小鼠肝細胞線粒體的染色觀察.docx

實驗四. 小鼠肝臟細胞線粒體的染色觀察 山東大學實驗報告 2013 年4 月14 姓名 系年級 2011級生命基地 同組者 科目 細胞生物學實驗 題目 小鼠肝細胞線粒體的染色觀察 學號 實驗四.小鼠肝細胞線粒體的染色觀察Lab4. Staining and observation of mitochondriain mouse liver cells摘要：線粒體是細胞的“動力工廠”，對生物體的能量代謝活動起著至關重要的作用，線粒體在代謝活動旺盛的細胞中大量存在，如肌肉細胞、肝細胞、神經細胞等。對此類細胞進行活體染色，對研究線粒體的性質、活動有著重要意義。此次我們采用小鼠的肝臟細胞，對其進行活體染色，在顯微鏡下觀察線粒體。關鍵詞：線粒體、活體染色、小鼠肝臟細胞前言：活體染色是指對生活有機體的細胞或組織能著色但又無毒害的一種染色方法。它的目的是顯示生活細胞內的某些結構，而不影響細胞的生命活動和產生任何物理、化學變化以致引起細胞的死亡?；钊炯夹g可用來研究生活狀態(tài)下的細胞形態(tài)結構和生理、病理狀態(tài)。根據(jù)所用染色劑的性質和染色方法的不同，通常把活體染色分為體內活染與體外活染兩類，體內活染是以膠體狀的染料溶液注入動、植物體內，染料的膠粒固定、堆積在細胞內某些特殊結構里，達到易于識別的目的。體外活染又稱超活染色，它是由活的動、植物分離出部分細胞或組織小塊，以染料溶液浸染，染料被選擇固定在活細胞的某種結構上而顯色?；铙w染料之所以能固定、堆積在細胞內某些特殊的部分，主要是染料的“電化學“特性起重要作用。堿性染料的膠粒表面帶陽離子，酸性染料的膠粒表面帶有陰離子，而被染的部分本身也是具有陰離子或陽離子，這樣，它們彼此之間就發(fā)生了吸引作用。但不是任何染料皆可以作為活體染色劑之用，應選擇那些對細胞無毒性或毒性極小的染料，而且總是要配成稀淡的溶液來使用；一般是以堿性染料最為適用，可能因為它具有溶解在類脂質(如卵磷脂、膽固醇等)的特性，易于被細胞吸收。詹納斯綠B(JanusgreenB)和中性紅(neutralred)兩種堿性染料是活體染色劑中最重要的染料，對于線粒體和液泡系的染色各有專一性。線粒體的直徑一般為0.5-1.0m，長1.5-3.0m，在光學顯微鏡下可見。在動物細胞中，線粒體大小受細胞代謝水平限制。不同組織在不同條件下可能產生體積異常膨大的線粒體，稱為“巨線粒體”（megamitochondria）：胰臟外分泌細胞中可長達10-20m；神經元胞體中的線粒體尺寸差異很大，有的也可能長達10m；人類成纖維細胞的線粒體則更長，可達40m。有研究表明在低氧氣分壓的環(huán)境中，某些如煙草的植物的線粒體能可逆地變?yōu)榫蘧€粒體，長度可達80m，并形成網(wǎng)絡。線粒體一般呈短棒狀或圓球狀，但因生物種類和生理狀態(tài)而異，還可呈環(huán)狀、線狀、啞鈴狀、分杈狀、扁盤狀或其它形狀。成型蛋白（shape-forming protein）介導線粒體以不同方式與周圍的細胞骨架接觸或在線粒體的兩層膜間形成不同的連接可能是線粒體在不同細胞中呈現(xiàn)出不同形態(tài)的原因。不同生物的不同組織中線粒體數(shù)量的差異是巨大的。有許多細胞只擁有多達數(shù)千個的線粒體（如肝臟細胞中有1000-2000個線粒體），而一些細胞則只有一個線粒體（如酵母菌細胞的大型分支線粒體）。大多數(shù)哺乳動物的成熟紅細胞不具有線粒體。一般來說，細胞中線粒體數(shù)量取決于該細胞的代謝水平，代謝活動越旺盛的細胞線粒體越多。線粒體分布方向與微管一致，通常分布在細胞功能旺盛的區(qū)域：如在腎臟細胞中靠近微血管，呈平行或柵狀排列；在腸表皮細胞中呈兩極分布，集中在頂端和基部；在精子中分布在鞭毛中區(qū)。在卵母細胞體外培養(yǎng)中，隨著細胞逐漸成熟，線粒體會由在細胞周邊分布發(fā)展成均勻分布。線粒體在細胞質中能以微管為導軌、由馬達蛋白提供動力向功能旺盛的區(qū)域遷移。線粒體的化學組分主要包括水、蛋白質和脂質，此外還含有少量的輔酶等小分子及核酸。蛋白質占線粒體干重的65-70%。線粒體中的蛋白質既有可溶的也有不溶的?？扇艿牡鞍踪|主要是位于線粒體基質的酶和膜的外周蛋白；不溶的蛋白質構成膜的本體，其中一部分是鑲嵌蛋白，也有一些是酶。線粒體中脂類主要分布在兩層膜中，占干重的20-30%。在線粒體中的磷脂占總脂質的3/4以上。同種生物不同組織線粒體膜中磷脂的量相對穩(wěn)定。含豐富的心磷脂和較少的膽固醇是線粒體在組成上與細胞其他膜結構的明顯差別。線粒體由外至內可劃分為線粒體外膜（OMM）、線粒體膜間隙、線粒體內膜（IMM）和線粒體基質四個功能區(qū)。處于線粒體外側的膜彼此平行，都是典型的單位膜。其中，線粒體外膜較光滑，起細胞器界膜的作用；線粒體內膜則向內皺褶形成線粒體嵴，負擔更多的生化反應。這兩層膜將線粒體分出兩個區(qū)室，位于兩層線粒體膜之間的是線粒體膜間隙，被線粒體內膜包裹的是線粒體基質。線粒體是細胞內氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷（ATP）的主要場所，為細胞的活動提供了能量，所以有“細胞動力工廠”之稱。除了為細胞供能外，線粒體還參與諸如細胞分化、細胞信息傳遞和細胞凋亡等過程，并擁有調控細胞生長和細胞周期的能力。肝臟具有強大的代償功能和旺盛的再生能力。肝臟一旦受到損害，肝臟內蛋白質和核酸的合成就顯著增加以促進其再生修復。肝臟代謝活動的增強必然消耗大量的ATP，如果機體產生ATP不足,肝臟的再生修復則難以進行。因此，肝臟損害時再生修復能力的大小，即肝臟代償功能的強弱，首先取決于肝臟能量代謝的正常與否。細胞內ATP幾乎均在線粒體內產生。因此，肝臟線粒體代償功能的大小乃是能量代謝的本質。也因此肝臟細胞中含有豐富的線粒體。下圖為小鼠內部解剖圖，可見小鼠肝臟的位置。實驗試劑及器材：試劑： l 小鼠 l Ringer緩沖液 l 詹納斯綠 儀器、工具： l 解剖盤剪子鑷子光學顯微鏡，載玻片，蓋玻片實驗操作：用斷頸法處死小鼠。 打開腹腔，在橫膈膜下方，胃的前方找到深紅色的肝臟。 取出肝臟，在薄邊緣處，剪取兩塊組織，長5mm，寬 2-3mm。 在燒杯中用 Ringer緩沖液盡量洗去血液。將兩片組織分別放在雙凹片的凹陷處，加詹納斯綠，一片完全浸沒，一片只浸沒一半。染色20-30 分鐘，直至浸沒一半的樣品的邊緣變成藍綠色。 將樣品轉到小燒杯中，用 Ringer緩沖液洗去染液。 在1ml Ringer緩沖液中，用剪刀將樣品剪碎，釋放肝細胞。 取上述肝細胞懸液，制作滴片，顯微鏡下觀察。 實驗結果：實驗照片：實驗結果描述：（1）在打開小鼠腹腔后，可找到呈淡紅褐色的肝臟，其邊緣很薄，呈小三角形狀；在取下肝臟的操作中，發(fā)現(xiàn)其比較柔軟，易被鑷子的尖端挑破。所以剪的時候要注意，既要是所得的組織塊體積較小，又不要讓其破碎。（2）在將肝細胞進行染色的過程中，0-10min時，染色液半浸和全浸的細胞邊緣均未著色；在17min左右，半浸的肝細胞邊緣的部分位置出現(xiàn)藍綠色，而全浸的細胞邊緣仍未著色；在25min左右，半浸肝細胞邊緣全部變?yōu)樗{綠色，而全浸細胞邊緣依舊未著色。（3）由上面鏡檢圖像可以觀察到，在半浸染肝臟細胞的染色中，可以觀察到內部出現(xiàn)綠色的圓形肝臟細胞，胞內綠色較淺，但是綠色的分布面積較大；該類富含線粒體的肝細胞在肝臟中分布比例比較高。而在全浸染肝臟細胞的染色中，可以看到，相對應的圓形細胞中，無綠色出現(xiàn)，看上去胞內為無色透明的膠質狀態(tài)。（4）在懸液中加入染液進行直接觀察的一組鏡檢圖像，在染液加入半浸肝臟細胞懸液中，可以看到內部染成較深地藍綠色的圓形肝臟細胞，并且可以更清晰地觀察到該類細胞在鏡下分布廣泛，含量較多，染色效果 較好；在染液加入全浸肝臟細胞懸液中，在鏡下看到相對應的圓形細胞中有藍綠色出現(xiàn)，但顏色較淺，胞內仍為無色透明狀態(tài)。（5）在鏡檢時可以發(fā)現(xiàn)，肝臟中細胞和物質的種類多樣，除上述富含線粒體的獨立存在的較大圓形細胞外，還分布有呈小顆粒狀的圓形細胞、極少量呈條帶狀的桿狀細胞以及聚集在一起，呈現(xiàn)藍綠色的圓形細胞群等；并且在肝臟中還可以發(fā)現(xiàn)，邊緣呈刺突狀的不規(guī)則糖原物質。分析與討論：（1） 犧牲小鼠的時候，手法總結為“穩(wěn)、準、狠”；首先是要抓穩(wěn)小鼠的尾巴，必要時可以將小鼠的尾巴在手指上繞一圈；二是要找準脫臼的位置，在雙耳和前肢之間，不能太靠前，小鼠會向后縮，太往后的化，脊椎不易斷，不方便向下用力；用剪刀向下按的時候。要快速，不能猶豫，同時要快速將小鼠的尾巴向后拉，這樣就可以快速的犧牲小鼠，也避免了小鼠處死時的痛苦。用剪刀時，要注意剪刀的拿捏方式，正確的拿捏方式可以使處死小鼠的過程更為方便。（2） 打開小鼠腹腔的時候，開口在橫膈膜下方，比上次實驗的開口要往上一些，但要注意不能剪到胸腔處。 （3） 打開腹腔后，可以看到肝臟位于左手邊，呈紅色，但顏色有一些偏淡，不要與右手邊血紅色的脾臟混淆，切下小鼠的肝臟，備用，剪的時候要注意避開各種血管，防止出血量過多凝結。（4） 從小鼠肝臟上取組織塊的時候，要選取薄邊的一端，從此處取2小塊，這一部分血少，易取（另一端太厚，不易取也不易染色，而且剪的時候出血量比較多）。（5） 剪下來的組織塊要立即放到Ringer緩沖液中去洗去其上的血液，因為如果組織塊長時間暴露在空氣中的話，其上的血液會凝固，使得染色操作變得困難，洗的時候用鑷子輕輕的夾住涮洗，這樣可使血液快速的被洗脫，但不要太用力，這樣會將組織塊弄碎。（6） 染色時染液從組織塊邊緣處滴加，使染液慢慢浸過組織塊或浸到一半，不能從組織塊上方滴加，這樣半浸的一組上半部分也會接觸到染液，影響實驗效果。（7） 由于染色不是很容易，所以可以適當?shù)难娱L染色的時間，不要只局限于實驗步驟中的30分鐘。（8） 將組織塊剪碎時，要注意拿剪刀的方式，學會靈活運用各種工具；剪的時候要將其盡量剪碎，使小燒杯中的液體成懸濁液的狀態(tài)。（9） 鏡檢時要注意區(qū)分線粒體與糖原細胞的區(qū)別，同時還要判斷線粒體染得是藍色還是綠色，注意對比。而且制作裝片時，所滴加的懸液不要過多，液體過多會導致細胞在顯微鏡下快速流動，給觀察增加了不小的難度，很難找到合適的線粒體進行觀察和拍照