引物設(shè)計(jì)需要注意事項(xiàng).doc

引物設(shè)計(jì)需要注意事項(xiàng)一、PCR引物設(shè)計(jì)的11條黃金法則1.引物最好在模板cDNA的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)。DNA序列的保守區(qū)是通過(guò)物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過(guò)序列分析軟件（比如DNAman）比對(duì)（Alignment），各基因相同的序列就是該基因的保守區(qū)。2.引物長(zhǎng)度一般在1530堿基之間。引物長(zhǎng)度（primer length）常用的是18-27 bp，但不應(yīng)大于38，因?yàn)檫^(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74，不適于Taq DNA 聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。3.引物GC含量在40%60%之間，Tm值最好接近72。GC含量（composition）過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動(dòng)溫度，一般高于Tm值510。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估計(jì)引物的Tm值，則有效引物的Tm為5580，其Tm值最好接近72以使復(fù)性條件最佳。4.引物3端要避開密碼子的第3位。如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì)影響擴(kuò)增的特異性與效率。5.引物3端不能選擇A，最好選擇T。引物3端錯(cuò)配時(shí)，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當(dāng)末位的堿基為A時(shí)，即使在錯(cuò)配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當(dāng)末位鏈為T時(shí)，錯(cuò)配的引發(fā)效率大大降低，G、C錯(cuò)配的引發(fā)效率介于A、T之間，所以3端最好選擇T。6. 堿基要隨機(jī)分布。引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒(méi)有相似性較高，尤其是3端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)（False priming）。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3端不應(yīng)超過(guò)3個(gè)連續(xù)的G或C，因這樣會(huì)使引物在GC富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。7. 引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列。引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)（Hairpin）使引物本身復(fù)性。這種二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。兩引物之間也不應(yīng)具有互補(bǔ)性，尤其應(yīng)避免3 端的互補(bǔ)重疊以防止引物二聚體（Dimer與Cross dimer）的形成。引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)如果不可避免的話，應(yīng)盡量使其G值不要過(guò)高（應(yīng)小于4.5kcal/mol）。否則易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR 反應(yīng)不能正常進(jìn)行。8. 引物5 端和中間G值應(yīng)該相對(duì)較高，而3 端G值較低。G值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能，它反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性，G值越大，則雙鏈越穩(wěn)定。應(yīng)當(dāng)選用5 端和中間G值相對(duì)較高，而3 端G值較低（絕對(duì)值不超過(guò)9）的引物。引物3 端的G 值過(guò)高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)。（不同位置的G值可以用Oligo 6軟件進(jìn)行分析）9.引物的5端可以修飾，而3端不可修飾。引物的5 端決定著PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，它對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5 端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入點(diǎn)突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動(dòng)子序列等。引物的延伸是從3 端開始的，不能進(jìn)行任何修飾。3 端也不能有形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)可能。10. 擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。某些引物無(wú)效的主要原因是擴(kuò)增產(chǎn)物單鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴(kuò)增片段時(shí)最好避開二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)軟件（比如RNAstructure）可以預(yù)測(cè)估計(jì)mRNA的穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。實(shí)驗(yàn)表明，待擴(kuò)區(qū)域自由能（G）小于58.6l kJ/mol時(shí)，擴(kuò)增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時(shí)，用7-deaza-2-脫氧GTP取代dGTP對(duì)擴(kuò)增的成功是有幫助的。11. 引物應(yīng)具有特異性。引物設(shè)計(jì)完成以后，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行BLAST檢測(cè)。如果與其它基因不具有互補(bǔ)性，就可以進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)了。 值得一提的是，各種模板的引物設(shè)計(jì)難度不一。有的模板本身?xiàng)l件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導(dǎo)致找不到各種指標(biāo)都十分合適的引物；用作克隆目的的PCR，因?yàn)楫a(chǎn)物序列相對(duì)固定，引物設(shè)計(jì)的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。PCR引物設(shè)計(jì)的目的是為了找到一對(duì)合適的核苷酸片段，使其能有效地?cái)U(kuò)增模板DNA序列。因此，引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性與成功與否。 要設(shè)計(jì)引物首先要找到DNA序列的保守區(qū)。同時(shí)應(yīng)預(yù)測(cè)將要擴(kuò)增的片段單鏈?zhǔn)欠裥纬啥?jí)結(jié)構(gòu)。如這個(gè)區(qū)域單鏈能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，就要避開它。如這一段不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，那就可以在這一區(qū)域設(shè)計(jì)引物。一般引物長(zhǎng)度為1530堿基，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為100600堿基對(duì)。讓我們先看看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般為40%60%。而且四種堿基的分布最好隨機(jī)。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否則P1引物設(shè)計(jì)的就不合理。應(yīng)重新尋找區(qū)域設(shè)計(jì)引物。同時(shí)引物之間也不能有互補(bǔ)性，一般一對(duì)引物間不應(yīng)多于4個(gè)連續(xù)堿基的互補(bǔ)。 引物確定以后，可以對(duì)引物進(jìn)行必要的修飾，例如可以在引物的5端加酶切位點(diǎn)序列；標(biāo)記生物素、熒光素、地高辛等，這對(duì)擴(kuò)增的特異性影響不大。但3端絕對(duì)不能進(jìn)行任何修飾，因?yàn)橐锏难由焓菑?端開始的。這里還需提醒的是3端不要終止于密碼子的第3位，因?yàn)槊艽a子第3位易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì)影響擴(kuò)增的特異性與效率。 綜上所述我們可以歸納十條PCR引物的設(shè)計(jì)原則： 引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性。 產(chǎn)物不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。 引物長(zhǎng)度一般在1530堿基之間。 G+C含量在40%60%之間。 堿基要隨機(jī)分布。 引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。 引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。 引物5端可以修飾。 引物3端不可修飾。 引物3端要避開密碼子的第3位。二、引物的二次篩選引物的二次篩選是指在初次篩選出的幾對(duì)引物中進(jìn)一步篩選出適合我們進(jìn)行特異、高效PCR擴(kuò)增的那對(duì)引物。本步應(yīng)注意以下兩點(diǎn)， 一是得到的一系列引物分別在Genebank中進(jìn)行回檢。也就是把每條引物在比對(duì)工具(/blast/) 的blastnr中進(jìn)行同源性檢索，棄掉與基因組其它部分同源性比較高的引物，也就是有可能形成錯(cuò)配的引物。一般連續(xù)10 bp以上的同源有可能形成比較穩(wěn)定的錯(cuò)配，特別是引物的3端應(yīng)避免連續(xù)5-6 bp的同源。二是以mRNA為模板設(shè)計(jì)引物時(shí)要先利用生物信息學(xué)的知識(shí)大致判斷外顯子與內(nèi)含子的剪接位點(diǎn)(例如http:/CCR-081./GENESCAN.html的GENESCAN工具或者GeneParser軟件，然后棄掉正好位于剪接位點(diǎn)的引物。三、引物的最終評(píng)估當(dāng)我們經(jīng)過(guò)初次篩選和二次篩選后得到的那對(duì)引物便可以用于合成，合成后我們經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增可以對(duì)引物進(jìn)行最終的評(píng)估。一是PCR擴(kuò)增的特異性和效率。經(jīng)過(guò)PCR條件優(yōu)化后能否獲得特異性條帶，即無(wú)目的條帶之外的多余