nanos2綜述.doc

小鼠nanos2Nanos2基因的研究進展摘要：Nanos是最先被鑒定的一個母源效應基因，后來在其他生物中都發(fā)現(xiàn)有其同源物存在，主要作用是促進性腺的發(fā)育。不同物種或同一物種不同的nanos同源物的功能和作用機制都不盡相同。在小鼠中nanos有三個同源物nanos1，2，3.Nanos1在性腺和腦組織中都有表達，nanos2和Nanos3具有生殖特異性，只在性腺中表達，尤其是nanos2，在生殖細胞發(fā)育過程中不可或缺。Nanos2不僅維持PGC和SSC的自我更新，而且是一種啟動雄性分化程序的內(nèi)源性因子，在胚胎發(fā)育時期只表達于雄性生殖細胞中。了解nanos2的功能和作用機理有助于讓我們對胚胎發(fā)育過程和性別決定調(diào)控有更清楚的認識。關(guān)鍵詞：nanos2 精源干細胞 性別決定 自我更新Nanos基因最早由 在果蠅中發(fā)現(xiàn)，它編碼一種RNA結(jié)合蛋白，這種蛋白與pumilioRNA結(jié)合蛋白相互作用形成一種核糖核蛋白復合物一起抑制母源mRNA hunchback的翻譯，從而調(diào)控果蠅胚胎后腹部細胞的分化。進一步研究發(fā)現(xiàn)進一步研究表明nanos對果蠅生殖細胞的發(fā)育是必須的，Nanos基因的缺失將使果蠅不能形成性腺，產(chǎn)生異常生殖細胞。隨后，科學家在線蟲，、蜜蜂，、家蠶等物種中也相繼發(fā)現(xiàn)nanos同源物，它們的功能也都和個體發(fā)育或生殖細胞的發(fā)育分化有關(guān)。小鼠中含有三個nanos的同源物，分別命名為Nanos1，2，3.。其中 小鼠中，Nanos1在小鼠胚胎，、成體睪丸，成體和腦組織中都有表達。Nanos1基因敲除的小鼠并沒有發(fā)現(xiàn)性腺的異常，說明Nanos1對小鼠性腺的發(fā)育不是必須的或其功能是其功能可以被其他基因代替。Nanos2和nanos3都是生殖細胞特異性的，其基因敲除的小鼠都不能形成正常的性腺，成體中nanos2Nanos2或Nanos3的缺失將導致生殖細胞的丟失。Nanos3在胚胎期兩性中都有表達而nanos2Nanos2只在雄性中表達，所以因此，nanos2Nanos2是一個嚴格的雄性生殖特異性基因?，F(xiàn)本文就對nanos2Nanos2的結(jié)構(gòu)，, 功能以及分子機制等方面做一番綜簡述。一Nanos2的結(jié)構(gòu)Nanos基因在不同物種中差異較大，介于幾十到上千bp不等。Nanos2基因全長1439，只含有一個外顯子，無內(nèi)含子，編碼區(qū)長為410 bp，在靠近C端的序列編碼了兩個特異鋅指結(jié)構(gòu)域CCHC（Cys-Cys-His-Cys），這兩個特異鋅指結(jié)構(gòu)域在目前發(fā)現(xiàn)的所有物種的nanosNanos基因中都是高度保守的。同時敲除這兩個鋅指結(jié)構(gòu)域?qū)⑹筺anosNanos基因功能喪失。Nanos2的非編碼區(qū)3UTR部分長為900 bp, Yaga等（ ）通過基因敲除比較含有和不含nanos2 3UTR部分的小鼠，發(fā)現(xiàn)不含3UTR部分的小鼠曲細精管中生殖細胞的數(shù)量明顯少于含有3UTR部分的小鼠，這表明在沒有3UTR部分的情況下肯定有一部分生殖細胞丟失了部分的情況下肯定有一部分生殖細胞凋亡了，。我們可以據(jù)此可以推斷nanos2Nanos2表達水平對正常精子的發(fā)生是必須的，而nanos2Nanos2的3UTR部分對這個過程起著調(diào)控作用。另外，在基因敲除的小鼠中導入含有報告基因Lacz和nanos2含有3UTR部分的載體，檢測到Lacz在兩性細胞中都有表達，但nanos2Nanos2只在雄性細胞中表達，暗示3UTR部分在雄性中上調(diào)nanos2Nanos2的表達水平，在雌性中下調(diào)nanos2的表達水平，推測3UTR部分可能存在不同的增強子結(jié)合區(qū)。前面說到的那部分丟失的細胞可能是因為nanos2Nanos2表達缺失導致的細胞凋亡，也可能是nanos2表達水平下調(diào)導致的生殖母細胞的分化大于增殖，后續(xù)的實驗表明了后者的正確性。二 nanos2Nanos2的功能2.1 nanos2在胚胎時期通過啟動雄性發(fā)育程序。 在胚胎發(fā)育早期原始生殖細胞PGC并非產(chǎn)生在真正的性腺位置產(chǎn)生，所以PGC在形成后會在微環(huán)境的影響下穿過體細胞進入生殖嵴，即將來發(fā)育成性腺的地方。在PGC遷移的過程中這些生殖細胞的性別還沒有被確定，它們具有向兩性分化的潛能。大多數(shù)人認為生殖細胞周圍的體細胞對生殖細胞起著性別決定的作用，而nanos2是一個被發(fā)現(xiàn)的起性別決定作用的生殖細胞內(nèi)源性基因的因子。PGC生殖細胞定植置于生殖嵴后開始性別分化，大約在E10.5天，此后，雌性生殖細胞進入減數(shù)分裂并停留在減數(shù)分裂一期雌性生殖細胞進入減數(shù)分裂并停留在減數(shù)分裂前期，而雄性生殖細胞開始增殖或停留在G1G0期并伴隨基因甲基化和印跡基因表達等。Nanos2在13.5天開始表達，15.5天達到高峰之后迅速下降到消失天達到高峰之后迅速下降直至消失。敲除nanos2基因的小鼠不能產(chǎn)生完整的性腺，生殖細胞不斷丟失，說明nanos2對生殖細胞的發(fā)育是必須的。通過基因芯片技術(shù)檢測，nanos2基因敲除的生殖細胞中許多和減數(shù)分裂有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，而雄性特異性基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)。暗示nanos2可能是通過抑制雌性化而啟動雄性分化程序。另一個實驗，如果將nanos2在胚胎階段一直超表達在胚胎期一直超表達，結(jié)果超表達的雌鼠在E13.5天生殖細胞的減數(shù)分裂被抑制，并且趨向雄性化發(fā)育，例如雄性生殖細胞特異性基因Dnmt3l,、TdrdI等表達水平上調(diào)。，此這個實驗進一步證明了研究進一步證明了nanos2可能通過抑制雌性化而促進雄性生殖細胞發(fā)育。上述結(jié)論。2.2 nanos2在小鼠出生后維持出生后小鼠精原干細胞的數(shù)量和的自我更新。 在小鼠出生后，nanos2又開始表達，但僅存在于一小部分生殖細胞中。由于傳統(tǒng)的基因敲除會使小鼠在胚胎期由于缺少nanos2使生殖細胞凋亡，所以為研究nanos2在小鼠出生后的功能Saga等人采用條件性敲除的方法，使nanos2的缺失時始于出生后。研究發(fā)現(xiàn)，nanos2基因缺失后，新生鼠的生殖細胞數(shù)量會隨年齡的增長而不斷減少。這可能是細胞凋亡的結(jié)果，也可能是生殖細胞的來源精原干細胞數(shù)量的不斷減少。可是，檢測多聚二磷酸核糖聚合酶的相對含量，發(fā)現(xiàn)在對照組和nanos2缺失實驗組睪丸中并沒有明顯的不同，提示我們生殖細胞在Nanos2缺失的情況下不斷減少不是生殖細胞加速凋亡的結(jié)果。那么也就是第二種可能，也就是說nanos2對精原干細胞的自我更新維持是必須的，沒有了nanos2，精原干細胞都走向了分化，生殖細胞沒有了持續(xù)的細胞來源而導致生殖細胞數(shù)量不斷減少。為了驗證這個結(jié)論，研究人員將CAG-floxed-CAT-3Flag-Nanos2轉(zhuǎn)基因小鼠與Nanos3-Cre 小鼠雜交，得到從胚胎早期就開始表達nanos2的子代雄性小鼠。這種Nanos2超表達小鼠是不育的，睪丸重量輕，曲細精管多數(shù)細胞都在基底膜上，也就是精原干細胞所在位置。對特異基因進行分析，減數(shù)分裂晚期的基因Scp3表達量減少，C-kit也減少，未分化精原細胞標記基因Plzf表達增強。這些生殖細胞的增殖能力低，凋亡水平正常。這些結(jié)果表明nanos2超表達使精原細胞積累，抑制分化而不是抑制生殖細胞凋亡。三 nanos2分子機制 在果蠅中Nanos蛋白與RNA結(jié)合蛋白pumilio形成一種核糖核蛋白復合物一起抑制母源mRNA hunback 的翻譯，從而啟動胚胎后腹部細胞的特異性分化過程。 在人中同樣發(fā)現(xiàn)nanos蛋白與pumilio的同源物Pumilio2的相互作用。但在小鼠中并沒有發(fā)現(xiàn)nanos2與Pumilio同源物的結(jié)合現(xiàn)象。說明Nanos2有另外的分子機制，Nanos基因在不同物種中作用機制不盡相同。3.1 nanos2定位應用免疫共沉淀和Western手段，分析到nanos2在E13.5天開始表達，并在表達水平增強的過程中形成聚點，果蠅中Vasa和Tudor會形成細胞質(zhì)聚點，但經(jīng)檢測這些在小鼠中的同源物并非和nanos2聚點在一起。用雙重免疫沉淀反應發(fā)現(xiàn)nanos2聚點與P小體復合物組分DCP2和XRN1結(jié)合。在E13.5天P小體只存在于生殖細胞中，不存在于成體細胞中，之后在雌性生殖細胞中逐漸減小，E14.5天消失，在雄性生殖細胞中則逐漸增大伴隨nanos2的表達。這表明Nanos2即定位于P小體。P小體是一個RNA降解中心，含有多種RNA降解酶，其中DCP2是一種RNA去頭酶，XRN1是一種核酸外切酶。所以nanos2很可能與RNA降解有關(guān)。3.2 nanos2相互作用的蛋白復合物CCR4-NOT免疫共沉淀進一步去研究nanos2相互作用蛋白，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)CNT1，CNT3等一些屬于CCR4-NOT脫腺苷復合物元件蛋白都與nanos2相結(jié)合。而且在體外CCR4-NOT脫腺苷復合物與nanos2蛋白的結(jié)合物具有脫去RNA的polyA的活性。雖然與nanos2相結(jié)合去識別結(jié)合目的RNA的蛋白沒有找到，但我們可以推測出一種模式，就是nanos2與某個蛋白相結(jié)合去識別目的RNA，然后這個蛋白RNA復合物在與CCR4-NOT脫腺苷復合物結(jié)合托運到P小體并在此過程中將目的RNA的polyA尾裂解掉，托運到P小體后，目的RNA被進一步降解。3.3 nanos2結(jié)合的目的RNA對nanos2的免疫沉淀物純化后進行RT-PCR，結(jié)果顯示，Sycp3，Stra8，Dazl等只有在減數(shù)分裂中高水平表達的RNA在nanos2蛋白沉淀物種被特異性的檢測到了，而G3pdh，Dumt3l和Dnmt3a等在雄性生殖細胞中高度表達的mRNA在nanos2的沉淀物中并沒有特異性的。這可能是因為nanos2的目的RNA和減數(shù)分裂有關(guān)。Nanos2蛋白復合物通過托運降解與減數(shù)分裂有關(guān)的目的RNA而抑制生殖細胞雌性化，啟動雄性分化程序。四討論四 小 結(jié)Nanos2是生殖細胞發(fā)育過程中的一個關(guān)鍵因子，它不僅在胚胎期PGC定植后通過抑制雌性分化程序，而且在出生后性腺中僅存在于精原干細胞中，維持著精原干細胞的自我