SOP-QC4-010大腸埃希菌檢查SOP.doc

.部 門職務(wù)/崗位簽 名日 期起草質(zhì)量控制室化驗員技術(shù)審核質(zhì)量控制室主任法規(guī)符合性審核質(zhì)量保證室質(zhì)量運(yùn)行崗文件格式審核質(zhì)量保證室文件管理員批準(zhǔn)質(zhì)量管理部經(jīng)理生效日期 年 月 日頒發(fā)部門質(zhì)量管理部復(fù)審日期 年 月 日文件拷貝號分發(fā)部門質(zhì)量管理部 設(shè)備部 物資部 總經(jīng)理辦公室質(zhì)量保證室 銷售部 生產(chǎn)部 車間質(zhì)量控制室.大腸埃希菌檢查SOP1.目的 建立一個規(guī)程，規(guī)范大腸埃希菌計數(shù)操作方法。2.范圍 本規(guī)程適用于xxxxxxxxxx公司質(zhì)量控制室對水質(zhì)、碳酸鈣成品及其他的微生物限度檢查。3.職責(zé) QC檢測人員負(fù)責(zé)按照本規(guī)程進(jìn)行樣品檢測和記錄；QC負(fù)責(zé)人及監(jiān)管人員有權(quán)對檢測過程及結(jié)果進(jìn)行監(jiān)督檢查，有權(quán)制止不符合規(guī)程的操作并向QA提出重試請求，得到QA批準(zhǔn)后方可進(jìn)行重試。必須開啟偏差記錄來解決不符合規(guī)程的操作。4. 物料和設(shè)備4.1試劑和材料 pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液：取磷酸二氫鉀3.56g、無水磷酸氫二鈉5.77g、氯化鈉4.30g、蛋白胨1.00g，加水1000ml，微溫溶解、濾清、分裝、滅菌。 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基：胰酪胨17.0g 氯化鈉5.0g 大豆木瓜蛋白酶水解物3.0g 磷酸氫二鉀2.5g以上成分混合加水1000ml，微溫溶解，濾過，調(diào)節(jié)PH使滅菌后在25的pH為7.30.2，加入無水葡萄糖2.3g或葡萄糖2.5g，分裝，滅菌。2025培養(yǎng)35天后無菌生長即可使用。 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基：胨 10.0g 氯化鈉5.0g 牛肉浸出粉3.0g 水1000ml 葡萄糖5.Og除葡萄糖外，取上述成分混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH為弱堿性，煮沸，加入葡萄糖溶解后，搖 勻，濾清，調(diào)節(jié)pH使滅菌后在25C的pH值為7.2士0.2，分裝，滅菌。麥康凱液體培養(yǎng)基明膠胰酶水解物20.0g 溴甲酚紫10mg 乳糖10.0g 水1000ml牛膽鹽 5.0g除乳糖、溴甲酚紫外，取上述成分，混合，微溫溶解 ，調(diào)節(jié)pH 使滅菌后在25的pH值為7.30.2，加入乳糖、溴甲酚紫，分裝 ，滅菌。麥康凱瓊脂培養(yǎng)基明膠胰酶水解物17.0g 中性紅30.0mg 胨3.0g 結(jié)晶紫1mg 乳糖10.0g 瓊脂13.5g 脫氧膽酸鈉1.5g 水1000ml氯化鈉 5.0g除乳糖、中性紅、結(jié)晶紫、瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解 ，調(diào)節(jié)pH 使滅菌后在25的pH值為7.10.2，加入乳糖、中性紅、結(jié)晶紫、瓊脂，加熱煮沸1分鐘，并不斷振搖，分裝 ，滅菌。市售成品培養(yǎng)基按說明書配制。 革蘭氏染色試劑：有商品供應(yīng)，含結(jié)晶紫染劑、碘液固染劑、酒精脫色劑、復(fù)紅復(fù)染劑。4.2器材和設(shè)備 無菌器皿：吸管、量筒、錐形瓶或鹽水瓶等。 其它器材和設(shè)備：接種針、酒精燈、玻片、細(xì)菌培養(yǎng)箱等。5 程序4244麥康凱瓊脂平板麥康凱液體培養(yǎng)基供試品供試液增菌培養(yǎng)42442448hr1872hr可疑無菌落生長報告結(jié)果有菌落生長菌落形態(tài)特征報告結(jié)果報告結(jié)果革蘭氏染色、鏡檢生化試驗(IMViC)疑似菌落純培養(yǎng)30351824hr5.1樣品處理及準(zhǔn)備 取樣品10g或10ml，用pH7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液溶解并稀釋至100ml，為10%的試樣。 當(dāng)樣品含有抑菌物質(zhì)時，應(yīng)按相應(yīng)物料“抽樣檢驗規(guī)程”所規(guī)定的方法和要求予以處理，如稀釋法、離心法、中和法、薄膜過濾法等。5.2增菌培養(yǎng)及分離培養(yǎng)。5.2.1增菌培養(yǎng)：取10%的試樣10ml（相當(dāng)于樣品1g或1ml），接種于胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（不少于100ml）中，混勻，置3035培養(yǎng)1824小時。5.2.2選擇分離培養(yǎng)：取上述培養(yǎng)物1ml接種至100ml麥康凱液體培養(yǎng)基中，4244培養(yǎng)2448小時后，取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，3035培養(yǎng)1872小時5.2.3 結(jié)果判斷：若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長，應(yīng)進(jìn)行分離、純化及適宜的鑒定試驗，確證是否為大腸埃希菌；若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上沒有菌落生 長，或雖有菌落生長但鑒定結(jié)果為陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌5.3對照實驗5.3.1陽性對照試驗：用陽性菌代替供試品按照5.2項操作，對照菌的加入量應(yīng)不大于100cfu。陽性對照試驗應(yīng)檢出大腸埃希菌5.3.2陰性對照試驗：以稀釋劑代替供試液，按照5.2項操作，陰性對照應(yīng)無菌生長，如果陰性對照有菌生長，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。5.4鑒定試驗5.4.1菌落形態(tài)鑒定：麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上大腸埃希菌菌落形態(tài)特征：鮮桃紅色或微紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形、扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤。若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上出現(xiàn)可疑菌落時挑取菌落進(jìn)行分離、純化、染色鏡檢和IMViC實驗，確認(rèn)是否為大腸埃希菌。5.4.2 純培養(yǎng)如果麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上生長的菌落與大腸埃希菌菌落形態(tài)特征相符或疑似時，以接種針輕輕接觸單個疑似菌落的表面中心，蘸取培養(yǎng)物，應(yīng)挑選23個以上疑似菌落，分別接種營養(yǎng)瓊脂斜面，溫度3035培養(yǎng)1824hr，進(jìn)行以下檢查。如果平板上無單個可疑菌落，但有可疑菌團(tuán)（如呈紫黑色或有金屬光澤），則應(yīng)蘸取可疑菌團(tuán)培養(yǎng)物少許，或重新取增菌培養(yǎng)液分區(qū)劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板，溫度3035培養(yǎng)1824hr，再挑選單個疑似菌落，純培養(yǎng)，進(jìn)行以下檢查。5.4.3 革蘭氏染色、鏡檢5.4.3.1 以接種環(huán)蘸取無菌水于潔凈無劃痕的載玻片上，取上述疑似菌落的營養(yǎng)瓊脂斜面新鮮培養(yǎng)物少許，制成均勻涂片，自然或微溫干燥，再通過火焰23次固定。 5.4.3.2 在載玻片的菌斑上滴加結(jié)晶紫染液，染色1min，水洗。5.4.3.3 滴加碘液，媒染1min，水洗，以濾紙吸干余水。5.4.3.4 滴加95%乙醇，嚴(yán)格控制時間脫色2030s，水洗。5.4.3.5 滴加沙黃染液，復(fù)染1min，待干后，鏡檢。5.4.3.6 鏡檢結(jié)果：革蘭氏陽性菌呈藍(lán)紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色；大腸埃希菌為革蘭氏陰性短桿菌或球桿菌。5.4.4 生化（IMViC）試驗5.4.4.1 乳糖發(fā)酵試驗 取上述斜面培養(yǎng)物，接種于乳糖發(fā)酵管，溫度3035培養(yǎng)2448hr，觀察產(chǎn)酸（指示劑為酸性品紅者為紅色，指示劑為溴麝香草酚藍(lán)者為黃色），產(chǎn)氣（小倒管內(nèi)有氣泡，氣泡無論大小）。為了避免遲緩發(fā)酵產(chǎn)生假陰性，也可接種5%乳糖發(fā)酵管。絕大多數(shù)遲緩發(fā)酵乳糖的細(xì)菌，可于24hr出現(xiàn)陽性，或適當(dāng)延長培養(yǎng)時間。5.4.4.2 靛基質(zhì)試驗（I） 取上述斜面培養(yǎng)物，接種于蛋白胨水培養(yǎng)基中，溫度3035培養(yǎng)2448hr，沿管壁加入靛基質(zhì)試液數(shù)滴，輕輕搖動試管，液面呈玫瑰紅色為陽性（+），呈試劑本色為陰性（-）。98%的大腸埃希菌靛基質(zhì)試驗為陽性，一般24Hr即可出現(xiàn)陽性結(jié)果，以無菌操作先從管中取出1ml或2ml培養(yǎng)液進(jìn)行檢查，如靛基質(zhì)陰性，余下的蛋白胨水培養(yǎng)物再培養(yǎng)24hr，做靛基質(zhì)試驗。5.4.4.3 甲基紅試驗（M） 取上述斜面培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中，溫度3035培養(yǎng)482hr，于培養(yǎng)液中加入甲基紅指示液23滴（約每1ml培養(yǎng)液1滴），輕微搖動，立即觀察，呈鮮紅色或橘紅色為陽性，呈黃色為陰性（-）。5.4.4.4 乙酰甲基甲醇生產(chǎn)試驗（V-P） 取上述斜面培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中，溫度3035培養(yǎng)482hr，于2ml培養(yǎng)液中加入-萘酚乙醇試液1ml，混勻，再加40%氫氧化鉀試液0.4ml，充分振搖，在4hr（通常在30min時）內(nèi)出現(xiàn)紅色判為陽性（+），無紅色判為陰性（-）。 5.4.4.5 枸櫞酸鹽利用試驗（C） 取上述斜面培養(yǎng)物，接種于枸櫞酸鹽培養(yǎng)基斜面上，溫度3035培養(yǎng)24天，培養(yǎng)基斜面有菌苔生長，培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{(lán)色時，判為陽性（+），培養(yǎng)基顏色無變化、無菌苔生長，判為陰性（-）。5.4.4 結(jié)果判斷：當(dāng)IMViC試驗為“- + - -”、革蘭氏陰性桿菌，報告1g或1ml供試品檢出大腸埃希菌；IMViC試驗為“+ + - -”、革蘭氏陰性桿菌，報告1g或1ml供試品檢出大腸埃希菌。其他情況報告1g或1ml供試品未檢出大腸埃希菌。見下表：大腸埃希菌IMViC實驗結(jié)果判斷實驗結(jié)果結(jié)果判斷靛基質(zhì)(I)甲基紅(M)V-P(Vi)枸櫞酸鹽利用實驗(C)+-典型大腸埃希菌-+-非典型大腸埃希菌+-+典型中間型-+-+非典型中間型-+典型產(chǎn)氣菌+-+非典型產(chǎn)氣菌6.報告6.1 填寫記錄由操作人員及時收集和填寫檢查記錄，見大腸埃希菌檢查記錄。6.2 問題及偏差處理操作過程中發(fā)現(xiàn)結(jié)果超標(biāo)或異常時，應(yīng)進(jìn)行分析和調(diào)查，可按照“OOS處理規(guī)程(SMP-QC-002)”進(jìn)行，當(dāng)OOS處理發(fā)現(xiàn)OOS不成立，可參考“偏差處理規(guī)程（SMP-QA-007）”進(jìn)行，偏差及其處理同樣應(yīng)當(dāng)予以記錄。6.3 記錄審核與上交記錄填寫后應(yīng)及時上交QC收發(fā)人員，按批記錄的要求進(jìn)行整理和審核，最后由部門負(fù)責(zé)人簽字后上交質(zhì)量保證部。7.注意事項7.1 貴重物料或物料量本身較少時，檢驗量可根據(jù)實際需要予以采集和取用。7.2 樣品處理時的溫度及培養(yǎng)基的溫度均不得超過45。7.3 供試液配后應(yīng)在1小