單克隆抗體藥物關(guān)鍵技術(shù)分析.docx

單克隆抗體藥物關(guān)鍵技術(shù)分析1.高通量的動物細胞表達技術(shù)一方面，從表達體系來看，近年來，人們不斷發(fā)展和完善了許多抗體分子的表達體系，如：細菌、酵母、昆蟲細胞、哺乳動物細胞、植物細胞表達系統(tǒng)和體外翻譯系統(tǒng)等。哺乳動物細胞表達系統(tǒng)具有活性高、穩(wěn)定性好等重要優(yōu)點，已成為抗體等生物技術(shù)產(chǎn)品最重要的系統(tǒng)。2007年銷售額排名前列的6類生物技術(shù)藥物中，有5類是由動物細胞表達生產(chǎn)（腫瘤治療抗體類、抗TNF-抗體類、EPO類、干擾素類、凝血因子類），僅胰島素類藥物是由大腸桿菌和酵母表達的。歐美國家哺乳動物細胞表達產(chǎn)品種類占60%-70%，市場份額占65%以上。另一方面，從抗體制備規(guī)模、速度和功能來看，高通量抗體制備技術(shù)的發(fā)展十分重要。哺乳動物細胞表達生物技術(shù)產(chǎn)品大規(guī)模高效培養(yǎng)技術(shù)是生物醫(yī)藥產(chǎn)品主要的生產(chǎn)方式和關(guān)鍵“瓶頸”技術(shù)。目前，國際上該項技術(shù)發(fā)展較快，已趨成熟，以默克公司為代表的流加培養(yǎng)生產(chǎn)規(guī)模達10,000L以上，以貝爾公司為代表的灌流培養(yǎng)生產(chǎn)規(guī)模達200L以上，蛋白表達濃度為0.5-2g/L；我國在該技術(shù)領(lǐng)域起步較晚，基礎(chǔ)較差，但近年來經(jīng)過努力，已經(jīng)實現(xiàn)了該項技術(shù)的突破。2.人源化抗體的構(gòu)建及優(yōu)化技術(shù)隨著免疫學和分子生物學技術(shù)的發(fā)展以及抗體基因結(jié)構(gòu)的闡明，DNA重組技術(shù)開始用于抗體的改造?？贵w藥物已經(jīng)進入基因工程抗體時代?；蚬こ炭贵w具有以下優(yōu)點：降低人體對異種抗體的排斥反應(yīng)；減小抗體的分子量，利于其穿透血管壁，進入病灶的核心部位；根據(jù)需要，制備新型抗體；采用多種表達方式，大量表達抗體分子，降低生產(chǎn)成本。(1)表面重塑抗體 對鼠抗體表面氨基酸殘基進行人源化改造。該方法的原則是僅替換與人抗體SAR差別明顯的區(qū)域，在維持抗體活性并兼顧減少異源性基礎(chǔ)上選用與人抗體表面殘基相似的氨基酸替換；另外，所替換的區(qū)段不應(yīng)過多，對于影響側(cè)鏈大小、電荷、疏水性，或可能形成氫鍵從而影響到抗體互補決定區(qū)（CDR）構(gòu)象的殘基盡量不替換。我國也已經(jīng)開始這方面工作的嘗試。(2)重構(gòu)抗體由異源抗體中與抗原結(jié)合相關(guān)的殘基與人抗體重新拼接構(gòu)建的，包括CDR區(qū)移植，部分CDR移植和特定決定區(qū)（SDR）轉(zhuǎn)移。我國在這方面工作已經(jīng)取得進展，如北京天廣實，回而生公司都在開展這方面工作。3.全人源化抗體的構(gòu)建及優(yōu)化技術(shù)全人源化抗體即抗體的輕重鏈都是來源于人的抗體，是治療性抗體的發(fā)展趨勢。目前獲得全人源化抗體方法有抗體庫篩選技術(shù)，如鏈置換、基因工程小鼠制備全人抗體。目前比較成熟的是抗體庫篩選技術(shù)：抗體庫篩選技術(shù)主要包括噬菌體抗體庫、合成抗體庫和核糖體展示技術(shù)。(1)噬菌體抗體庫技術(shù)1985年，Smith第一次將外源基因插入絲狀噬菌體f1的基因，使目的基因編碼的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌體表面，從而創(chuàng)建了噬菌體展示技術(shù)。20世紀90年代初，人們認識到了噬菌體展示技術(shù)在篩選上的巨大潛力，并把它應(yīng)用于基因工程抗體的制備中，建立了噬菌體抗體庫技術(shù)，即用已知抗原從較大的抗體庫中篩選出目的抗體。該技術(shù)在人源性抗體的生產(chǎn)、抗體性能改造和抗體基因研究等方面具有較大的實用價值。與傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)相比，噬菌體抗體庫技術(shù)具有明顯的優(yōu)越性，即操作簡單、穩(wěn)定有效、篩選容量大、生產(chǎn)成本低等。(2)核糖體展示技術(shù)目前抗體庫技術(shù)還受2方面的因素影響：從未經(jīng)免疫動物的抗體庫獲得的抗體親和力不高；受外源基因轉(zhuǎn)化率的限制，抗體庫的庫容不足以涵蓋某種動物的抗體多樣性。大容量抗體庫是獲得高親和力抗體和針對稀有抗原抗體的關(guān)鍵。核糖體展示技術(shù)避開了上述不足，可制備大容量抗體庫。該技術(shù)依賴于mRNA、核糖體和抗體蛋白（或多肽）通過非共價結(jié)合形成三聯(lián)復合體，在無細胞體系中完成轉(zhuǎn)錄和翻譯，實現(xiàn)了基因型和表型的偶聯(lián)，翻譯出來的抗體可用抗原進行篩選，由于不經(jīng)過體內(nèi)轉(zhuǎn)化，構(gòu)建的抗體庫庫容可達到甚至超過1011。利用核糖體展示技術(shù)可以獲得特異的、高親和力的抗體。(3)基因工程小鼠技術(shù)基因工程小鼠技術(shù)包括人外周血淋巴細胞一嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠、轉(zhuǎn)基因小鼠和轉(zhuǎn)染色體小鼠制備人抗體技術(shù)。前者制備人抗體仍存在不少問題，如抗原免疫后難以產(chǎn)生抗體，無靶向性等；后兩者始于20世紀末，技術(shù)難度較大，但可制備完整分子、高親和力的全人抗體。轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)用于制備全人抗體時，具有功效高、靶親和力強的優(yōu)點。但也存在一些缺陷，即該技術(shù)生成的抗體具有不完全的人序列和鼠糖基化模式。由于轉(zhuǎn)基因小鼠不能攜帶完整人抗體基因，限制了一系列免疫球蛋白的制備。Tomizuka等首先建立并以染色體為載體成功