（課件）免疫自動(dòng)化儀器分析

免疫自動(dòng)化儀器分析 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系劉利東 概論 早期免疫分析通過觀察沉淀物形成 凝集及溶血現(xiàn)象發(fā)生來分析 如免疫擴(kuò)散 免疫電泳 血凝試驗(yàn) 補(bǔ)體結(jié)合等上世紀(jì)50年代末60年代初 利用AG AB復(fù)合物形成使?jié)岫雀淖?再用比濁計(jì)來比濁 但因其敏感性差未被接受70年代初 開始有自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng) 但因其用的是激光為光源 固定波長(zhǎng) 靈敏度較低 而且時(shí)間一般要2 3小時(shí) 概論 70年代未 速率比濁計(jì)的出現(xiàn) 使抗原抗體結(jié)合的反應(yīng)在幾十秒內(nèi)出結(jié)果 可以說是免疫化學(xué)測(cè)定的革命的發(fā)展隨著標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展 免疫化學(xué)可以納入臨床化學(xué)檢驗(yàn)范疇如今 自動(dòng)化免疫分析系統(tǒng)更加飛速發(fā)展自動(dòng)化免疫分析的基礎(chǔ)是抗原抗體的結(jié)合 具有高特異性 手段多是利用標(biāo)記技術(shù)而將檢測(cè)信號(hào)放大 具有高靈敏度 自動(dòng)化免疫儀器種類 應(yīng)用技術(shù) 免疫比濁分析技術(shù)化學(xué)發(fā)光 電發(fā)光分析技術(shù)熒光免疫分析技術(shù)放射免疫分析技術(shù)酶免疫分析技術(shù)流式細(xì)胞術(shù) 免疫比濁 利用抗原抗體結(jié)合后溶液的濁度變化而檢測(cè)的一種方法此法準(zhǔn)確快速 已成為免疫診斷技術(shù)中重要的檢測(cè)手段比濁法與比色法 散射免疫比濁分析法 基本原理 抗原抗體復(fù)合物對(duì)一定波長(zhǎng)的光產(chǎn)生折射 偏轉(zhuǎn) 偏轉(zhuǎn)角度及散射光強(qiáng)度與復(fù)合物粒子的大小和量有關(guān) 圖 Rayleigh散射 圖 Mile散射Heidelberger曲線 定時(shí)散射比濁分析 基本原理 免疫沉淀反應(yīng)和散射比濁分析結(jié)合之技術(shù) 反應(yīng)分兩個(gè)階段 預(yù)反應(yīng)階段和反應(yīng)階段 圖 保證抗原不過量的方法 確保反應(yīng)體系抗體過量對(duì)抗原過量進(jìn)行閾值限定 預(yù)反應(yīng)階段5ul樣本 抗原過剩區(qū) 閾值 信號(hào) 反應(yīng)階段45ul樣本 7 5秒 2分鐘 6分鐘 2 4分鐘 定時(shí)散射比濁反應(yīng)曲線圖 抗原不過量抗原過量 速率散射比濁分析 基本原理 抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的一種動(dòng)態(tài)測(cè)定法 適時(shí)檢測(cè)抗原抗體復(fù)合物形成的散射光信號(hào)最快反應(yīng)時(shí)間 圖 抗原過量檢測(cè) 圖 抗原濃度遞增 散射光峰值 峰值信號(hào)與抗原抗體反應(yīng)之間的關(guān)系圖 A B C D F G H I 反應(yīng)時(shí)間 秒 0 60 85 散射率 抗體過量 抗原過量 第二峰值信號(hào) 抗原量檢測(cè)速率峰值信號(hào)產(chǎn)生 免疫透射比濁 基本原理 檢測(cè)信號(hào)是通過溶液的光 測(cè)量角度與正前方夾角為0 圖 保持抗體過量 形成可溶性AG AB復(fù)合物 使介質(zhì)濁度發(fā)生改變 實(shí)驗(yàn)要求 選擇親和力高的抗體 抗原抗體復(fù)合物要大 數(shù)量要多 反應(yīng)時(shí)間充分 單色器 透射比濁計(jì) 散射比濁計(jì) 散射比濁和透射比濁的區(qū)別示意圖 透射光散射光 散射光 膠乳濁度測(cè)定法 基本原理是 將抗體吸附在大小適中 均勻一致的膠乳顆粒上 當(dāng)遇到相應(yīng)抗原時(shí) 則使膠乳顆粒發(fā)生凝集 單個(gè)膠乳顆粒在入射光波之內(nèi)不阻礙光線透過 兩個(gè)或兩個(gè)以上膠乳顆粒凝聚時(shí)則使透過光減少 這種減少的程度與膠乳顆粒凝聚的程度呈正比 當(dāng)然也與待測(cè)抗原量呈正比 圖 光波 膠乳濁度測(cè)定法原理 d d 2d 影響免疫比濁的因素 抗原抗體比例抗體純度和效價(jià)增聚劑 PEG 自動(dòng)免疫濁度分析儀的要求 校準(zhǔn)程序 使儀器處于正常的工作狀態(tài)定標(biāo)程序 保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性自動(dòng)控制 保證實(shí)施實(shí)驗(yàn)條件中的抗原抗體反應(yīng)體系要求自動(dòng)系統(tǒng) 障礙的檢測(cè)和預(yù)警 自動(dòng)化免疫儀器種類 應(yīng)用技術(shù) 免疫比濁分析技術(shù)化學(xué)發(fā)光 電發(fā)光分析技術(shù)熒光免疫分析技術(shù)放射免疫分析技術(shù)酶免疫分析技術(shù)流式細(xì)胞術(shù) 化學(xué)發(fā)光自動(dòng)免疫分析 化學(xué)發(fā)光是指在化學(xué)反應(yīng)過程中產(chǎn)生光的發(fā)射現(xiàn)象基本原理 標(biāo)記在抗原或抗體上的發(fā)光物質(zhì)在堿性介質(zhì)中氧化時(shí)產(chǎn)生激發(fā)態(tài)的中間體 中間體回基態(tài)時(shí)產(chǎn)生輻射 多余的能量為發(fā)射光子 產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象 再對(duì)光信號(hào)進(jìn)行接收轉(zhuǎn)化 可得檢測(cè)物濃度發(fā)光物質(zhì)須具備 氧化致發(fā)光 光量子產(chǎn)額高 理化性能好 化學(xué)發(fā)光自動(dòng)免疫分析類型 化學(xué)發(fā)光免疫分析 CLIA 是一種用發(fā)光劑直接標(biāo)記抗體的一類免疫分析法 用來標(biāo)記的發(fā)光物必須能參與發(fā)光反應(yīng) 標(biāo)記和偶聯(lián)后能穩(wěn)定 理化性質(zhì)和免疫特性不改變 多用吖啶酯類和苯酚類化合物 化學(xué)發(fā)光自動(dòng)免疫分析類型 化學(xué)發(fā)光酶免疫分析 CLEIA 以催化反應(yīng)的酶為標(biāo)記物 抗原抗體結(jié)合后 其中的酶可對(duì)發(fā)光體系產(chǎn)生催化作用 產(chǎn)生發(fā)光效應(yīng) 發(fā)光信號(hào)與抗原抗體的量成正比 多用的發(fā)光體系是HRP 魯米諾 化學(xué)發(fā)光自動(dòng)免疫分析類型 微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析 ECIA 也是一種酶免疫分析 用磁珠作為固相載體 增加反應(yīng)體積和分離效率 標(biāo)記的酶多為ALP 化學(xué)發(fā)光自動(dòng)免疫分析類型 電化學(xué)發(fā)光免疫分析 ECLIA 一種在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng) 實(shí)際上包括了電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光二個(gè)過程 其中應(yīng)用了 親和素 生物素 放大系統(tǒng) 使檢測(cè)的靈敏度大大提高以雙抗體夾心法為例之圖示 圖 ECLIA體系結(jié)構(gòu)圖 ECLIA檢測(cè)流程圖一 雙抗體夾心的形成 ECLIA檢測(cè)流程圖二 生物素與親和素結(jié)合 ECLIA檢測(cè)流程圖三 磁珠吸引吸附于電極表面 ECLIA檢測(cè)流程圖四 電極充電啟動(dòng)電化學(xué)反應(yīng) ECLIA檢測(cè)流程圖五 撤消磁場(chǎng)沖洗磁珠 化學(xué)發(fā)光自動(dòng)免疫分析 化學(xué)發(fā)光免疫分析是免疫技術(shù) 發(fā)光技術(shù)和計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的結(jié)合 具有特異性強(qiáng) 靈敏度高 pg ml 精密度好 準(zhǔn)確度好等特點(diǎn) 越來越多的人體微量指標(biāo)應(yīng)用這種方法來檢測(cè) 已漸漸代替了RIA 自動(dòng)化免疫儀器種類 應(yīng)用技術(shù) 免疫比濁分析技術(shù)化學(xué)發(fā)光 電發(fā)光分析技術(shù)熒光免疫分析技術(shù)放射免疫分析技術(shù)酶免疫分析技術(shù)流式細(xì)胞術(shù) 熒光免疫自動(dòng)化 利用熒光物質(zhì)標(biāo)記抗原抗體的一種檢測(cè)方法由免疫反應(yīng) 熒光及計(jì)算機(jī)技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用的技術(shù)主要有時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定和熒光偏振免疫測(cè)定 熒光免疫自動(dòng)化 時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定 TRFIA AG AB結(jié)合 某些熒光物質(zhì)發(fā)長(zhǎng)壽命熒光 時(shí)間分辨技術(shù)利用長(zhǎng)壽命熒光物質(zhì) 鑭氏元素銪螯合物 標(biāo)記抗原或抗體 測(cè)定過程中 可利用延遲時(shí)間來消除非特異性的熒光干擾 圖 光強(qiáng)度 激發(fā) 短壽命熒光 長(zhǎng)壽命熒光 延遲時(shí)間 測(cè)量時(shí)間 銪螯合物的激發(fā) 發(fā)射光譜 熒光免疫自動(dòng)化 TRFIA設(shè)計(jì)中的一些注意事項(xiàng) Stakes位移 圖 解離增強(qiáng) 熒光免疫自動(dòng)化 熒光偏振免疫測(cè)定 以小分子物質(zhì)與大分子物質(zhì)的旋轉(zhuǎn)差異而使它們對(duì)偏振光的吸收不同為依據(jù)檢測(cè)小分子藥物熒光酶免疫分析 標(biāo)記酶參與反應(yīng) 波長(zhǎng) 300400500600700 Stakes 吸光度 Stakes位移示意圖 激發(fā)光 熒光 自動(dòng)化免疫儀器種類 應(yīng)用技術(shù) 免疫比濁分析技術(shù)化學(xué)發(fā)光 電發(fā)光分析技術(shù)熒光免疫分析技術(shù)放射免疫分析技術(shù)酶免疫分析技術(shù)流式細(xì)胞術(shù) 流式細(xì)胞儀 流式細(xì)胞儀 FCM 是以激光為光源 檢測(cè)生物學(xué)顆粒理化性質(zhì)的儀器生物學(xué)顆粒包括免疫復(fù)合物 DNA RNA 蛋白質(zhì) 病毒顆粒 脂質(zhì)體 細(xì)胞器 細(xì)胞 染色體 真核細(xì)胞等理化性質(zhì)則為細(xì)胞大小 形狀 胞漿顆粒 DNA含量 酶活性等 流式細(xì)胞儀 FCM綜合了激光技術(shù) 電子技術(shù) 流體力學(xué) 細(xì)胞化學(xué)及計(jì)算機(jī)技術(shù) 被稱為實(shí)驗(yàn)室 CT FCM現(xiàn)正廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué) 免疫學(xué) 腫瘤學(xué) 血液學(xué) 病理學(xué) 遺傳學(xué) 臨床檢驗(yàn)學(xué)等 流式細(xì)胞儀基本原理 基本原理 單個(gè)經(jīng)熒光染料染色的細(xì)胞經(jīng)過激光激發(fā)后 發(fā)射的熒光在不同的角度進(jìn)行測(cè)量 并對(duì)其信號(hào)進(jìn)行綜合分析 圖 細(xì)胞分選原理 通過測(cè)量區(qū)的細(xì)胞若其參數(shù)符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的條件 在經(jīng)過偏轉(zhuǎn)板時(shí)被充上相應(yīng)的電荷并被偏轉(zhuǎn)收集 圖 液流系統(tǒng) 樣本和鞘流液組成 圖 光學(xué)系統(tǒng) 光源可為汞燈或激光信號(hào)接收系統(tǒng) 散射光和熒光的檢測(cè) 流式細(xì)胞儀基本組成 側(cè)向熒光信號(hào) 鞘流 前向散射光 流式細(xì)胞流動(dòng)池示意圖 噴嘴 激光束 散射光的檢測(cè) 信號(hào)的產(chǎn)生及強(qiáng)度 圖 前向散射光 圖 側(cè)向散射光 圖 信號(hào)的產(chǎn)生 激光照射區(qū) 信號(hào)檢測(cè)曲線 細(xì)胞中熒光素今量與信號(hào)的關(guān)系 信號(hào)的產(chǎn)生 細(xì)胞中熒光素今量與信號(hào)的關(guān)系 信號(hào)的產(chǎn)生 激光器 激光器 激光探測(cè)器 大顆粒 小顆粒 前散射光示意圖 激光器 激光器 側(cè)向散射光探測(cè)器 復(fù)雜顆粒 簡(jiǎn)單顆粒 側(cè)向散射光示意圖 熒光測(cè)量 熒光染料染色的細(xì)胞通過測(cè)量區(qū)時(shí) 細(xì)胞中特異性熒光物質(zhì)受激發(fā)產(chǎn)生熒光信號(hào) 后者強(qiáng)弱表示待測(cè)物質(zhì)的多少熒光的檢測(cè)系統(tǒng)由濾光片和檢測(cè)器組成 濾光片的作用是使激發(fā)光波長(zhǎng)盡可能接近熒光染料的激發(fā)光譜峰值 濾除非熒光信號(hào) 提高熒光的檢測(cè)強(qiáng)度 流式細(xì)胞儀免疫分析的技術(shù)要求 儀器性能指標(biāo) 熒光分辨率 熒光靈敏度 前向角散色光靈敏度 前向角散光分辨率 分析 分選速度 分選純度 分選收獲率檢測(cè)樣品要求要單細(xì)