天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)講義.doc

天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)講義實(shí)驗(yàn)須知天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)是天然藥物化學(xué)課程的重要組成部分，是使學(xué)生進(jìn)一步理論聯(lián)系實(shí)際，掌握天然藥物有效成分提取、分離和檢定的基本操作技能，提高學(xué)生分析和解決問題能力。養(yǎng)成嚴(yán)密科學(xué)態(tài)度和良好工作作風(fēng)必不可少的教學(xué)環(huán)節(jié)。為此，提出下列實(shí)驗(yàn)須知：1遵守實(shí)驗(yàn)室制度，維護(hù)實(shí)驗(yàn)室安全，不違章操作，嚴(yán)防爆炸、著火、中毒、觸電、漏水等事故的發(fā)生。若發(fā)生事故應(yīng)立即報(bào)告指導(dǎo)教師。2實(shí)驗(yàn)前作好預(yù)習(xí)，明確實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，了解實(shí)驗(yàn)的基本原理和方法，安排好當(dāng)天計(jì)劃，爭(zhēng)取準(zhǔn)時(shí)結(jié)束。實(shí)驗(yàn)過程應(yīng)養(yǎng)成及時(shí)記錄的習(xí)慣。凡是觀察到的現(xiàn)象和結(jié)果及有關(guān)的重量、體積、溫度或其他數(shù)據(jù)，應(yīng)立即如實(shí)記錄，實(shí)驗(yàn)完畢后，認(rèn)真總結(jié)，寫好報(bào)告，提取純化所得單體產(chǎn)物包好，貼上標(biāo)簽（日期、樣品名稱、純度、mp、bp、TLC、重量）交給老師。3實(shí)驗(yàn)室中保持安靜，不許大聲喧嚷，不許抽煙、不遲到、不隨便離開，實(shí)驗(yàn)臺(tái)面應(yīng)保持清潔，使用過的儀器及時(shí)清洗干凈，存放在實(shí)驗(yàn)柜內(nèi)，廢棄的固體和濾紙等丟入廢物缸內(nèi)，絕不能丟入水槽、下水道和窗外，以免堵塞和影響環(huán)境衛(wèi)生。4公用儀器及藥品用完后立即返還原處，破損儀器應(yīng)填寫破損報(bào)告單，注明原因。節(jié)約用水、用電、藥用試劑。嚴(yán)格藥品用量。5保持實(shí)驗(yàn)室內(nèi)整潔，學(xué)生采取輪流值日，每次實(shí)驗(yàn)完畢，負(fù)責(zé)整理公用儀器，將實(shí)驗(yàn)臺(tái)、地面打掃干凈，倒清廢物缸，檢查水、電和門窗是否關(guān)閉。實(shí)驗(yàn)一 薄層板的制備、活度測(cè)定及應(yīng)用一、目的要求1掌握硅膠薄層板的制備及薄層層析的操作方法2掌握硅膠薄層活度的測(cè)定方法3應(yīng)用薄層層析法檢測(cè)識(shí)中草藥化學(xué)成分二、實(shí)驗(yàn)材料薄層層析用硅膠G，硅膠F，羧甲基纖維素鈉，0.01%二甲基黃（Dimethy-yellow. P-Dimethylaminoazobenzene），蘇丹紅（Sudan ），靛酚藍(lán)（Indophenol blue 4-Tapnthoquinone-4-dimethyl aminoaniline），苯，微量點(diǎn)樣管，1020cm玻璃板20塊，碾缽7套。三、實(shí)驗(yàn)操作（一）薄層板的制備1硅膠薄層的制備（1）硅膠G薄層 取硅膠G或硅膠GF一份，置燒杯中加水約5份混合均勻，放置片刻，隨即用藥匙取一定量，分別倒在一定大小的玻璃片上（或倒入涂布器中，推動(dòng)涂布），均勻涂布成0.250.5mm厚度，輕輕振動(dòng)玻璃板，使薄層面平整均勻，在水平位置放置，待薄層發(fā)白近干，于烘箱中100活化0.51小時(shí)，冷后貯于干燥器內(nèi)備用?；罨瘻囟群蜁r(shí)間可依需要調(diào)整，一般檢識(shí)水溶性成分或一些極性大的成分時(shí)，所用薄層板只在空氣中自然干燥，不經(jīng)活化即可貯存?zhèn)溆谩＃?）硅膠（H）羧甲基纖維鈉（CMC-Na）薄層 CMC-Na系碳水化合物，調(diào)制時(shí)應(yīng)在水浴上進(jìn)行。羧甲基纖維素鈉的溶液一般用0.51%濃度（常用0.8%），宜預(yù)先配制后靜置，取其上層澄清溶液應(yīng)用，則所制備的薄層表面較為細(xì)膩平滑。取薄層層析用硅膠，按1：33.5的比例加入羧甲基纖維素鈉溶液順時(shí)針方向攪拌混合并排除氣泡，按照硅膠G薄層涂布法制備薄層，讓其自然陰干，100下活化30分鐘?；罨瘻囟炔粦?yīng)過高，防止碳化。冷后于干燥器內(nèi)備用。注：國內(nèi)青島海洋化工廠出售薄層層析用的硅膠在吸附劑名稱之后加幾個(gè)字標(biāo)明的意思是：硅膠G（G是Gypsum石膏的縮寫。表示加了石膏），硅膠H（H表示不加石膏），硅膠GF254（F254表示加石膏和波長(zhǎng)254顯綠色熒光的硅酸鋅錳）。硅膠GF365（表示加石膏和波長(zhǎng)365nm顯黃色熒光的硫化鋅鎘）。2特殊薄層的制備根據(jù)分離工作的特殊需要，可制成以下幾種特制薄層。（1）酸、堿薄層和pH緩沖薄層為了改變吸附劑的酸堿性，以改進(jìn)分離效果，可在吸附劑中加入稀酸溶液（如0.10.5N草酸溶液）代替水制成酸性氧化鉛薄層使用，硅膠微呈酸性，可在鋪層時(shí)用稀堿溶液（如0.10.5N氫氧化鈉溶液）代替水制成堿性的硅膠薄層。當(dāng)用醋酸鈉、磷酸鹽等不同pH的緩沖液代替水鋪層，制成一定pH緩沖的薄層。（2）絡(luò)合薄層硝酸銀薄層的制法，可在吸附劑中加入525%硝酸銀水溶液代替水制成均勻糊狀，再按常法鋪成薄層，制成薄層避光陰干，于105活化半小時(shí)后避光貯存，制成的薄層以不變成灰色為好，在三天內(nèi)應(yīng)用。也可先把硝酸銀用少量水溶解，再用甲醇稀釋成10%溶液，把預(yù)先制好的硅膠G薄層浸入此溶液中約1分鐘，取出避光陰干，按上法活化，貯存。（二）、吸附劑的活度測(cè)定1硅膠活度的測(cè)定一般選用三種染料的薄層層析法進(jìn)行測(cè)定。歐洲藥典1969年記載用0.01%二甲基黃（Dimethy-yellow. P-Dimethylaminoazobenzene）。蘇丹紅（Sudan ），靛酚藍(lán)（Indophenol blue 4-Tapnthoquinone-4-dimethyl aminoaniline）的苯溶液各10l點(diǎn)滴于硅膠G或硅膠H薄層上，以苯為展開劑，展開10cm（約20分鐘），三種染料應(yīng)明顯分離，靛酚藍(lán)斑點(diǎn)接近于起始線。二甲基黃斑點(diǎn)在薄層的當(dāng)中。蘇丹紅斑點(diǎn)與二甲基黃斑點(diǎn)之間，則認(rèn)為薄層板活性符合要求。2氧化鋁活度的測(cè)定一般可用45種偶氮染料以薄層層析法進(jìn)行測(cè)定。染料試劑的配制：取偶氮苯（Azobenzene）50mg，對(duì)甲氧基偶氮苯（P-Methoxyuzobenzene）,蘇丹黃（Sudan I, Benzeneazo-naphthol），蘇丹紅（Sudan Tetrazobenzol-naphthol），對(duì)氨基偶氮苯（P-Aminoazobenzene）各20mg，分別溶于50ml重蒸餾的四氯化碳（經(jīng)氫氧化鈉干燥）中。常法制備不含粘合劑氧化鋁薄層，以鉛筆尖或毛細(xì)管尖在薄層板一端23 cm處間隔1cm左右輕輕點(diǎn)上5個(gè)可以看清的小點(diǎn)，各吸取約0.02ml染料試劑分別點(diǎn)滴于原點(diǎn)上，以四氯化碳為展開劑，展開時(shí)薄層板與容器底部交角為1040之間，展開后測(cè)出各斑點(diǎn)的Rf值，從表1確定氧化鋁的活度（一般高活性氧化鋁級(jí)活度使用本法時(shí)，結(jié)果往往偏低）。另取不含粘合劑氧化鋁薄層板一塊，置于水蒸汽飽和容器內(nèi)，23小時(shí)后取出，按上述方法測(cè)定活度。觀察有無變化。表1 氧化鋁活度與偶氮染料外值關(guān)系偶氮染料氧化鋁活度級(jí)Rf值二級(jí)三級(jí)四級(jí)五級(jí)偶氮苯0.590.720.850.95對(duì)甲氧基偶氮苯0.160.450.690.89蘇丹黃0.020.250.870.98蘇丹紅0.000.100.350.50對(duì)氨基偶氮苯0.000.050.080.19（三）、薄層層析的應(yīng)用薄層層析法在天然藥物化學(xué)成分的研究中，主要應(yīng)用于化學(xué)成分的預(yù)試、化學(xué)成分的鑒定及探索柱層分離的條件。用薄層層析進(jìn)行中草藥化學(xué)成分檢識(shí)，可依據(jù)各類成分性質(zhì)及熟知的條件有針對(duì)性地進(jìn)行。由于在薄層上展開后，可將一些雜質(zhì)分離，選擇性高，可使預(yù)試結(jié)果更為可靠，不僅可通過顯色獲知成分類型，而且可初步了解主要成分的數(shù)目及其極性大小。實(shí)驗(yàn)操作：蒽醌類成分的鑒別三、思考題1. 為何在鋪板之前，色譜用的玻璃板要完全洗凈并干燥？2. 為何鋪好的TLC板用前要在烘箱中干燥？試驗(yàn)二 大黃中蒽醌類成分的提取分離和鑒定（一）概述 大黃記載于神農(nóng)本草經(jīng)等許多文獻(xiàn)中，用于泄下、健胃、清熱、解毒等。 自古以來，大黃在植物性瀉下藥中占有重要位置，是一位很早就被各國藥典所收載的世界性生藥。大黃的種類繁多，優(yōu)質(zhì)大黃是蓼科植物掌葉大黃（Rheum palmatclm L），大黃（R. officinale Baill）及唐古特大黃（R. tangutium Maxim.et Regll）的根莖及根，大黃中含有多種游離的羥基蒽醌類化合物以及它們與糖所形成的苷。已經(jīng)知道的羥基蒽醌主要有下列五種：R1R2名 稱晶 形熔 點(diǎn)-H-COOH大黃酸(Rhein)黃色針晶318320-H-CH2OH蘆薈大黃素(Aloe-emodin)橙色細(xì)針晶206208-H-CH3大黃酚(Chyrsophanol)金色片狀結(jié)晶196-CH3-OH大黃素(Emodin)橙色針晶256257-CH3-大黃素甲醚(Physcion)磚紅色針晶207 大黃中蒽醌苷元，其結(jié)構(gòu)不同，因而酸性強(qiáng)弱也不同。大黃酸連有-COOH，酸性最強(qiáng)；大黃素連有-OH，酸性第二；蘆薈大黃素連有芐醇-OH，酸性第三；大黃素甲醚和大黃酚均具有1,8-二酚羥基，前者連有-OCH3和-CH3，后者只連有-CH3，因而后者酸性排在第四位。（二）實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?1學(xué)習(xí)緩沖紙色譜的基本操作技術(shù)，并能根據(jù)色譜結(jié)果，設(shè)計(jì)液液萃取法分離混合物的實(shí)驗(yàn)方案。 2掌握PH梯度法的原理及操作技術(shù)。 3學(xué)習(xí)蒽醌類化合物鑒定方法。（三）實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)試劑及試藥：大黃藥材粗粉2Kg，氯仿500ml 10瓶，濃硫酸2瓶，濃鹽酸2瓶，冰醋酸，苯，乙酸乙酯，碳酸鈉（5% Na2CO3溶液3000ml），碳酸氫鈉（5% NaHCO3溶液3000ml），氫氧化鈉（5% NaOH溶液1000ml），氫氧化鉀，醋酸鎂試劑等。實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備：500ml圓底燒瓶10個(gè)，冷凝回流管10只，500ml分液漏斗10只，500ml燒杯20只，100-250ml量筒10只，常壓漏斗（5-10cm斗徑10只），定性濾紙（10cm）2盒，毛細(xì)管點(diǎn)樣器1盒，玻璃噴瓶4套，廣譜PH試紙5盒，紗布一卷，多孔水浴鍋5臺(tái)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀2臺(tái)1大黃總蒽醌苷元的提取大黃粗粉50g加20%的硫酸水溶液100ml，加氯仿250ml，水浴回流2小時(shí)，過濾，測(cè)量濾液體積殘?jiān)确氯芤鹤⒁猓捍簏S中的蒽醌類成分大部分與糖結(jié)合，以蒽醌的形式存在于植物組織中。所以要用酸水解使其生成苷元。蒽醌苷元可溶于氯仿、苯及乙醚等有機(jī)溶劑，用苯時(shí)應(yīng)注意苯蒸氣的揮發(fā)，嚴(yán)防中毒；所得的氯仿液中如帶有酸水液，應(yīng)該用分液漏斗分出棄去，并用蒸餾水回洗一次除去酸性以免影響梯度萃取。氯仿提取液放置中如有沉淀析出，可濾取之，該沉淀多為大黃素，余液進(jìn)行下一步分離試驗(yàn)用。2總蒽醌苷元的分離與精制大黃酸的分離與精制將含有總游離蒽醌的氯仿液250ml移至1000ml的大分液漏斗中，加PH8緩沖液（5% NaHCO3溶液）125ml振搖萃?。?次，每次125ml，至堿液無色），靜置至徹底分層，放出氯仿液后，倒出堿水液至置500ml燒杯中，加HCl酸化至PH=3，待黃色沉淀析出完全后，過濾、干燥，干燥后的樣品加冰醋酸10ml加熱使溶，趁熱過濾，濾液靜置，析出黃色針晶為大黃酸，過濾即得純品。大黃素的分離與精制將提過大黃酸的氯仿液繼續(xù)移至分液漏斗中，用PH9.9緩沖液（5%NaCO3溶液）125ml振搖萃?。?次，每次125ml，至堿液無色），275ml振搖萃取，徹底分層后，分出堿水層，并用HCl酸化至PH=3，析出棕黃色沉淀，過濾，沉淀經(jīng)干燥后，用10ml冰醋酸加熱使溶，趁熱過濾，析出橙色大針晶，過濾后，即得大黃素純品。蘆薈大黃素的分離和精制余下氯仿液移至分液漏斗后，加5%NaCO3:5%NaOH (9:1) 堿水液125ml或用0.5%KOH125ml振搖萃取，堿水液加HCl酸化，析出的沉淀過濾干燥，用10ml乙酸乙酯重結(jié)晶，得黃色針晶的蘆薈大黃素純品。3. 鑒定1.化學(xué)檢識(shí)：分別取總蒽醌提取物少許，用乙醚溶解，做如下反應(yīng)：A：堿液試驗(yàn)：取試液1ml，加20%NaOH數(shù)滴，觀察顏色。B醋酸鎂反應(yīng)：取試樣1ml，加醋酸鎂試劑數(shù)滴，觀察現(xiàn)象。2薄層鑒定：吸附劑：硅膠-CMC展開劑：C6H6-EtOAc(3:2或97：9)。顯色劑：（1）氨蒸氣熏。（2）5%KOH噴霧。（四）實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)1本實(shí)驗(yàn)講解要點(diǎn)及注意事項(xiàng)。 PH梯度萃取的原理及注意事項(xiàng)。 如何設(shè)計(jì)萃取分離方案的程序與方法。 分離萃取時(shí)一定注意乳化層的分出，不要混入，并且每步最好用新鮮CHCl3，回洗堿水液。 緩沖液的配制和堿液的配制要準(zhǔn)確，嚴(yán)格注意檢查。2實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求 記錄大黃總蒽醌的提取方法及總蒽醌的分離程序（包括溶劑用量）。 總蒽醌的顯色鑒別結(jié)果。 記錄大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素的精制方法及薄層色譜鑒別結(jié)果。實(shí)驗(yàn)四 黃連中鹽酸小檗堿的提取、精制和鑒定黃連為毛莨科黃連屬植物黃連、三角葉黃連或云連等的干燥根莖。具有清熱燥濕、清心除煩、瀉火解毒的功效。黃連的有效成分主要是生物堿，已分離出的主要有：小檗堿（ Berberine ），又名黃連素，巴馬丁、黃連堿，甲基黃連堿、藥根堿、表木蘭堿等，其中以小檗堿含量最高，可達(dá)10%左右，且以鹽酸鹽的狀態(tài)存在于黃連中。小檗堿鹽酸對(duì)痢疾桿菌、葡萄球菌和鏈球菌等均有顯著抑制作用，臨床用于治療細(xì)菌性痢疾和胃腸炎等，無耐藥性和副作用。一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、掌握鹽酸小檗堿的一種提取方法，熟悉鹽析法、重結(jié)晶法。2、掌握小檗堿的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，特殊的理化性質(zhì)和薄層鑒定方法。3、通過實(shí)驗(yàn)熟悉和掌握柱層析法的分離原理及操作技能。二、 小檗堿的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)小檗堿為黃色長(zhǎng)針狀結(jié)晶，具5.5個(gè)結(jié)晶水，m.p145，能緩緩溶于冷水中（1：20），微溶于冷乙醇（1：100），易溶于熱水和熱乙醇，微溶或不溶于苯、氯仿和丙酮，與酸結(jié)合成鹽時(shí)失去一分子水，其硝酸鹽和氫碘酸鹽極難溶于水，鹽酸鹽微溶于冷水，較易溶于沸水，其硫酸鹽，構(gòu)椽酸鹽在水中溶解度較大。鹽酸小檗堿為黃色結(jié)晶，含2分子結(jié)晶水，220左右分解為棕紅色小檗紅堿，285左右完全溶融，UVmax265nm，343nm。游離小檗堿易和1分子丙酮或1分子氯仿或1.5分子苯結(jié)合成一黃色絡(luò)合物晶體。三、 實(shí)驗(yàn)原理本實(shí)驗(yàn)利用小檗堿與含氧酸（硝酸例外）所成鹽在水中溶解度較大的性質(zhì)，采用稀硫酸將其以硫酸鹽形式提取出來，再根據(jù)小檗堿與氫鹵酸所成鹽在水中溶解度較小的特點(diǎn)，在將小檗堿游離后，加入鹽酸使其形成鹽酸鹽，結(jié)合成鹽析法，使之沉淀析出。四、 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、提取取黃連粗粉25克，加入0.2%H2SO4液200ml加熱煎煮1小時(shí)（注意隨時(shí)補(bǔ)充蒸發(fā)損失的溶劑），紗布過濾，殘?jiān)偌?.2%H2SO4液200ml 加熱煎煮45分鐘，紗布過濾，兩次濾液合并。向?yàn)V液中加入石灰乳調(diào)節(jié)pH12，抽濾，再向抽濾所得的濾液中滴加濃HCl，調(diào)節(jié)pH2-3，然后加入8%（W/V）氯化鈉，攪拌并使完全溶解，并繼續(xù)攪拌至溶液出現(xiàn)微濁現(xiàn)象為止，放置過夜。則有鹽酸小檗堿沉淀析出。2、分離及精制 抽濾，得鹽酸小檗堿粗品，水洗，加適量蒸餾水加熱溶解，趁熱抽濾，濾液放置，則有鹽酸小檗堿結(jié)晶析出。再進(jìn)行重結(jié)晶：即濾取結(jié)晶，加入適量乙醇，水浴加熱溶解，趁熱抽濾，濾液放置結(jié)晶。待鹽酸小檗堿析出完全后，濾出，80干燥，得成品。3、鹽酸小檗堿的檢識(shí)（1）取鹽酸小檗堿少許，加10%稀硫酸適量使之溶解后，加入一點(diǎn)漂白粉，即顯櫻紅色。（2）取鹽酸小檗堿少許，加熱使其溶于水中，加10%NAOH使呈強(qiáng)堿性，然后滴加丙酮數(shù)滴，可見有黃色結(jié)晶性的小檗堿丙酮加成物生成。4、柱層析分離吸附劑：12克氧化鋁（80-100目）層析柱：140cm玻璃柱（也可用堿式滴定管代替）洗脫劑：95%乙醇（1）氧化鋁吸附柱的制備（濕法裝柱）取一根25cm堿式滴定管代作層析管用，管的下端套一段約3-4cm長(zhǎng)的乳膠管，在乳膠管上夾一螺旋夾，以控制洗脫液流出速度。在層析管的下端填一層松緊合適平整的脫脂棉。將此層析管垂直地固定在鐵架臺(tái)上，關(guān)閉螺旋夾。管內(nèi)先加入一定體積的洗脫劑（此處用95%乙醇），打開螺旋夾，放出管內(nèi)乙醇，將層析管下端的脫脂棉內(nèi)的空氣充分趕盡，然后再向?qū)游龉苤屑尤胍欢w積的乙醇。取中性氧化鋁（100-200目）12克于燒杯中，加一定體積的乙醇調(diào)成漿狀，趕盡其中氣泡，然后通過小玻璃漏斗將漿狀氧化鋁徐徐注入注中，并同時(shí)打開下端螺旋夾，讓洗脫劑緩緩流出，不斷用手輕輕振動(dòng)玻璃柱，使氧化鋁沉降均勻。當(dāng)柱內(nèi)液面接近氧化鋁柱面時(shí)，關(guān)閉螺旋夾。（2） 樣品的加入稱取50-100mg鹽酸小檗堿，加少量95%乙醇于水浴上加熱溶解，用滴管沿層析管壁小心加入，勿使氧化鋁柱面受到振動(dòng)。找開螺旋夾，當(dāng)液體表面下降接觸氧化鋁時(shí)，關(guān)閉螺旋夾。（3）洗脫用滴管吸取95%乙醇，經(jīng)管壁輕輕加入柱內(nèi)，打開螺旋夾，控制流速20-30滴/分鐘，不斷加入洗脫劑，使洗脫劑的液面始終高于氧化鋁。待氧化鋁柱上呈現(xiàn)數(shù)段不同顏色的色帶時(shí)，繼續(xù)沖洗，使其彼此分離，并收集鮮黃色帶，此段為鹽酸小檗堿，其余色帶為其它成分。5、薄層層析鑒定薄層板：硅膠G-CMC板樣品：實(shí)驗(yàn)所得精制鹽酸小檗堿的醇溶液對(duì)照品：1%鹽酸小檗堿的醇溶液展開劑：氯仿：甲醇=7：2，氨水飽和20分鐘展距：10cm顯色：自然光下觀察結(jié)果：計(jì)算Rf值五、實(shí)驗(yàn)說明及注意事項(xiàng)1、整個(gè)操作過程，氧化鋁柱表面應(yīng)保持一定高度的溶劑（洗脫劑），不得使柱面溶劑流干。2、一般采用等量收集洗脫液流份。每份洗脫劑體積的毫升數(shù)，一般與吸附劑重量相近。如果洗脫劑極性較大或樣品各組份結(jié)構(gòu)相近似時(shí)，每份收集量要?。?、洗脫時(shí)流速不宜過快，太快時(shí)柱中交換來不及達(dá)到平衡，影響分離效果；4、由于氧化鋁表面活性較大，有時(shí)會(huì)促使某些成分發(fā)生變化，應(yīng)在短時(shí)間內(nèi)完成一個(gè)柱層析的分離，以免樣品在柱上起異構(gòu)化、氧化、皂化、水合以及脫氫形成雙鍵等反應(yīng)。樣品在柱上會(huì)擴(kuò)散也會(huì)影響分離效果。5、氧化鋁的粒度一般為100-200目，用量一般為樣品量的20-50倍，根據(jù)被分離的化合物而定，有時(shí)可達(dá)100-200倍。硅膠吸附柱層析粒度一般為100-160目或160目以上，用量為樣品量的30-60倍，較難分離的化合物可選用500-1000倍。六、思考題1、采用柱層析分離時(shí)應(yīng)注意哪些方面的問題？2、為什么本實(shí)驗(yàn)采用氧化鋁而不采用硅膠作吸附劑？實(shí)驗(yàn)三 槐花米中蘆丁的提取、分離與鑒定蘆?。≧utin）廣泛存在于植物界中，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)含蘆丁的植物至少在70種以上，如煙葉、槐花、蕎麥和蒲公英中均含有。尤以槐花米（為植物Sophora japonica的未開放的花蕾）和蕎麥中含量最高，可作為大量提取蘆丁的原料?；被诪槎箍浦参锘被ǖ奈撮_放花蕾。味苦性涼，具清熱、涼血、止血之功?；被ǖ闹饕瘜W(xué)成分為蘆丁，又名蕓香甙，含量可達(dá)12-16%。蘆丁是由槲皮素（Quercetin）3位上的羥基與蕓香糖（Rutinose）為葡萄糖（Glucose）與鼠李糖（Rhamnose）組成的雙糖脫水合成的苷。為淺黃色粉末或極細(xì)的針狀結(jié)晶，含有三分子的結(jié)晶水，熔點(diǎn)為174178，無水物188190。溶解度：冷水中為1:10000；熱水中1:200；冷乙醇1:650；熱乙醇1:60；冷吡啶1:12。微溶于丙酮、乙酸乙酯，不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚，溶于堿而呈黃色。 蘆丁具有維生素P樣作用?？山档兔?xì)管前壁的脆性和調(diào)節(jié)滲透性，有助于保持及恢復(fù)毛細(xì)血管的正常彈性，臨床上用作毛細(xì)管脆性引起的出血癥，并常用作防治高血壓病的輔助治療劑?，F(xiàn)在國處也常用蘆丁作食品及飲料的染色劑。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過蘆丁的提取與精制掌握堿-酸法提取黃酮類化合物的原理及操作。2掌握蘆丁的一種提取、精制方法及提制過程中防止甙水解的方法。3. 掌握黃酮甙水解生成甙元的方法及二者之間的分離。4熟悉蘆丁、槲皮素的結(jié)構(gòu)性質(zhì)、檢識(shí)方法和紙層析鑒定方法。二、實(shí)驗(yàn)原理本實(shí)驗(yàn)主要是利用蘆丁中含有較多的酚羥基，可溶于堿中，加酸酸化后又可析出蘆丁結(jié)晶的性質(zhì)，采用堿溶酸沉法提取，并用蘆丁對(duì)冷、熱水的溶解度相差懸殊的特性進(jìn)行精制。蘆丁可被稀酸水解，生成槲皮素及葡萄糖、李糖，并能通過紙層析鑒定。蘆丁及槲皮素還可通過化學(xué)反應(yīng)及紫外光譜鑒定。三、實(shí)驗(yàn)材料槐米、活性炭、石灰乳、0.4硼砂水溶液、2的硫酸溶液、濃鹽酸、正丁醇、冰醋酸、蒸餾水、1的氫氧化鈉溶液、1的三氯化鋁乙醇溶液、1槲皮素乙醇溶液、95乙醇、廣泛pH試紙、中速層析濾紙等。四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容（一）提?。悍Q取槐米30g，在乳缽中研碎后，投入300ml0.4硼砂溶液的沸水溶液中煮沸2-3分鐘，在攪拌下加入石灰乳調(diào)pH9，煮沸40分鐘（注意添加水，保持原有體積，保持pH89），趁熱傾出上清液，用棉花過濾（或用四層紗布過濾）。殘?jiān)?00ml水，加石灰乳調(diào)pH9，煮沸30分鐘，趁熱用棉花過濾（或用四層紗布過濾），二次濾液合并。濾液保持在60，加濃HCl，調(diào)pH2-3，放置過夜，待析出結(jié)晶，過濾，濾餅用蒸餾水洗至pH5-6，抽干，置空氣中晾干，得粗制蘆丁，稱重，計(jì)算得率。（二）精制：將蘆丁粗品懸浮于蒸餾水中，煮沸至蘆丁全部溶解，加少量活性炭，煮沸5-10分鐘，趁熱抽濾，冷卻后即可析出結(jié)晶，抽濾至干，置空氣中晾干，或6070干燥，得精制蘆丁，稱重，計(jì)算得率。（三）蘆丁的水解：取蘆丁1g，研碎，加2硫酸水溶液80ml，小火加熱，微沸回流30-60min，并及時(shí)補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水分。在加熱過程中，開始時(shí)溶液呈渾濁狀態(tài)，約10min后，溶液由渾濁轉(zhuǎn)為澄清，逐漸析出黃色小針狀結(jié)晶，即水解產(chǎn)物槲皮素，繼續(xù)加熱至結(jié)晶物不再增加時(shí)為止。抽濾，保留濾液20ml，以檢查濾液中的單糖。所濾得的槲皮素粗晶水洗至中性，加70乙醇80ml加熱回流使之溶解，趁熱抽濾，放置析晶。抽濾，得精制槲皮素。減壓下110干燥，可得槲皮素?zé)o水物。（四）蘆丁、槲皮素及糖的檢識(shí)1顏色反應(yīng) -萘酚-濃硫酸（Molisch）試驗(yàn)：取蘆丁少許置于試管中，加乙醇1ml振搖，加-萘酚試劑23滴振搖，傾斜試管，沿管壁徐徐加入0.5ml濃硫酸，靜置，觀察兩層溶液界面變化，出現(xiàn)紫紅色環(huán)者為陽性反應(yīng)，表示試樣的分子中含有糖的結(jié)構(gòu)，糖和甙類均呈陽性反應(yīng)，比較蘆丁和槲皮素的不同。鹽酸-鎂粉試驗(yàn)：取蘆丁少許置于試管中，加5乙醇2ml，在水浴中加熱溶解，滴加濃鹽酸2滴，再加鎂粉約50mg，即產(chǎn)生劇烈的反應(yīng)。溶液逐漸由黃色變?yōu)榧t色。 三氯化鐵試驗(yàn) 取樣品水或乙醇液，加入三氯化鐵試劑數(shù)滴，觀察顏色變化。三氯化鋁試驗(yàn)：取蘆丁少許置于試管中，加入甲醇12ml，在水浴中加熱溶解，加1三氯化鋁甲醇試劑23滴，呈鮮黃色。以同樣方法試驗(yàn)槲皮素。醋酸鎂試驗(yàn)：取蘆丁少許置于試管中，加入甲醇12ml，在水浴中加熱溶解，加1醋酸鎂甲醇試劑23滴，呈黃色熒光反應(yīng)。以同樣方法試驗(yàn)槲皮素（反應(yīng)也可在濾紙上進(jìn)行，觀察熒光）。 氧氯化鋯-枸櫞酸試驗(yàn)：取蘆丁少許置于試管中，加甲醇12ml，在水浴上加熱溶解，再加2氧氯化鋯甲醇試劑34滴，呈鮮黃色。然后加2%枸櫞酸甲醇試劑34滴，黃色變淺，加蒸餾水稀釋變無色。以同樣方法試驗(yàn)槲皮素進(jìn)行對(duì)照。 氫氧化鈉試驗(yàn)：取蘆丁少許置于試管中，加水2ml振搖，觀察試管中有無變化。滴加1氫氧化鈉溶液數(shù)滴，振搖使溶解，呈黃色澄清溶液。再加入1鹽酸溶液數(shù)滴使呈酸性反應(yīng)，則溶液由澄清轉(zhuǎn)為渾濁狀態(tài)。2色譜檢識(shí)(1) 槲皮素和蘆丁的薄層鑒定聚酰胺薄層色譜： 固定相：聚酰胺薄層板樣品：a 精制蘆丁 b 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 c 精制槲皮素展開劑：氯仿-甲醇-丁酮-乙酰丙酮：(16：10：5：1)顯色：a 可見光下觀察色斑，再于紫外燈下觀察熒光斑點(diǎn)b 噴灑AlCl3乙醇液后觀察。硅膠薄層色譜吸附劑：硅膠G，105下活化2h展開劑：a.氯仿：甲醇：甲酸（15：5：1）b.氯仿：丁酮：甲酸（5：3：1）顯色劑：1%FeCl3和1%K3Fe(CN)6水溶液，應(yīng)用時(shí)等體積混合。(2) 蘆丁和槲皮素的紙色譜檢識(shí)：支持劑：新華層析濾紙（中速、20cm7cm）樣 品：自制1蘆丁乙醇溶液對(duì)照品：1槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品與1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品乙醇溶液展開劑：a. 正丁醇：冰醋酸：水（4：1：5上層） b. 15醋酸水溶液展距：10-15cm顯色：a. 在可見光下觀察斑點(diǎn)顏色，再在紫外燈下觀察斑點(diǎn)顏色 b. 噴三氯化鋁試劑呈黃色斑點(diǎn)c經(jīng)氨氣熏后再于可見、紫外下觀察。(3) 糖的紙色譜檢識(shí)：取上述蘆丁水解后的母液20ml，加入氫氧化鋇細(xì)粉（約2.6g）中和至pH7，濾除生成的硫酸鋇沉淀（可用滑石粉助濾）。濾液中水浴中濃縮至12ml，供紙色譜點(diǎn)樣用。支持劑：新華層析濾紙（中速、20cm7cm）樣 品：水解濃縮液對(duì)照品：a. 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品水溶液 b. 鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)品水溶液展開劑：正丁醇：冰醋酸：水（4：1：5上層）顯 色：a. 噴苯胺-鄰苯二甲酸試劑，于105加熱10min，顯棕色或棕紅色斑點(diǎn) b.噴氨性硝酸銀試劑，于100左右加熱，呈棕褐色斑點(diǎn)。五、實(shí)驗(yàn)說明及注意事項(xiàng)1本實(shí)驗(yàn)采用堿溶酸沉法從槐米中提取蘆丁，收率穩(wěn)定，且操作簡(jiǎn)便。在提取前應(yīng)注意將槐米略搗碎，使蘆丁易于被熱水溶出?；被ㄖ泻写罅空骋嘿|(zhì)，加入石灰乳使生成鈣鹽沉淀除支。pH應(yīng)嚴(yán)格控制在8-9，不得超過10。因?yàn)樵趶?qiáng)堿條件下煮沸，時(shí)間稍長(zhǎng)可促使蕓香甙水解破壞，使提取率明顯下降。酸沉一步pH為2-3，不宜過低，否則會(huì)使蕓香甙形成鹽溶于水，降低了收率。2提取過程中加入硼砂水的作用：即能調(diào)節(jié)堿性水溶液的pH，又能保護(hù)蕓香甙分子中的鄰二酚羥基不被氧化，亦保護(hù)鄰二酚羥基不與鈣離子絡(luò)合，使蕓香甙不受損失。3蕓香甙的提取方法除了用堿溶酸沉法外，還可利用蕓香甙在冷水及沸水中的溶解度不同，采用沸水提取法。又報(bào)道將生產(chǎn)工藝改進(jìn)為95%乙醇回流提取后回收醇得浸膏，然后將粗浸膏經(jīng)除去脂溶性雜質(zhì)后，用水洗凈，過濾，干燥即得蕓香甙，可提高收率696%，并降低了成本。因此可根據(jù)不同原料采用各種不同方法提取。4槲皮素以乙醇重結(jié)晶時(shí)，如所用的乙醇濃度過高（90以上），一般不易析出結(jié)晶。此時(shí)可于乙醇溶液中滴加適量蒸餾水，使呈微濁狀態(tài)，放置，槲皮素即可析出。六、思考題1本實(shí)驗(yàn)提取過程中應(yīng)注意哪些問題？2根據(jù)蘆丁的性質(zhì)還可采用何種方法進(jìn)行提?。亢?jiǎn)要說明理由。七、參考文獻(xiàn)1海藥物研究所：中草藥有效成分的提取和分離 234240頁2中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所：中草藥有效成分的研究(第一分冊(cè))219225 19723日本藥學(xué)雜志，72(333) 1952；76(1210) 1956，80(304) 1960；80(698) 19604Chem， Pharm Bull， ll (167)， 1963附錄：一、薄層的制備實(shí)驗(yàn)材料：硅膠G500g1瓶羧甲基纖維素鈉500g1瓶托盤分析天