林木病理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院林木病理學(xué)課程組.doc

河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院林木病理學(xué)課程組2006年6月實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)一、進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室必須遵守紀(jì)律，保持室內(nèi)整潔安靜。二、每次實(shí)驗(yàn)前必須仔細(xì)閱讀實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)和有關(guān)的內(nèi)容，以保證實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。 三、實(shí)驗(yàn)時(shí)樹(shù)立嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度，完全按照實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)所列操作步驟認(rèn)真進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和觀察。四、愛(ài)護(hù)實(shí)驗(yàn)儀器，節(jié)約使用實(shí)驗(yàn)用具和材料，如有損壞和故障，務(wù)必報(bào)告指導(dǎo)教師，凡無(wú)故損壞儀器設(shè)備者應(yīng)予賠償。五、實(shí)驗(yàn)完畢時(shí)，請(qǐng)將儀器放回原處，擦凈桌面，收拾整齊。按作業(yè)要求寫(xiě)出實(shí)驗(yàn)報(bào)告，方可離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室。離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室前注意關(guān)門(mén)、窗、水、燈等，并用肥皂洗手。六、每個(gè)學(xué)生的實(shí)驗(yàn)成績(jī)由實(shí)驗(yàn)過(guò)程表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)報(bào)告成績(jī)兩部分組成，實(shí)驗(yàn)成績(jī)將帶入期末總成績(jī)。七、需要進(jìn)一步培養(yǎng)觀察的實(shí)驗(yàn)材料應(yīng)寫(xiě)好標(biāo)簽，注明實(shí)驗(yàn)內(nèi)容、日期和試驗(yàn)人員姓名，以防混淆或丟失。八、學(xué)生應(yīng)準(zhǔn)備繪圖紙、報(bào)告紙、HB和2H的繪圖鉛筆、直尺、小刀和橡皮等繪圖用具。林木病理學(xué)實(shí)驗(yàn)指南 林木病理學(xué)實(shí)驗(yàn)是農(nóng)業(yè)植物病理學(xué)課程的重要組成部分，是植物病理學(xué)基本概念、基礎(chǔ)理論、基本原理的深化理解、實(shí)驗(yàn)應(yīng)證、增強(qiáng)感性認(rèn)識(shí)和銜接補(bǔ)充，是理論與實(shí)踐相結(jié)合的具體體現(xiàn)。對(duì)學(xué)好林木病理學(xué)具有重要意義。 林木病理學(xué)實(shí)驗(yàn)的目的是以植物病理學(xué)和其它關(guān)學(xué)科知識(shí)為基礎(chǔ)，追溯引起植物病害發(fā)生的原因及過(guò)程，認(rèn)識(shí)不同病原所致病害的癥狀特點(diǎn)及病原形態(tài)特征。掌握植物病害實(shí)驗(yàn)及研究的基本技能及方法，注重學(xué)生觀察、思考、分析、解決實(shí)際問(wèn)題的能力培養(yǎng)，為將來(lái)的研究工作打下一定的基礎(chǔ)。林木病理學(xué)實(shí)驗(yàn)要求學(xué)生在實(shí)驗(yàn)之前預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，明確實(shí)驗(yàn)的目的意義，復(fù)習(xí)實(shí)驗(yàn)相關(guān)理論知識(shí)，了解實(shí)驗(yàn)的方法、步驟及重難點(diǎn)；認(rèn)真、客觀、正確地、觀察、記錄實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和顯微繪圖，整理、歸納，分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和結(jié)果，認(rèn)真完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告，總結(jié)成功的經(jīng)驗(yàn)及找出不足的原因，培養(yǎng)科學(xué)態(tài)度。實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)要求學(xué)生認(rèn)知和掌握主要作物、果樹(shù)和蔬菜病害的癥狀和病原物的形態(tài)特點(diǎn)、學(xué)習(xí)顯微繪圖、制片技術(shù)；綜合性實(shí)驗(yàn)要求學(xué)生學(xué)習(xí)和掌握從植物病害的調(diào)查、標(biāo)本的采集、鑒定到滅菌、消毒、培養(yǎng)基制作及病原物的分離和培養(yǎng)等實(shí)驗(yàn)技能。該實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)對(duì)癥狀和病原形態(tài)特征進(jìn)行了描述，通過(guò)提示對(duì)重點(diǎn)觀察內(nèi)容與闡明并對(duì)實(shí)驗(yàn)技能進(jìn)行了簡(jiǎn)述。作業(yè)與思考題，主要是實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的課堂作業(yè)及復(fù)習(xí)時(shí)的參考。實(shí)驗(yàn)一 林木病害癥狀類型的觀察癥狀是有病植物外部可見(jiàn)的病狀和病征的統(tǒng)稱。植物生病后，有一定的病理變化程序。無(wú)論是侵染性病害或非浸染性病害，首先在植物體內(nèi)發(fā)生一系列外部觀察不到的生理生化的變化，繼而細(xì)胞和組織開(kāi)始發(fā)生病變，并出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)到的變化這就是病狀。有些侵染性病害，主要是真菌和細(xì)菌病害，不僅表現(xiàn)出病狀，在病部還能見(jiàn)到引起植物生病的病原物，它們依附在病植物體人例如，病植物上的霜霉、白粉、黑粉、茵核、茵膿以及寄生在植物上的寄生性種子植物等。這些致病生物出現(xiàn)在病變部分即稱“病征”。所以，植物病害的癥狀應(yīng)該包括“病征”和“病狀”面部分。但是，植物受病毒、菌原體、類細(xì)菌和線蟲(chóng)等危害后，只能看到植物本身的病狀，這些病害習(xí)慣上也統(tǒng)稱為癥狀。人們對(duì)病害的認(rèn)識(shí)和研究，機(jī)首先從癥狀開(kāi)始，癥狀有一定的變化幅度，常因品種抗性、環(huán)境條件以及發(fā)病時(shí)期(或后期)不同而有變化，因此觀察病害癥狀應(yīng)連續(xù)觀察它在不同時(shí)期和不同條件下的表現(xiàn)。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)植物病害癥狀的觀察，學(xué)習(xí)描述和記載植物病害癥狀的方法，掌握植物病害的癥狀類型、特點(diǎn)以及了解癥狀在病害診斷中的作用。加深對(duì)植物病害的感性認(rèn)識(shí)，認(rèn)識(shí)植物病害的主要癥狀類型，為進(jìn)一步診斷和研究植物病害打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。二、材料和用具 各種類型的病害標(biāo)本、幻燈片和掛圖等。擴(kuò)大鏡、小刀及記載用具。 三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法（一）病狀類型 1. 變色：植物受到外來(lái)有害因素的影響后，常導(dǎo)致色澤的改變，如褪色、條點(diǎn)、白化、色澤變深或變淺等，統(tǒng)稱為變色。主要表現(xiàn)有：1) 褪綠或黃化：褪綠和黃化是由于葉綠素的減少而葉片表現(xiàn)為淺綠色或黃色。如植物的缺鐵、缺氮等。 2) 花葉與班駁：如蘋(píng)果花葉病、月季花葉病、黃楊花葉病等。3) 變紅色或紫色，如玉米植物生病后，病部細(xì)胞內(nèi)的葉綠素被破壞或形成受到抑制而呈現(xiàn)出不正常的顏色。變色以葉片變色為最常見(jiàn)，通常為全株性的，葉片顏色深淺不勻、深綠淺綠或黃綠相嵌，有時(shí)還出現(xiàn)紅紫等顏色?；ǘ渥兩诹帜局谐Ｒ?jiàn)的有郁金香碎錦病，缺素和病毒侵染都可以形成這種癥狀。觀察標(biāo)本：蘋(píng)果花葉病 月季花葉病 大葉黃楊花葉病 楊樹(shù)花葉病2、壞死和腐爛： 壞死是由于受病植物組織和細(xì)胞的死亡而引起的。1) 斑點(diǎn)：根、莖、葉、花、果實(shí)的病部局部組織或細(xì)胞壞死產(chǎn)生各種形狀和大小顏色不同的斑點(diǎn)，如大葉黃楊葉斑病、月季黑斑病、山柳漆斑病、柿（黑棗）角斑病、柿園斑病。2) 枯死：芽、葉、枝、花局部或大部分組織發(fā)生變色、焦枯死亡。如丁香疫病、核桃枝枯病。3) 穿孔和落葉落果：在病斑外圍的組織形成離層，使病斑從健康組織中脫落下來(lái)，形成穿孔，如桃細(xì)菌性穿孔病等；有些植物的花、葉、果等受害后，在葉柄或果梗附近產(chǎn)生離層而引起過(guò)早的落葉、落果等。4) 瘡痂：果實(shí)、嫩枝、塊莖等的受病組織局部木栓化，表面粗糙，病部較淺，如柑桔瘡痂病、梨黑星病等。 5) 潰瘍：病部深入到皮層，組織壞死或腐爛，病部面積大，稍凹陷，周圍的寄主細(xì)胞有時(shí)增生和木栓化，多見(jiàn)于木本植物的枝干上的潰瘍癥狀。如楊樹(shù)潰瘍病、楊樹(shù)腐爛病、柑桔潰瘍病、番茄潰瘍病等。觀察標(biāo)本：蘋(píng)果腐爛病、楊樹(shù)腐爛病。6）果實(shí)腐爛：如蘋(píng)果炭疽病。觀察標(biāo)本：蘋(píng)果炭疽病。3、萎蔫：植物莖部腐爛，根部壞死都能引起萎蔫。典型的萎蔫是指植物根部或莖部的維管束組織受到侵染而發(fā)生的萎蔫現(xiàn)象根據(jù)受害的部位不同，萎蔫可以是全株性的或是局部性的。觀察標(biāo)本：落葉松枯梢病，苗木立枯病 ；4、畸形：感病植物受病原物刺激，細(xì)胞和組織過(guò)度增生或發(fā)育不良，形成腫瘤叢枝、卷葉、扭曲、矮化等觀察標(biāo)本：根癌病、泡桐叢枝病、棗瘋病、桃縮葉?。ǘ┎≌黝愋?病征是指在植物病部形成的、肉眼可見(jiàn)的病原物的結(jié)構(gòu)。識(shí)別各種不同類型的病征對(duì)診斷病害很有幫助。細(xì)菌性病害，通常是在受傷的病部出現(xiàn)粘稠的液體菌膿。但真菌在病部產(chǎn)生的病征較復(fù)雜依其形態(tài)不同，可區(qū)分為多種類型：大致分為霜狀物、粉狀物、霉?fàn)钗?、銹狀物、小黑粒和線狀物，塊狀物、傘狀物等，并常以這些特征來(lái)命名這些病害。有些類型的病征可根據(jù)其他特征進(jìn)一步區(qū)分，如粉狀物可根據(jù)其色澤不同，分為白粉、黑粉等。霉?fàn)钗铮汗项惛共?、柑桔青霉病、紫薇煤污病、夾竹桃煤污病粉狀物，山楂白粉病、黃櫨白粉病、蘋(píng)果白粉病、丁香白粉病、小麥黑粉病銹狀物：牽牛花白銹病，玫瑰銹病、蘋(píng)果銹病、馬蘭銹病 煤污狀物，茶煤污、桑污葉病、油茶煤污病。塊狀物：菌核，白絹菌引起的絲核立枯病、白絹病線狀物：果樹(shù)根朽病、根狀菌索、紫紋羽病點(diǎn)狀物：病原真菌在病部產(chǎn)生的黑色、褐色小點(diǎn)，多為真菌的繁殖體觀察標(biāo)本：核桃枝枯病、蘋(píng)果腐爛病、月季黑斑病、楊樹(shù)腐爛病傘狀物、馬蹄狀物：病原真菌在病部產(chǎn)生的大型子實(shí)體，多為擔(dān)子菌亞門(mén)，如木耳、銀耳、平茹、靈芝、草菇、松白腐病的子實(shí)體。膿狀物：細(xì)菌病害特有病癥 （三）綜合癥 在同一寄主植物上一種病害可能表現(xiàn)出幾種癥狀類型，這幾種癥狀同時(shí)表現(xiàn)或先后接連表現(xiàn)出來(lái)，稱為綜合癥。例如大豆花葉病毒病可以有變色、花葉、頂芽壞死和畸形等幾種類型的癥狀在同一植株上出現(xiàn)。水稻白葉枯病可以有葉枯、枯心、黃葉等癥狀在同一植株上出現(xiàn)。掌握這些癥狀特征對(duì)于正確診斷病害是十分重要購(gòu)。 （四）復(fù)合癥 由兩種或兩種以上的病原物(或害蟲(chóng))同時(shí)或先后侵染寄主而表現(xiàn)的復(fù)合癥狀。四、實(shí)驗(yàn)時(shí)間 2學(xué)時(shí)。五、作業(yè)與思考題作業(yè)：根據(jù)溫室和田間的參觀，實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本的觀察以及幻燈片、照片等觀察到的不同癥狀類型的病害，扼要描述其癥狀特點(diǎn)，將觀察結(jié)果填入下表 (要求至少描述六種病害)寄主名稱病害名稱發(fā)病部位病狀類型病癥類型思考題：1) 植物病害的定義是什么? ，2) “病狀”、“病征”“癥狀”、“綜合癥的定義，并舉例說(shuō)明。3) 癥狀在病害診斷上有什么作用？4) 為什么種病害可以表現(xiàn)出不同的癥狀?實(shí)驗(yàn)二 鞭毛菌、接合菌、子囊菌亞門(mén)真菌及所致病害鞭毛菌亞門(mén)真菌是一類低等真菌，其中多數(shù)是水生的。它們的共同特征是無(wú)性繁殖時(shí)產(chǎn)生有鞭毛的游動(dòng)孢子。主要引起苗木猝倒病、白銹和霜霉。接合菌亞門(mén)真菌人多數(shù)是腐生的，少數(shù)可以引起農(nóng)產(chǎn)品的腐爛。其中最重要的是根霉屬(Rhizopus)的匍枝根霉(R.stolomifer)可引起種實(shí)霉?fàn)€。子囊菌是一類高等真菌。菌絲體一般都很發(fā)達(dá)，有隔膜，有分枝，有的菌絲體可以形成菌核、子座等機(jī)構(gòu)。子囊菌的共同特點(diǎn)是有性生殖產(chǎn)生子囊和子囊孢子。子囊菌亞門(mén)是根據(jù)子囊果的有無(wú)、子囊果的形態(tài)特征、子囊著生位置、子囊孢子的特征進(jìn)行分類的。子囊菌所致的病害很多，其中代表性的病害有核果類縮葉病、各種植物的白粉病、黑斑病、赤霉病、蘋(píng)果腐爛病、蘋(píng)果黑星病和菌核病等。一、目的要求 通過(guò)觀察，認(rèn)識(shí)病原真菌的營(yíng)養(yǎng)體及其變態(tài)，認(rèn)識(shí)真菌的子實(shí)休、有性繁殖、無(wú)性繁殖產(chǎn)生的各種類型孢子，掌握各亞門(mén)的主要特征。二、用具 挑針、刀片、木板、酒精燈、火柴、載玻片、蓋玻片、紗布、乳酚油、二甲苯、顯微鏡、擦鏡紙、吸水紙等。有關(guān)病害的標(biāo)本、掛圖、幻燈片三、內(nèi)容與方法（一） 病原真菌的營(yíng)養(yǎng)體真菌營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段的結(jié)構(gòu)統(tǒng)稱為真菌的營(yíng)養(yǎng)體。典型的營(yíng)養(yǎng)體是絲狀，少數(shù)為單細(xì)胞。單根絲狀的營(yíng)養(yǎng)體稱為菌絲；許多菌絲在一起就稱為菌絲體。用挑針挑取在培養(yǎng)皿內(nèi)的瓜果腐霉病菌(Pythium aphanidermatum)和立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)或鐮刀菌的菌絲體用蒸餾水或乳酚油作浮載劑，制臨時(shí)破片鏡檢，觀察菌絲有無(wú)隔膜?菌絲體直徑變化是否明顯？顏色有無(wú)差別？（二） 鞭毛菌亞門(mén) 卵菌綱有發(fā)達(dá)的菌絲體，菌絲沒(méi)有隔膜。無(wú)性繁殖形成游動(dòng)孢子囊,其中產(chǎn)生多個(gè)游動(dòng)孢子。1）霜霉目 許多霜霉目真菌是更要的植物病原菌，無(wú)性繁殖通常產(chǎn)生卵形或梨形的抱子囊。孢子囊成熟十可釋放游動(dòng)孢子，或直接萌發(fā)形成芽管,游動(dòng)孢子無(wú)兩游現(xiàn)象。藏卵器內(nèi)只有一個(gè)卵球。霜霉科主要屬的檢索表A孢囊梗粗壯，上部為重復(fù)23次的不規(guī)則二叉分枝指梗霉屬(Sclerospora)AA孢囊梗較細(xì)BB孢囊梗單軸分枝,小枝與主軸成直角，分枝末端平純單軸霉屬(Plasompara)BB。孢囊梗成銳角二叉分枝CC分枝兩側(cè)不對(duì)稱，頂端尖銳假霜霉屬(Pseudoperonospora)CC分枝兩側(cè)對(duì)稱DD分技頂端尖細(xì)霜霉屬(Peronospora)DD分枝頂細(xì)，具34個(gè)指狀周生小梗 盤(pán)梗霉屬(Bremia)（三） 接合菌亞門(mén)1匍枝根霉菌的鏡檢 觀察菌絲、假根孢子囊、孢囊孢子 用挑針仔細(xì)地從培養(yǎng)的匍枝根霉菌中挑取少許連有培養(yǎng)基培養(yǎng)物，制成臨時(shí)玻片，在低倍鏡下檢查。觀察菌絲的形態(tài)和具有35個(gè)分枝的孢囊及其基部的假根，從孢囊梗之間有匍枝狀的菌絲相連，在孢囊?；坑猩钊爰闹骷?xì)胞或基質(zhì)中分枝狀的假根，起吸收營(yíng)養(yǎng)和固定孢囊梗的作用。在每一抱囊梗的頂端都產(chǎn)生一個(gè)圓球形的孢子囊用高倍鏡觀察孢子囊內(nèi)部的構(gòu)造。在末成熟的孢子囊內(nèi)，往往只有大量的小顆粒體，接近成熟或成熟的孢子囊則充滿了許多褐色圓形的孢囊孢子。孢子囊壁破裂后，孢子散出，露出鑼錘形的囊軸。注意孢子囊的形態(tài)和顏色。2接合孢子 取根霉屬和犁頭霉屬接合孢子玻片觀察原配于囊、配囊柄及配子囊的發(fā)育過(guò)程。成熟的接合孢子深褐色，表面粗糙。犁頭霉菌的接合孢子在配子囊柄的著生處有附屬絲，注意觀察配囊柄的形狀及大小。（四） 子囊菌亞門(mén)1 半子囊菌綱 屬低等子囊菌,子囊不是由產(chǎn)囊細(xì)胞發(fā)育而來(lái),而是由雙核菌絲上的雙核細(xì)胞發(fā)育形成的。子囊裸生，無(wú)子囊果。子囊壁簿，沒(méi)有孔口，靠壁的脹裂或消解來(lái)釋放于囊孢子。觀察材料：外囊菌屬(Tapharian)，取桃縮葉病(Tdeformans)做臨時(shí)玻片，在顯微鏡下檢查。觀察桃縮葉病害標(biāo)本,注意受害葉片形態(tài)顏色有何變化?葉片正、背面有無(wú)霉層?該霜層是由什么構(gòu)成的?2 核菌綱 核菌綱真菌的子囊果是子囊殼,在子囊果的頂部有固定的孔口。子囊單層壁,有的子囊間有側(cè)絲。生活史中有發(fā)達(dá)的無(wú)性階段。白粉菌目(Erysiphales)和小煤炱目(Mel1ales)的子囊果是閉裹殼,沒(méi)有孔口，這與不整囊菌綱的子囊果相似，但是白粉菌的子囊壁不消解,在成熟的閉囊殼內(nèi)能清楚地看見(jiàn)于囊和子囊孢子。1）白粉菌目(Erygiphales) 本目是專性寄生菌。菌絲蔓延于寄主體表，并產(chǎn)生白色粉狀物，引起植物白粉病。有性階段產(chǎn)生閉囊殼，閉囊殼外有附屬絲，附屬絲形狀不一。閉囊殼內(nèi)子囊數(shù)目也不一樣，由一個(gè)至多個(gè)。附屬絲的形狀和子囊數(shù)目的多少是分屬的依據(jù)。取下列病害材料，挑取閉囊殼作臨時(shí)玻片，在顯微鏡下檢查，注意子囊果有無(wú)孔口。輕輕擠壓蓋玻片，使閉囊殼破裂，觀察子囊果內(nèi)是單子囊還是多子囊，子囊果表面生有附屬絲，形狀如何？用下列材料按檢索表進(jìn)行屬的鑒定。白粉菌主要屬檢索表A閉囊殼內(nèi)單個(gè)子囊B附屬絲菌絲狀單囊殼屬(Sphaerotheca) BB附屬絲剛直較粗，頂端二又狀重復(fù)分枝，分枝末端螺旋狀卷曲 叉絲單囊殼屬(Podosphaera)AA閉囊殼內(nèi)多個(gè)子囊 B附屬絲菌絲狀，發(fā)育不良白粉菌屬(Erysiphe) (又稱Blumeria)BB附屬絲非菌絲狀 C附屬絲剛直，基部膨大，頂端尖銳球針殼屬(Phyllactinia)CC附屬絲基部不膨大 D附屬絲粗、剛直，頂端二叉狀重復(fù)分枝，分枝末端卷曲叉絲殼屬(Microsphaera)DD附屬絲不分枝頂端卷曲鉤絲殼屬(Unicular) 2） 球殼菌目(Sphaeriales) 子囊果是子囊殼，子囊殼具有真正殼壁，單生或叢生于子座上。殼壁(包被)有鮮色肉質(zhì)或暗色膜質(zhì)或炭質(zhì)的。子囊一般排列成子實(shí)層，少數(shù)是分散的。一般都有發(fā)達(dá)的無(wú)性階段。黑腐皮殼屬(Valsa)，取蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌(Valsa mali)切片鏡撿，注意子囊殼的形態(tài)和著生位置，子囊及子裹孢子的形態(tài)如何？如何排列？再視察蘋(píng)果樹(shù)腐爛病病害標(biāo)本，有什么癥狀特點(diǎn)？1) 鞭毛菌亞門(mén)與接合菌亞門(mén)真菌有什么區(qū)別?2) 繪匍枝根霉菌(Rhizopus stolonifer) 孢子囊、孢囊梗、假根匍匐菌絲圖。3) 繪你所見(jiàn)到的接合孢子圖4）繪白粉屬、叉絲單囊殼屬、球針殼屬、鉤絲殼屬的形態(tài)圖實(shí)驗(yàn)三 半知菌、擔(dān)子菌亞門(mén)真菌及所致病害半知菌的種類很多，是植物病害的重要病原菌，可以引起斑點(diǎn)、腐爛和萎蔫等癥狀。半知菌大多以分生孢子繁殖，少數(shù)半知菌不產(chǎn)生任何孢子，而只有菌絲扣菌核兩種形態(tài)，所以無(wú)性階段的形態(tài)結(jié)構(gòu)就成為分類的重要依據(jù)。擔(dān)子菌是高等真菌,包括許多形態(tài)很不相似的真菌。從無(wú)擔(dān)子果的黑粉菌、銹菌,到子實(shí)體很大的傘菌、腹菌、較低等的擔(dān)子菌幾乎全為寄生菌，引起植物的黑粉病和銹病。高等擔(dān)子菌大多是土壤、朽木上的腐生菌,有些能寄生樹(shù)木引起林木病害.還有許多是食用菌，但一些真菌有毒一、目的要求認(rèn)識(shí)半知菌、擔(dān)子菌亞門(mén)中主要病原菌的形態(tài)特征及其所致病害的癥狀類型，掌握分類依據(jù)，尤其是銹菌目各主要屬的形態(tài)特征和典型生活史。二、材料和用具有關(guān)病害標(biāo)本、病原菌永久病害標(biāo)本和各種類型的子實(shí)體標(biāo)本.顯微鏡、擦鏡紙、乳酚油、挑針、載玻片、蓋玻片、小紗布。（一）絲孢綱(Hyphomycetes) 絲孢綱真菌的分生孢子著生在絲狀的分生孢子梗上，而不是著生在特定形態(tài)(如球狀或盤(pán)狀)的分生孢子器內(nèi)或分生孢子盤(pán)上，或者不產(chǎn)生任何類型的分生孢子。1）粉孢屬(Oidium) 引起植物白粉病。觀察小麥白粉病的標(biāo)本，注意葉片表面上白色粉狀物。挑取少許粉狀物制片鏡檢觀察，注意分生孢子梗和分生孢子的形態(tài)及分生孢子的排列方式.2）青霉屬(Penicillium) 柑桔青霉菌(Pitalicum)是柑桔貯藏和運(yùn)輸期中的重要病原菌。觀察果腐癥狀和青霉菌分生孢子梗及孢子，注意觀察分生孢子梗頂端的形態(tài)特征。3）鐮孢屬 (Fusarium) 是瘤座菌目的代表菌。特點(diǎn)是分生孢了梗著生在分生孢子座上。4）絲核菌屬 (Rhizoctonia) 本屬真菌不產(chǎn)生任何無(wú)性孢子，觀察人工培養(yǎng)的立枯絲核菌(R. solani)菌絲體.幼齡菌絲無(wú)色，后期呈褐色，菌絲粗，直角分枝，分枝處有縊縮，分枝附近有隔膜。（二）腔胞綱 (Coelomycetes)腔胞綱真菌的分生孢子梗和分生孢子產(chǎn)生在分生孢子盤(pán)或分生孢子器內(nèi)。1）大莖點(diǎn)屬 (Macrophoma) 觀察大葉黃楊病葉材料，作徒手切片，鏡檢。觀察分生孢子器、分生孢子梗、分生孢子并與莖點(diǎn)霉屬比較,注意比較分生孢子的大小。2）色二孢屬 (Diplodia) 觀察松枯枝病。分生孢子器球形。 分生孢子處為單細(xì)胞，無(wú)色，成熟后為雙細(xì)胞，褐色，橢圓形或卵形。（三）冬孢菌綱(Teliomycetes)本綱真菌的特征是不形成擔(dān)子果，擔(dān)子從冬孢子上產(chǎn)生，冬孢子成堆或分散。這是一類較低等的擔(dān)子菌，包含兩個(gè)目：銹菌目和黑粉菌目,其中絕大多數(shù)種類均寄生于植物上，是一類重要的植物病原菌。1）膠銹菌屬 (Gymnosporangium)沒(méi)有夏孢子階段；冬孢子雙細(xì)胞，有可以膠化的長(zhǎng)柄， 觀察梨膠銹菌(G.haraeanum)所形成的銹病癥狀。鏡檢銹孢子器和性孢子器切片。挑取檜柏上吸水膨大的冬孢子堆(角)鏡檢。2）柱銹菌屬（Cronartium）冬孢子排列成柱狀。三、作業(yè)與思考題1）半知菌亞門(mén)根據(jù)什么特征分類？有幾個(gè)綱，舉出代表性的病害和病菌。2）半知菌的學(xué)名和中文屬名的名稱中包含著什么內(nèi)容。3）繪膠銹菌屬的形態(tài)圖。4）分清長(zhǎng)生活史、短生活史、多型現(xiàn)象、轉(zhuǎn)主寄主、專性寄主、鎖狀聯(lián)合等術(shù)語(yǔ)概念。實(shí)驗(yàn)四 林木病害的其他病原觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解植物病原細(xì)菌及線蟲(chóng)所致病害癥狀特點(diǎn)。2學(xué)習(xí)鏡檢細(xì)菌、線蟲(chóng)的基本方法。3認(rèn)識(shí)植物病毒形態(tài)和病毒病主要癥狀類型，二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1細(xì)菌是單細(xì)胞的原核生物，有細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器，有的細(xì)菌有鞭毛、莢膜和芽孢的結(jié)構(gòu)。細(xì)菌個(gè)體微小，往往需制成涂片并經(jīng)染色后，在顯微鏡油浸的物鏡下觀察。植物病原細(xì)菌都是桿狀菌，其分屬依據(jù)是鞭毛數(shù)及著生方式、格蘭氏染色反應(yīng)、在培養(yǎng)基上長(zhǎng)成的菌落色澤、形狀和生理生化反應(yīng)。2一般細(xì)菌病害病斑或病部周圍組織呈水漬狀，在潮濕條件下可在病部溢出菌膿，干后形成菌膠。菌膿在清晨或潮濕天氣較易觀察到。將病部特別是病鍵交接處切片鏡檢時(shí)，一般可見(jiàn)到大量細(xì)菌從病部（特別是維管束向外涌出），像煙囪冒出的煙霧，這種菌溢現(xiàn)象是診斷細(xì)菌病害的簡(jiǎn)便而可靠的方法。3植物寄生線蟲(chóng)是又一類重要病原物。除直接致病外，有的線蟲(chóng)可以傳帶病毒，或造成植物傷口以利于其它病原微生物侵染。植物線蟲(chóng)主要在寄主的根際或根內(nèi)、莖、葉和種子內(nèi)生存，有的形成蟲(chóng)癭（如根結(jié)線蟲(chóng)）。引起植物病害的癥狀主要是營(yíng)養(yǎng)不良、生長(zhǎng)衰弱或畸形，從而降低產(chǎn)量或品質(zhì)。植物寄生線蟲(chóng)是病原物中個(gè)體較大的，但是多數(shù)仍不能用肉眼看到或看清楚，需用低倍顯微鏡觀察。線蟲(chóng)蟲(chóng)體分頭、頸、腹、尾4部分。頭部有唇、口腔、吻針和側(cè)器；頸部包括食道、神經(jīng)環(huán)和排泄孔；腹部有腸管和生殖器官，后端有肛門(mén)；尾部有側(cè)尾腺和尾腺。分辨科、屬、種的主要依據(jù)是體形、食道、頭和尾部的主要形態(tài)特征。4病毒顆粒很小，必須用電子顯微鏡才能觀察到。植物病毒顆?？梢苑譃閳A球狀（或等邊多面體）、炮彈狀、長(zhǎng)桿狀和線條狀4種。這些在課堂和本次實(shí)驗(yàn)課上只能通過(guò)觀看電鏡照片或幻燈片來(lái)了解。5植物病毒病的主要癥狀類型有花葉、變色、條紋、枯斑或環(huán)斑壞死、畸形。應(yīng)該注意：一方面這些癥狀類型的分辨在病毒病鑒定上具有比起它病害更重要的意義，另一方面在實(shí)際觀察中，也會(huì)發(fā)現(xiàn)同一種病毒病在發(fā)病過(guò)程中或在不同環(huán)境條件下會(huì)有不同的表現(xiàn)（不同病狀甚至隱癥）。6病毒病多為系統(tǒng)性侵染，沒(méi)有病征，易與非侵染性病害相混淆，往往需要通過(guò)一定方式的傳染試驗(yàn)證實(shí)其傳染性。三、實(shí)驗(yàn)材料及用具植物病原細(xì)菌、病毒和寄生線蟲(chóng)所致病害癥狀標(biāo)本、顯微鏡、玻片、酒精燈、培養(yǎng)皿、化學(xué)試劑（堿性品紅、苯酚、亞甲藍(lán)、氫氧化鉀、酒精）。四、實(shí)驗(yàn)步驟1觀察下列病害標(biāo)本，區(qū)分各類癥狀。桃細(xì)菌性穿孔病、青枯病等。附帶觀察寄生性種子植物大豆菟絲子。注意觀察細(xì)菌性病害的菌膿和菌膠、線蟲(chóng)的蟲(chóng)癭。2取細(xì)菌性病害的標(biāo)本，最好是新鮮的，在病斑邊緣或病健交接處切開(kāi)，或?qū)⑤^小的葉段移到玻片上的水滴里，加蓋玻片，稍停片刻在顯微鏡下觀察菌溢現(xiàn)象。3涂片固定染色觀察細(xì)菌形態(tài)1）涂片 取一干凈的載玻片，在中央偏左處滴一滴無(wú)菌水，然后用接種針在細(xì)菌病害腐爛部分或溢膿上挑取一點(diǎn)膿狀物，移至水滴中混勻，用另一張?jiān)诓Ｆ囊欢伺c細(xì)菌懸浮液滴接觸，并沿底邊平行方向向右移動(dòng)，涂布后的片子須在空氣中來(lái)回晃動(dòng)，以加速其干燥。另一種做法是將有細(xì)菌懸浮滴的玻片直立，使菌液流動(dòng)，形成一條細(xì)菌懸浮液膜，讓其自然干燥。2）固定 用拇指和食指拿住涂好的玻片一端，有菌面朝上，在酒精燈上往返通過(guò)34次，注意通過(guò)火焰時(shí)要使玻片各處受熱均勻，不可固定烘烤一處，溫度也不要太高。進(jìn)行鞭毛染色的玻片一般不用火焰加熱法固定，而用1%福爾馬林溶液固定。3）染色 常用于細(xì)菌染色的染色劑和染色法有以下兩種：苯酚品紅染色法：溶液I：堿性品紅 0.3g，酒精（95%） 10mL；溶液II：苯酚（結(jié)晶）5g，蒸餾水 95mL。將溶液I和溶液II分別配好后混合，用滴管移到涂片上染色1分鐘，然后用清水沖洗，直至水中沒(méi)有紅色為止。亞甲藍(lán)染色法：溶液I：亞甲藍(lán) 0.3g，酒精（95%） 30mL；溶液II：氫氧化鉀溶液（0.01%）100mL。溶液I和II分別配好后混合放置備用。染色時(shí)將上述染色劑移到涂片上靜置1分鐘后，用清水沖洗直至水中看不到藍(lán)色為止。用吸水紙吸去水分或風(fēng)干，即可供鏡檢。4）鏡檢 先將物鏡中的油鏡（90）轉(zhuǎn)至鏡筒正下方，在染色的細(xì)菌涂片標(biāo)本上滴一滴香柏油，將油鏡降至香柏油中，再側(cè)視，把物鏡降至十分貼近載玻片的高度，然后用眼睛對(duì)準(zhǔn)目鏡，邊觀察邊轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)輪使鏡筒徐徐上升，看到標(biāo)本后轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)調(diào)節(jié)輪調(diào)整焦距，使物像清晰。如果沒(méi)有找到細(xì)菌，則要重新再側(cè)視的情況下將物鏡降至貼近載玻片的位置，重復(fù)上述操作。切不可用粗調(diào)節(jié)輪由上向下降低物鏡，以免損傷鏡頭和玻片。油鏡用畢，須用擦鏡紙沾二甲苯擦凈。4線蟲(chóng)形態(tài)的觀察 將線蟲(chóng)蟲(chóng)癭浸在水中約1小時(shí)，用解剖針挑取種皮內(nèi)的白色物移到載玻片上的水滴中，蓋上蓋玻片鏡檢。用低倍鏡找到適合觀察的線蟲(chóng)后再換高倍鏡觀察各種器官的形態(tài)。五、作業(yè)與思考1完成2片以上的細(xì)菌涂片（經(jīng)染色）。2繪制顯微鏡下觀察到的細(xì)菌菌溢現(xiàn)象示意圖。3繪制線蟲(chóng)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖。實(shí)驗(yàn)五 病原物的分離與培養(yǎng)基本原理：柯赫氏法則（Kochs Postulate）是通過(guò)一系列步驟確定引起病害的病原物的原則和方法，是診斷病害中的證病律。其基本步驟如下：1在染病組織上用顯微鏡經(jīng)常檢查到某種微生物；2從病組織中分離得到該微生物，并獲得純培養(yǎng)；3將純培養(yǎng)的微生物接種到健康的感病寄主植物后，發(fā)生原先觀察到的癥狀；4從接種發(fā)病的組織中，再分離，又得到相同的微生物。全過(guò)程擬分兩次實(shí)驗(yàn)完成，本次完成第一和第二步。包括實(shí)驗(yàn)十三培養(yǎng)基的制作和本次實(shí)驗(yàn)病原物的分離、培養(yǎng)及純化。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆詹≡锓蛛x、培養(yǎng)和純化的一般方法。二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容（一）真菌的分離1分離前的準(zhǔn)備工作分離和培養(yǎng)應(yīng)在很清潔，甚至無(wú)菌的條件下進(jìn)行。如在無(wú)菌室、無(wú)菌操作箱、超凈工作臺(tái)和清潔的室內(nèi)。無(wú)菌操作箱的內(nèi)壁可以用升汞液（1：1000）擦洗，使用超凈工作臺(tái)應(yīng)事先開(kāi)動(dòng)運(yùn)行15分鐘左右。在屋頂四壁清潔而空氣較靜止的房間進(jìn)行時(shí)，要將地面掃凈擦濕，用1：1000的升汞液或清水擦凈工作臺(tái)，并在臺(tái)上鋪一塊干凈濕白布，將所需物品都放在臺(tái)布上，工作時(shí)避免走動(dòng)，以減少污染。2分離材料的選擇選擇新近發(fā)病的植株、器官或組織作為分離材料，可以減少腐生菌的污染。從病健交界處分離這一原則對(duì)于大部分病害的分離都是適用的。而有些有暈圈的斑點(diǎn)?。ㄈ缫盎鸩。?，病菌局限在斑點(diǎn)中央的壞死組織中，從斑點(diǎn)邊緣是分離不到病菌的。3組織表面消毒從植株或組織上取下的分離材料，必須進(jìn)行表面消毒，以殺死或減少病組織表面的腐生菌，保留組織內(nèi)部的病原菌。常用的表面消毒液有：1）升汞消毒液配方為：升汞 1g， 濃鹽酸 2.5mL， 水 1000mL。將升汞溶于濃鹽酸中，待其充分溶解后，用水稀釋。升汞劇毒、無(wú)色，為便于認(rèn)識(shí)，可在溶液中加幾滴紅染料。消毒時(shí)間因材料質(zhì)地、發(fā)病部位深淺及污染情況而異，一般35分鐘。消毒后用無(wú)菌水沖洗34次。2）漂白粉消毒液有些真菌對(duì)汞、銅等金屬離子敏感，可用漂白粉消毒液。其配方為：漂白粉 10g， 水 140mL。選用新鮮漂白粉，將漂白粉溶于水中，過(guò)濾后使用，隨用隨配，不能久留，否則因揮發(fā)而失去殺菌能力。一般處理35分鐘，消毒時(shí)間亦因材料而異，處理種子用510分鐘。消毒后用無(wú)菌水沖洗，有時(shí)也可不必沖洗。3）酒精和其它消毒劑70%酒精也是常用的表面消毒液。將材料在酒精溶液中浸數(shù)秒鐘到一分鐘，然后水洗。有些幼嫩組織只需用脫脂棉蘸酒精溶液少許，擦涂表面，待酒精揮發(fā)后，即可放在培養(yǎng)基上培養(yǎng)。對(duì)于特別幼嫩的病組織，因?qū)λ幬锩舾校梢杂脺缇?9次。4分離方法常用的分離方法分為兩大類：1）組織分離法分離一小塊染病組織，經(jīng)表面消毒后，移植于平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)。很多材料適用此法，下面介紹幾種：斑點(diǎn)病病原菌的分離：挑取新鮮典型的病斑，在病健交界處，剪取5mm2的染病組織，在70%酒精中浸數(shù)秒鐘，然后移入0.1%的升汞溶液中處理35分鐘，用無(wú)菌水沖洗3次，移入平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)。維管束病菌的分離：先用70%的酒精將根莖表面擦拭消毒，然后用滅過(guò)菌的解剖刀剝?nèi)ケ砥ぃ偾腥∑渲幸恍K變色的部分，用升汞液或漂白粉液消毒，用無(wú)菌水沖洗幾次后，移到培養(yǎng)基上培養(yǎng)。種子內(nèi)病原菌的分離：用升汞溶液或漂白粉溶液進(jìn)行種子表面消毒，然后用無(wú)菌水沖洗，再移于平板培養(yǎng)基上。2）稀釋分離法用無(wú)菌水從發(fā)病組織表面沖下孢子，配成孢子懸浮液，用無(wú)菌移液管或滴管吸取一定體積的菌液至平板培養(yǎng)基上，然后用無(wú)菌玻璃棒將菌液輕輕的均勻涂布在整個(gè)平板上，或?qū)⒕阂浦翢o(wú)菌培養(yǎng)皿中，然后傾入融化后冷卻至45的培養(yǎng)基，輕輕振蕩、平置、凝固后倒置培養(yǎng)。并在皿蓋上寫(xiě)上日期、分離物名稱、分離者姓名。分離工作有時(shí)并不順利，要從分離材料、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件及操作處理方法等方面找原因，改變工作方法，不斷進(jìn)行試驗(yàn)（二）菌種的純化按照上述步驟分離病原物，如果材料很新鮮，本身很少污染，有可能一次分離出純培養(yǎng)菌。然而多數(shù)情況下會(huì)發(fā)現(xiàn)同一培養(yǎng)皿中有不同的菌落，要做菌種的純化。純化的方法很多，下面介紹三種方法。1瓊脂平板稀釋純化法將菌種上產(chǎn)生的孢子用無(wú)菌水沖洗下，在無(wú)菌培養(yǎng)皿中適當(dāng)稀釋后（大致每個(gè)培養(yǎng)皿中只有30個(gè)左右的孢子），取一定量的孢子懸浮液與融化后冷卻至45左右的瓊脂培養(yǎng)基混合，制成平板培養(yǎng)基，在適宜溫度下培養(yǎng)。然后，從形成的單個(gè)菌落邊緣上分離菌絲到斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)。這種方法實(shí)質(zhì)上是分離菌落，主要用于酵母菌和細(xì)菌等的純化，也適用于其它產(chǎn)生孢子較多的真菌的純化。操作簡(jiǎn)便，但不能確定一個(gè)菌落是否從單個(gè)孢子繁殖而來(lái)，純化的可靠性較差。2干孢子分離法干的孢子，如黑粉菌的厚垣孢子和有些擔(dān)子菌的擔(dān)孢子等，可用細(xì)的縫衣針或解剖針挑取。先將干孢子放在滅菌的玻片上，用食指和大拇指握住縫衣針，在低倍鏡下檢查，當(dāng)針尖接觸孢子時(shí)，孢子即離開(kāi)玻片附在針尖上，然后移到適宜的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。不過(guò)，初學(xué)者較難成功地利用此法。3菌絲尖端分離法此法適用于不產(chǎn)生孢子或產(chǎn)生孢子而孢子不容易分離的真菌。將真菌培養(yǎng)在培養(yǎng)基表面，用低倍鏡找到單獨(dú)的菌絲尖端后，用內(nèi)徑0.5mm左右的毛細(xì)管從菌絲尖端徐徐插入，連同培養(yǎng)基將菌絲尖端切下，然后將這一帶有培養(yǎng)基的菌絲移到新的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。（三）真菌的培養(yǎng)無(wú)論是從病部移到培養(yǎng)基上的病原菌，還是準(zhǔn)備用于回接到寄主上的病原菌，都要在一定條件下培養(yǎng)。根據(jù)試驗(yàn)的要求，可將純化的菌種，移植到適當(dāng)?shù)墓腆w或液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，也可以用錐形瓶盛PDA基質(zhì)，進(jìn)行大量繁殖。一般真菌只要滿足2030的溫度即可生長(zhǎng)，少數(shù)真菌由于研究其生理的特殊需要，應(yīng)在一定的恒溫條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)過(guò)程中要注意檢查和記載，一般真菌經(jīng)24小時(shí)培養(yǎng)后即可檢查其生長(zhǎng)情況，如：有無(wú)污染、溫度是否合適等。真菌的培養(yǎng)性狀最好是培養(yǎng)在瓊脂平板培養(yǎng)基上觀察和描述，觀察和記載的項(xiàng)目主要有：1菌落的質(zhì)地；2菌落是凸起的還是成簇的菌絲體；3形成成堆的孢子是干性的還是粘性的；4各種子實(shí)體和休眠結(jié)構(gòu)（厚垣孢子、菌核等）的形成及所需的時(shí)間；5菌落正面和背面的顏色，有無(wú)色素滲入培養(yǎng)基中；6有無(wú)特殊氣味；7菌落中有無(wú)部分呈扇形；8生長(zhǎng)率的快慢，如菌落長(zhǎng)到一定直徑所需的時(shí)間。菌落的顏色也要仔細(xì)地不斷地觀察，它的顏色往往隨著培養(yǎng)時(shí)間而改變。此外，培養(yǎng)性狀的描述，要注明培養(yǎng)基的種類、培養(yǎng)溫度和有無(wú)光照等。三、實(shí)驗(yàn)材料與用具無(wú)菌室或接種箱，手提式高壓蒸汽滅菌鍋、電爐、天平、鐵架臺(tái)、滅菌培養(yǎng)皿、250mL錐形瓶、漏斗、試管、2000mL燒杯、小燒杯、移液管、止水夾、石蕊試紙、乳膠管、報(bào)紙、棉花、醫(yī)用紗布、解剖剪、接種環(huán)、酒精燈；馬鈴薯、瓊脂、葡萄糖（或蔗糖）、NaOH溶液、鹽酸、漂白粉、70%酒精、升汞；蘋(píng)果葉斑病病葉、楊樹(shù)腐爛病枝條。四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）葉斑病類的分離法1準(zhǔn)備工作1）PDA培養(yǎng)基的制作及無(wú)菌水的準(zhǔn)備按照前面介紹的方法，配制好PDA培養(yǎng)基，分裝入試管和錐形瓶中，包裝好，在250mL的錐形瓶中裝入100mL左右自來(lái)水，塞上棉塞，包裝好，連同培養(yǎng)基一起滅菌，滅菌完畢，制作斜面培養(yǎng)基和平板培養(yǎng)基。制好的培養(yǎng)基最好保溫培養(yǎng)23天，檢查滅菌效果后使用。2）分離室的清潔用5%石炭酸或1：40福爾馬林溶液在分離室或接種箱中消毒，或用紫外線照射1020分鐘。3）穿好工作服。4）用肥皂洗凈手。2分離工作一切準(zhǔn)備工作就緒后，進(jìn)入分離室或坐在分離箱旁。1）點(diǎn)燃酒精燈，用少許脫脂棉蘸70%酒精擦手。2）取裝有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿二套，在皿蓋上注明分離材料、日期及分離者姓名。3）從病葉上選擇典型的單獨(dú)病斑，在病健交界處剪取約4mm2的病組織10塊，放入小燒杯中。4）用70%的酒精或0.1%升汞對(duì)病組織塊進(jìn)行表面消毒。5）用無(wú)菌鑷子將消毒過(guò)的組織塊移到平板培養(yǎng)基上，每皿45塊。6）將培養(yǎng)皿倒置于2628的恒溫箱中培養(yǎng)。7）數(shù)日后病組織周圍長(zhǎng)出菌絲體而形成菌落，經(jīng)鑒定（鏡檢）無(wú)誤后，可留作純菌種。8）用火焰滅菌接種針，在菌落邊緣取一小塊帶病菌的培養(yǎng)基，移到試管斜面上培養(yǎng)，得到純菌種。（二）果實(shí)、枝干或維管束內(nèi)部病菌的分離法1準(zhǔn)備工作：同葉斑病類分離法。2分離工作1）點(diǎn)燃酒精燈，用70%的酒精擦手。2）取平板培養(yǎng)基兩培養(yǎng)皿，在皿蓋上注明分離材料、分離者姓名等。3）取有黑疤病的甘薯，用脫脂棉蘸70%的酒精少許，涂楊樹(shù)病部表面及周圍，通過(guò)火焰燒去遺留的酒精，重復(fù)進(jìn)行23次。4）用解剖刀經(jīng)火焰滅菌后，將病部表皮削去，在病健交界處取小塊變色的組織，直接移到平板培養(yǎng)基上，每皿34塊。5）將培養(yǎng)皿倒置于2628恒溫箱中培養(yǎng)。6）以下步驟同葉斑病類分離法。五、作業(yè)1每人交純菌種試管一支。2書(shū)面報(bào)告分離結(jié)果，有無(wú)污染發(fā)生，分析原因。實(shí)驗(yàn)六 林木病害的接種試驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?深對(duì)病原物傳染、侵染等概念的理解；2掌握幾種常用的接種方法；3在上一次試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，了解柯赫氏法則的全過(guò)程。二、講解要點(diǎn)病原菌的種類很多，其傳播途徑各不相同，主要有種子、土壤、氣流和昆蟲(chóng)等。因此，在人工接種時(shí)，要采用不同的方法。接種技術(shù)廣泛地應(yīng)用于寄主范圍和品種抗病性測(cè)定、病菌致病性變異、病害流行及防治等項(xiàng)研究。下面介紹幾種常用的接種方法。（一）種子傳染病害的接種1拌種法 用病菌的孢子拌種是常用的接種方法。2浸種法 孢子懸浮液浸種也是常用的方法。浸種時(shí)抽氣減壓，可以使孢子滲入種子內(nèi)部，從而提高接種效率。在人工培養(yǎng)基上不易產(chǎn)生孢子的病原菌，可以用攪碎的菌絲懸浮液浸種。（二）土壤傳染病害的接種1土壤接種法 是將病菌在播種前或播種時(shí)拌在土壤中的接種辦法。如立枯病即可將人工培養(yǎng)的菌絲拌入滅菌的土中，然后播種。在所有病害的接種實(shí)驗(yàn)中，以土壤接種最為復(fù)雜。主要原因是病菌易受土壤物理、化學(xué)及生物學(xué)性質(zhì)的影響。2蘸根接種法 是將幼苗的根部稍加損傷，然后將受傷的根部蘸上孢子或菌絲懸浮液的接種方法。這種方法使病菌能與根部直接接觸，受土壤微生物的影響較小。同時(shí)，根部有損傷，病菌也易侵入，效果比土壤接種法好，常用于枯萎病等的接種。（三）氣流和雨水傳播病害的接種1噴霧法 將孢子（或菌絲）懸浮液噴灑在寄主表面，病菌可以從氣孔、傷口和表皮直接侵入。葉背氣孔數(shù)目一般比葉正面的多，對(duì)于從氣孔侵入的病菌，則應(yīng)注意噴灑葉背；對(duì)于從傷口侵入的病菌，噴灑前應(yīng)用細(xì)砂土或金剛砂摩擦葉面，使葉表稍損傷；葉面有蠟質(zhì)的，接種時(shí)可用濕布將蠟質(zhì)層擦去。2噴粉法 是將一定量的干孢子與滑石粉混勻后，放在小噴粉器中噴灑在潮濕的植物表面的接種法?；鄣牧恳话闶擎咦恿康?0倍左右。如白粉菌和銹菌等的接種。3涂抹法 涂抹法是先用手指蘸水摩擦葉片，去掉蠟質(zhì)層，使表面有一薄層水膜，然后將孢子涂抹在上面的接種法。噴霧、噴粉和涂抹接種后的植物，必須保濕約24小時(shí)左右，使病菌孢子能萌發(fā)侵入。4注射法 是將病菌孢子懸浮液用注射器注入寄主生長(zhǎng)點(diǎn)或幼嫩部分的接種法。5針刺法 是指用滅菌的針刺傷寄主植物組織，然后將病菌接種在傷口內(nèi)或用滅菌的針蘸菌膿刺傷寄主組織的接種法。此法用于傷口侵入的病菌。如塊莖、果實(shí)、塊根等的腐爛病菌。（四）昆蟲(chóng)傳播病害的接種針對(duì)昆蟲(chóng)主要作為病毒病的傳播媒介。三、實(shí)驗(yàn)材料及用具立枯病菌、腐爛病、潰瘍病病菌；楊樹(shù)、柳樹(shù)枝條、刺槐種子；恒溫恒濕箱、小噴霧器、顯微鏡、接種針、接種環(huán)、酒精燈、70%酒精等。四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）苗木立枯病的接種噴霧法1取立枯病病菌絲核菌、鐮刀菌、瓜果腐霉的純培養(yǎng)，用無(wú)菌水配成孢子和菌絲懸浮液，使懸浮液中的孢子在顯微鏡的低倍視野中有10個(gè)左右。然后，將此懸浮液裝入小噴霧器中。2取處理過(guò)的刺槐種子250粒（無(wú)病），50粒噴鐮刀菌孢子懸浮液，50粒噴絲核菌菌絲懸浮，50粒噴瓜果腐霉菌菌絲懸浮，100粒噴灑請(qǐng)水，作為對(duì)照。分別栽種到4個(gè)淺盤(pán)中，濕沙培養(yǎng)。3將上述種子放在同樣的恒溫恒濕箱中培養(yǎng)，進(jìn)行正常管理。逐日觀察癥狀，記載發(fā)病情況。（二）楊樹(shù)腐爛病的接種針刺法取新鮮楊樹(shù)枝條一個(gè)，洗凈，用脫脂棉蘸70%的酒精少許，在接種部位涂拭消毒，晾干后，用滅菌的解剖針刺傷，用滅菌的接種環(huán)挑取少許腐爛病菌的純培養(yǎng)，接種在刺傷的部位。另選一處刺傷后不接種病菌，作為對(duì)照。每個(gè)枝條可做35個(gè)重復(fù)。然后，將枝條放在保濕器中，放入25的恒溫箱中。逐日觀察癥狀，記載發(fā)病情況。五、作業(yè)1將接種過(guò)程及結(jié)果寫(xiě)成書(shū)面報(bào)告。2接種試驗(yàn)為什么要設(shè)對(duì)照，保濕的意義何在？實(shí)驗(yàn)七 林木的種實(shí)、葉部病害觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼J(rèn)識(shí)林木葉部及種實(shí)病害的癥狀及主要病原菌的形態(tài)，二、材料和用具l林木葉部病害盒裝標(biāo)本1) 白粉病類：黃櫨白粉病、山植白粉病、丁香白粉病、蘋(píng)果白粉病;2) 煤污病類：楊樹(shù)煤污病、醋栗煤污病;3) 銹病類：毛白楊銹病、蘋(píng)-儈銹病、棗銹病、松針?shù)P病;4) 葉斑病類：楊黑斑病、楊灰斑病、柿圓斑病、柿角斑病、梨黑星病、松落針病、蘋(píng)果褐斑病;5) 細(xì)菌性葉部病害： 桃穿孔病、核桃細(xì)菌性黑斑病;6) 病毒類葉部病害：楊花葉病毒病、蘋(píng)果花葉病垂病。2液浸標(biāo)本 蘋(píng)果炭疽病、蘋(píng)果輪紋病。3種實(shí)盒裝標(biāo)本 種實(shí)霉?fàn)€、果實(shí)霉?fàn)€、4切片標(biāo)本 桃縮葉病、梨黑星病、蘋(píng)果炭疽病、臭椿白粉病、丁香白粉病、黃櫨白粉病、蘋(píng)果白粉病、桃白粉病、向日葵白粉病、棗銹病、松針?shù)P病、毛白楊銹病、蘋(píng)一一儈銹病組織切片。5病葉 臭椿白粉病、刺槐白粉病、黃護(hù)白粉病、桑白粉病等病葉 (帶閉囊殼)。6用具:顯微鏡、刀片、表面皿、無(wú)菌水、載片、蓋片三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容(一)主要葉部病害的癥狀及病原菌觀察1仔細(xì)觀察盒裝標(biāo)本，掌握其主要癥狀特點(diǎn)。 2從供試的白粉病病葉上挑取少許病原物制成片子，在顯微鏡下觀察病原物的形態(tài)，注意閉囊殼附屬絲的形態(tài)。在低倍鏡下用挑針輕壓蓋片，使閉囊殼破裂，子囊從裂口處散出，觀察閉囊殼內(nèi)子囊的個(gè)數(shù)。參照白粉菌分屬檢索表，鑒定供試標(biāo)本到屬。3病原菌觀察1) 楊黑斑病 盤(pán)二孢屬真菌觀察;分生孢子盤(pán)小，位于寄主角質(zhì)層下。分生孢子雙胞，一大一小，橢圓形或卵形，無(wú)色。 觀察盒裝實(shí)物標(biāo)本及病原菌切片。2）楊灰斑病 棒盤(pán)孢屬真菌的觀察。分生孢子盤(pán)暗色，埋生在寄主體內(nèi)或外露，盤(pán)狀或墊狀。，分生孢子梗方形或梭形，由4個(gè)細(xì)胞構(gòu)成，上數(shù)第三個(gè)細(xì)胞最大且自此彎曲。3）桃縮葉病組織切片 示外子囊層、子囊利子囊袍子的形狀;4) 梨黑星病組織切片 示無(wú)性及有性子實(shí)體利泡子的形態(tài);5) 蘋(píng)果炭疽病組織切片 示分土抱于盤(pán)利分生泡于形態(tài);6) 觀察臭椿白粉病、丁香白粉病、黃悼白粉病、蘋(píng)果白粉病、桃白粉病、向日葵白粉病注意區(qū)別閉囊殼及附屬絲形態(tài)。7) 觀察棗銹病、松疤銹病、松針?shù)P病、毛白楊銹病、蘋(píng)-儈銹病、玫瑰銹病組織切片，注意區(qū)別冬孢子形態(tài)和排列方式附：與林木病害有關(guān)的主要銹菌屬:1柱銹菌：冬孢子大多從夏孢子堆中生出，由梭形褐色的冬孢子聯(lián)結(jié)成柱狀，通稱冬孢子柱。如松皰銹病的茶鑣生柱銹菌。2柵銹出：冬孢子褐色、單細(xì)胞、無(wú)柄，以側(cè)面緊密相連排列成一層。生于寄主表皮下 如引起毛白楊銹病的馬格柵銹兇利楊柵銹菌。3鞘銹菌：冬孢子堆小型、蠟質(zhì)，產(chǎn)生于表皮下。冬孢子無(wú)柄，表面有疣突，側(cè)面互相連接，萌發(fā)時(shí)本身分為4個(gè)細(xì)胞，成為內(nèi)擔(dān)子。如引起松針?shù)P病的鞘銹