研究生免疫組織化學(xué)染色技術(shù).ppt

武漢大學(xué)病理教研室 免疫組織化學(xué)技術(shù)的定義 免疫組織化學(xué)技術(shù) Immunohistochemistry IHC 是用標(biāo)記的特異性抗體 或抗原 對(duì)組織內(nèi)的抗原 或抗體 的分布進(jìn)行定位 定性 定量檢測(cè) 經(jīng)過(guò)組織化學(xué)呈色反應(yīng)在組織原位顯示抗原 或抗體 如各種蛋白質(zhì) 多肽 磷脂和多糖等成分的一門新技術(shù) 武漢大學(xué)病理教研室 免疫組織化學(xué)的應(yīng)用 IHC通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi) 細(xì)胞表面或細(xì)胞間的正?；虍惓５奈镔|(zhì) 以研究組織細(xì)胞的正常生理 代謝及疾病的病因 發(fā)病機(jī)理 廣泛用于各種蛋白質(zhì)或肽類物質(zhì)表達(dá)水平的檢測(cè) 細(xì)胞屬性的判定 淋巴細(xì)胞的免疫表型分析 細(xì)胞增殖和凋亡的研究 以及細(xì)胞周期和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究等 武漢大學(xué)病理教研室 實(shí)驗(yàn)名稱 鏈霉菌親和素 過(guò)氧化物酶連結(jié)法 Streptavidin PeroxidaseConjugatedMethod 簡(jiǎn)稱S P法 檢測(cè)胃癌組織CK Vimentin的蛋白表達(dá) 武漢大學(xué)病理教研室 S P法原理示意圖 過(guò)氧化物酶 鏈酶親和素 生物素 生物素化二抗 特異性一抗 待測(cè)抗原 武漢大學(xué)病理教研室 免疫組織化學(xué)基本實(shí)驗(yàn)流程 武漢大學(xué)病理教研室 具體步驟如下 1 石蠟切片二甲苯脫蠟 梯度酒精水化 以0 01MPBS pH7 4 漂洗3 5min 2 所有組織均采用微波修復(fù)抗原 3 室溫冷卻后 0 01MPBS pH7 4 漂洗3 5min 4 滴加50 l過(guò)氧化物酶阻斷液 試劑A 37 濕盒孵育10min 5 0 01MPBS pH7 4 漂洗3 5min 6 滴加非免疫性動(dòng)物血清 試劑B 37 濕盒孵育10min 武漢大學(xué)病理教研室 7 甩去多余血清 分別滴加 種抗體 4 濕盒孵育過(guò)夜 0 01MPBS pH7 4 漂洗3 5min 8 滴加生物素標(biāo)記的二抗 試劑C 37 濕盒孵育15min 0 01MPBS pH7 4 漂洗3 5min 9 滴加鏈親和素 過(guò)氧化物酶溶液 試劑D 37 濕盒孵育15min 0 01MPBS pH7 4 漂洗3 5min 10 每片滴加新鮮配制的二甲基聯(lián)苯胺 DAB 顯色液 光鏡下控制反應(yīng)時(shí)間 約為1 5min 自來(lái)水充分沖洗 蘇木素復(fù)染 11 常規(guī)脫水 透明 中性樹膠封片并鏡檢分析 12 陽(yáng)性對(duì)照采用已知陽(yáng)性片為標(biāo)準(zhǔn) 陰性對(duì)照采用PBS取代第一抗體 其余步驟相同 武漢大學(xué)病理教研室 實(shí)驗(yàn)流程中的注意事項(xiàng) 內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的滅活血清封閉沖洗抗體選擇及一抗孵育時(shí)間檢測(cè)及顯色系統(tǒng)復(fù)染 武漢大學(xué)病理教研室 染色前處理 取材 脫水 浸蠟 組織及時(shí)固定固定劑選擇 10 中性緩沖福爾馬林4 多聚甲醛常規(guī)下固定8 24小時(shí)取材厚度 2mm 武漢大學(xué)病理教研室 染色前處理 預(yù)防脫片 常選用多聚耐氨酸 poly L lysine 注意 1 應(yīng)嚴(yán)格控制使用次數(shù)2 玻片潔凈度 武漢大學(xué)病理教研室 染色前處理 包埋與切片 包埋 選擇低熔點(diǎn)石蠟 溫度不超過(guò)62 切片 厚度3 4 m烤片 溫度60 時(shí)間1小時(shí) 或60 2小時(shí) 邁新 或60 過(guò)夜 武漢大學(xué)病理教研室 染色前處理 切片保存 切片不宜長(zhǎng)時(shí)間在常溫下保存 武漢大學(xué)病理教研室 染色前處理 脫臘 原則 免疫組化的脫蠟試劑應(yīng)與常規(guī)HE脫蠟分開 武漢大學(xué)病理教研室 實(shí)驗(yàn)操作中的應(yīng)用 抗原修復(fù)實(shí)驗(yàn)操作中的注意事項(xiàng) 武漢大學(xué)病理教研室 抗原修復(fù) 影響染色結(jié)果的最關(guān)鍵因素抗原修復(fù)方法分類1 酶消化法2 加熱法 高壓法 水煮法 微波法 抗原修復(fù)液的選擇1 檸檬酸鹽緩沖液 PH7 2 7 4 2 Tris PH7 8 3 EDTA PH8 0 武漢大學(xué)病理教研室 內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的滅活 存在部位 紅細(xì)胞 橫紋肌細(xì)胞 粒細(xì)胞 單核細(xì)胞 肝細(xì)胞及腎細(xì)胞消除方法 3 H2O2浸泡10分鐘 武漢大學(xué)病理教研室 血清封閉 目的 減少非特異性著色時(shí)間 一般在加載一抗之前使用 武漢大學(xué)病理教研室 沖洗 一般采用PBS PH7 4 7 6 充分沖洗增加效果可加入Tween20 武漢大學(xué)病理教研室 一抗孵育時(shí)間及抗體選擇 應(yīng)選擇信譽(yù)高 質(zhì)量好的試劑公司抗體切忌反復(fù)凍融一抗為濃縮液時(shí) 需選擇最佳稀釋濃度按說(shuō)明書可采用37 1 2小時(shí)或4 冰箱過(guò)夜 武漢大學(xué)病理教研室 檢測(cè)及顯色系統(tǒng) 一般采用以生物素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法 如SP LSABC ABC等顯色方法 經(jīng)常采用辣根過(guò)氧化物酶系統(tǒng)檢測(cè) 武漢大學(xué)病理教研室 顯色系統(tǒng) 常用的酶1 辣根過(guò)氧化物酶 HRP A 顯色底物DAB 棕黃色敏感度高 定位清晰 易于觀察 保存B 顯色底物AEC 磚紅色2 堿性磷酸酶 AP 顯色底物 BCIP NBT 藍(lán)紫色 武漢大學(xué)病理教研室 復(fù)染 原則 注意兩者之間對(duì)比 突出陽(yáng)性信號(hào) 武漢大學(xué)病理教研室 實(shí)驗(yàn)對(duì)照設(shè)計(jì) 原則 所有檢測(cè)指標(biāo)均設(shè)陽(yáng)性對(duì)照 陰性對(duì)照 武漢大學(xué)病理教研室 結(jié)果分析 1 特定的定位胞膜型 胞漿型 全漿型或胞核型 局限性或彌散性 武漢大學(xué)病理教研室 免疫組化標(biāo)準(zhǔn)化照片 武漢大學(xué)病理教研室 2 染色的不均一性陽(yáng)性切片的染色應(yīng)分布不均 片狀或點(diǎn)