度 A1 1 0 489A1 2 0 980 不確定度 0 005 檢測(cè)結(jié)果 A1 1 0 4916 0 4836 0 4812 均值為0 4855A1 2 0 9703 0 9714 0 9722 均值為0 9713結(jié)果判定 A1 1誤差 0 025 A1 2誤差 0 07 即0 464 A1 1 0 514 0 910 A1 2 1 050 吸光度正確度 2 己糖激酶法用己糖激酶 HK 法測(cè)定葡萄糖濃度時(shí) 反應(yīng)產(chǎn)生NADH 在340nm測(cè)定吸光度 間接測(cè)NADH的 理論值為6220 以此為標(biāo)準(zhǔn)校正 以HK測(cè)葡萄糖為例 試劑反應(yīng)過程如下 HK葡萄糖 ATP 6 P 葡萄糖 ADP G6PDH6 P 葡萄糖 NAD 葡萄糖酸 NADH 影響吸光度準(zhǔn)確度的主要因素 雜散光多波長(zhǎng)不正確標(biāo)準(zhǔn)液不正確儀器的靈敏度或其他原因 吸光度重復(fù)性 1 以重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液為樣本 在波長(zhǎng)340nm 吸光度為0 3 0 5 以蒸餾水為空白 試劑量為全自動(dòng)生化分析儀標(biāo)稱的最小試劑量 測(cè)定時(shí)間為10min 每30秒讀取吸光度 連續(xù)20次 得到20個(gè)吸光度值 計(jì)算CV 應(yīng) 1 0 2 采用吸光度約為0 5生化分析儀用吸光度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 在340nm處連續(xù)測(cè)定5次 然后計(jì)算其中最大值與最小值之差 吸光度的重復(fù)性均應(yīng)不大于0 005 檢測(cè)結(jié)果 A1 1 0 4828 0 4831 0 4836 0 4812 0 4820 4836 0 4812 0 0024 0 005 吸光度線性誤差 分別用濃度為2 0 4 0 6 0 8 0 10 0g L的氯化鈷標(biāo)準(zhǔn)溶液 以蒸餾水為對(duì)照 在510nm 500 520nm 測(cè)定各溶液吸光度 連續(xù)測(cè)量3次 然后將所得數(shù)據(jù)求相關(guān)系數(shù) r 0 995 或按下列公式計(jì)算 線性誤差符合規(guī)定要求 結(jié)論 符合吸光度線性要求 交叉污染率 概念 由測(cè)量系統(tǒng)將一個(gè)檢測(cè)樣品反應(yīng)攜帶到另一個(gè)檢測(cè)樣品反應(yīng)的分析物不連續(xù)量 由此錯(cuò)誤地影響了另一個(gè)檢測(cè)樣品的表現(xiàn)量 1 氯化鈷方法2 桔紅G方法3 臨床標(biāo)本的檢測(cè) 50U L與250U L的AST或ALT測(cè)定 測(cè)定方法 將氯化鈷標(biāo)準(zhǔn)溶液按儀器規(guī)定的最小樣品量 先用質(zhì)量濃度為2 0g L的氯化鈷標(biāo)準(zhǔn)溶液將比色杯沖洗三次 接著對(duì)該溶液連續(xù)測(cè)量四次 按上述方法依次循環(huán)對(duì)2 0和10 0g L氯化鈷標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)測(cè)得七組在510nm處的測(cè)量值 四組低濃度值和三組高濃度值 然后按以下公式將每相鄰兩組值進(jìn)行計(jì)算 得到三個(gè)低濃度到高濃度的計(jì)算值和三個(gè)高濃度到低濃度的計(jì)算值 即為交叉污染率 均應(yīng) 1 5 L1 0 1634 L2 0 1691 L3 0 1639 L4 0 1668H1 0 8316 H2 0 8331 H3 0 8305CoLH 0 8317 0 8316 0 8317 0 1666 100 0 CoHL 0 1634 0 1666 0 8317 0 1666 100 0 4 結(jié)論 交叉污染率符合要求 溫度正確度 用分度值小于0 1 專用測(cè)溫裝置 測(cè)定比色杯的設(shè)定溫度 當(dāng)儀器升到設(shè)定溫度范圍內(nèi) 每隔30s記錄一次溫度 連續(xù)測(cè)10次 計(jì)算平均值 Fluke1521點(diǎn)溫度計(jì) 0 001 C 比色杯間差距 以重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液為樣本 在波長(zhǎng)340nm 吸光度為0 3 0 5 以蒸餾水為空白 每比色杯重復(fù)測(cè)定3次 平均吸光度值應(yīng)小于0 05 Olympus 極差 0 4213 0 3958 0 0255 2 試劑的準(zhǔn)備試劑是否獲準(zhǔn)入是否有SFDA證書試劑的性能驗(yàn)證精密度線性延遲時(shí)間 如果有 空白對(duì)照3 水的準(zhǔn)備 用一級(jí)水 三 校準(zhǔn)過程中需注意的問題校準(zhǔn)品 是否可溯源 配套 互換性 處理 低溫冷凍 凍干品 復(fù)溶條件 瓶間差問題 測(cè)幾個(gè)水平校準(zhǔn)品 不同水平校準(zhǔn)品K值是否一致 校準(zhǔn)品測(cè)量次數(shù) 對(duì)校準(zhǔn)K值的影響 取平均K值 空白測(cè)量 對(duì)校準(zhǔn)K值的影響 校準(zhǔn)周期 對(duì)校準(zhǔn)K值的影響 校準(zhǔn)的核查 是否有核查程序 英國(guó)RANDOX公司 人基質(zhì)復(fù)合校準(zhǔn)血清 以人血清為基質(zhì)根據(jù)德國(guó)臨床化學(xué)協(xié)會(huì)的規(guī)定賦值由全球3000多家參考實(shí)驗(yàn)室賦值 每種儀器至少由10家實(shí)驗(yàn)室賦值復(fù)溶條件 20 25 30分鐘對(duì)CO2 ACP與ALP有特殊要求未提供不確定度所有測(cè)量系統(tǒng)的值均一樣 德國(guó)DiaSys公司 人基質(zhì)復(fù)合校準(zhǔn)血清 TruLabN TruLabP和TruCalU以人血清為基質(zhì)根據(jù)德國(guó)臨床化學(xué)協(xié)會(huì)的規(guī)定賦值復(fù)溶條件 25 30分鐘 ALP2小時(shí) 美國(guó)Roche公司C f a s Calibratorforautomatedsystems 適用于Roche系統(tǒng)的Roche方法在人基質(zhì)血清中加入了人及各種動(dòng)物來源的組份加入穩(wěn)定劑在Roche規(guī)定的嚴(yán)格的條件下 由Roche的主校準(zhǔn)品賦值復(fù)溶條件 20 25 30分鐘 美國(guó)Beckman公司 SynchonMultiCalibrator 適用于Synchon試劑加入穩(wěn)定劑溯源至NIST液態(tài) 不需復(fù)溶 美國(guó)Bio Rad公司控制品以人血清基質(zhì)可任選液體 干粉 定值 不定值產(chǎn)品液體不含甘油和乙二醇提供任何儀器 試劑的定值多個(gè)品種 包裝 濃度可供選擇美國(guó)FDA認(rèn)證 某國(guó)產(chǎn)檢測(cè)系統(tǒng) X 分別與羅氏C fas校準(zhǔn)品 Y1 與朗道Level2校準(zhǔn)品 Y2 與朗道Level3校準(zhǔn)品 Y3 比較 三 校準(zhǔn)過程中需注意的問題校準(zhǔn)品 是否可溯源 配套 互換性 處理 低溫冷凍 凍干品 復(fù)溶條件 瓶間差問題 加溶劑的準(zhǔn)確性 測(cè)幾個(gè)水平校準(zhǔn)品 不同水平校準(zhǔn)品K值是否一致 校準(zhǔn)品測(cè)量次數(shù) 對(duì)校準(zhǔn)K值的影響 取平均K值 空白測(cè)量 對(duì)校準(zhǔn)K值的影響 校準(zhǔn)周期 對(duì)校準(zhǔn)K值的影響 校準(zhǔn)的核查 是否有核查程序 室溫復(fù)溶條件下校準(zhǔn)CK 標(biāo)準(zhǔn)化復(fù)溶條件下校準(zhǔn)CK 置于18 20 水溫下復(fù)溶30 5min 校準(zhǔn)品處理的注意點(diǎn) 必須將復(fù)溶條件標(biāo)準(zhǔn)化 雖不會(huì)對(duì)所有被測(cè)物產(chǎn)生影響 但對(duì)CK 脂蛋白會(huì)產(chǎn)生較大影響 應(yīng)有嚴(yán)格SOP 加樣的重復(fù)性 0 4 是否有瓶間差 值得研究 0 5 注意排除離群值 嚴(yán)格控制校準(zhǔn)條件 將K值CV控制在1 內(nèi) 制定校準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn) 標(biāo)準(zhǔn)化復(fù)溶條件下校準(zhǔn)LDH 差 6 三 校準(zhǔn)過程中需注意的問題校準(zhǔn)品 是否可溯源 配套 互換性 處理 低溫冷凍 凍干品 復(fù)溶條件 瓶間差問題 測(cè)幾個(gè)水平校準(zhǔn)品 不同水平校準(zhǔn)品K值是否一致 校準(zhǔn)品測(cè)量次數(shù) 對(duì)校準(zhǔn)K值的影響 取平均K值 空白測(cè)量 對(duì)校準(zhǔn)K值的影響 校準(zhǔn)周期 對(duì)校準(zhǔn)K值的影響 校準(zhǔn)的核查 是否有核查程序 在ISO11095 1996 基于標(biāo)準(zhǔn)樣品的線性校準(zhǔn) GB T22554 2010 中確定 對(duì)于基本校準(zhǔn)方法的最少校準(zhǔn)點(diǎn) 水平是3個(gè) EURACHEM 分析方法的目標(biāo)適用性 指南規(guī)定 對(duì)于校準(zhǔn) 包括空白至少6個(gè)濃度水平 CommissionDecision2002 657 EC規(guī)定 建立一個(gè)校準(zhǔn)曲線 包括零濃度至少需要5個(gè)濃度水平 ISO11095 1996認(rèn)為校準(zhǔn)系統(tǒng)的有效性檢查 至少有2個(gè) 最好是3個(gè)校準(zhǔn)水平通過控制圖監(jiān)控校準(zhǔn)的有效性 三 校準(zhǔn)過程中需注意的問題校準(zhǔn)品 是否可溯源 配套 互換性 處理 低溫冷凍 凍干品 復(fù)溶條件 瓶間差問題 測(cè)幾個(gè)水平校準(zhǔn)品 不同水平校準(zhǔn)品K值是否一致 校準(zhǔn)品測(cè)量次數(shù) 對(duì)校準(zhǔn)K值的影響 取平均K值 空白測(cè)量 對(duì)校準(zhǔn)K值的影響 校準(zhǔn)周期 對(duì)校準(zhǔn)K值的影響 校準(zhǔn)的核查 是否有核查程序 標(biāo)準(zhǔn)化復(fù)溶條件下校準(zhǔn)LDH 差 6 ISO11095 1996要求每個(gè)校準(zhǔn)水平至少重復(fù)2次 并建議盡可能多次 和校準(zhǔn)水平的數(shù)量一樣 隨著重復(fù)分析次數(shù)的增加 收益可能遞減 因此 每個(gè)校準(zhǔn)水平重復(fù)分析超過5次不能提供大的額外好處 三 校準(zhǔn)過程中需注意的問題校準(zhǔn)品 是否可溯源 配套 互換性 處理 低溫冷凍 凍干品 復(fù)溶條件 瓶間差問題 測(cè)幾個(gè)水平校準(zhǔn)品 不同水平校準(zhǔn)品K值是否一致 校準(zhǔn)品測(cè)量次數(shù) 對(duì)校準(zhǔn)K值的影響 取平均K值 空白測(cè)量 對(duì)校準(zhǔn)K值的影響 校準(zhǔn)周期 對(duì)校準(zhǔn)K值的影響 校準(zhǔn)的核查 是否有核查程序 三 校準(zhǔn)過