微生物實(shí)驗(yàn)報(bào)告細(xì)菌.doc

微生物實(shí)驗(yàn)報(bào)告題目 膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測(cè)年級(jí)專業(yè) 2013級(jí)臨床醫(yī)學(xué)八年制 實(shí)驗(yàn)者 學(xué)號(hào) 小組 成員 指導(dǎo)老師 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1.了解細(xì)菌生長(zhǎng)的基本營(yíng)養(yǎng)條件，熟悉培養(yǎng)基的類型，學(xué)習(xí)并掌握培養(yǎng)基的原則與方法。 2.掌握無(wú)菌操作技術(shù)，掌握病原菌的分離與培養(yǎng)方法。 3.了解并比較細(xì)菌在固體、半固體和液體培養(yǎng)基的生長(zhǎng)特征。 4.學(xué)習(xí)并掌握空氣及人體細(xì)菌檢測(cè)學(xué)方法。 5.掌握細(xì)菌涂片標(biāo)本的制備以及革蘭染色法，熟悉不同類型細(xì)菌的基本形態(tài)。 6.掌握糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、抗菌素敏感性實(shí)驗(yàn)和血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)的原理與方法。 7.從膿汁和糞便標(biāo)本中分離培養(yǎng)和檢測(cè)出病原體。二、實(shí)驗(yàn)器材 1.培養(yǎng)基的制備：干粉培養(yǎng)基、天平、蒸餾水、稱量皿、藥勺、錐形瓶、量筒、電爐、試管、洗耳球、試管筐、移液管、棉塞、牛皮紙、橡皮筋、手套、石棉網(wǎng) 2.空氣與人體體表細(xì)菌學(xué)檢查：瓊脂培養(yǎng)基、酒精、碘酒 3.細(xì)菌的分離培養(yǎng)：膿汁標(biāo)本、糞便標(biāo)本、伊紅美藍(lán)平板、營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、接種環(huán)、酒精燈、打火機(jī) 4.細(xì)菌的純培養(yǎng)：接種環(huán)、酒精燈、打火機(jī)、中性筆、斜面培養(yǎng)基 5.細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢測(cè)：斜面培養(yǎng)物、營(yíng)養(yǎng)肉湯、生理鹽水、鏡油瓶、拭鏡紙、吸水紙、載玻片、顯微鏡、接種環(huán)、酒精燈、打火機(jī)、中性筆、革蘭染色試劑、液體培養(yǎng)基 6.細(xì)菌的生化試驗(yàn)：葡萄糖發(fā)酵管、乳糖發(fā)酵管、接種針、酒精燈、打火機(jī)、中性筆、菌液、營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、接種環(huán)、藥物紙片（青霉素、慶大霉素、頭孢曲松）、玻片、兔血漿、生理鹽水 7.細(xì)菌的血清學(xué)試驗(yàn)：玻片、福氏志賀菌診斷血清、生理鹽水、接種環(huán)、酒精燈三、實(shí)驗(yàn)方法與步驟1.培養(yǎng)基的制備稱量瓊脂粉蒸餾水加熱溶化分裝集中放在試管筐里罩上硫酸紙、牛皮紙 用橡皮筋扎好 放入講臺(tái)邊的滅菌桶或滅菌筐內(nèi)送到高壓蒸汽滅菌室（洗刷室）滅菌 2.空氣與人體體表細(xì)菌學(xué)檢查2.1空氣的細(xì)菌學(xué)檢查每組1個(gè)營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，選擇實(shí)驗(yàn)樓女廁所將平板蓋打開(kāi)，蓋朝下放置在平板旁邊平板暴露于空氣中15分鐘平板倒扣蓋上作標(biāo)記37溫箱培養(yǎng)24小時(shí)觀察結(jié)果。2.2人體體表細(xì)菌學(xué)檢查甲丙常規(guī)洗手，乙丁標(biāo)準(zhǔn)洗手。甲和乙、丙和丁分別共用1個(gè)平板按下圖在普通平板上接種手指上的細(xì)菌。第1格為洗手前，第2格為洗手后，第3格為消毒后，第4格空白對(duì)照。3.細(xì)菌的分離培養(yǎng)3.1 實(shí)驗(yàn)方法平板劃線法：借助于劃線，將混雜的多種細(xì)菌，在平板表面分散成單個(gè)細(xì)菌，并固定在某一點(diǎn)上。培養(yǎng)以后細(xì)菌各自分裂繁殖，形成肉眼可見(jiàn)的細(xì)菌集團(tuán)（單菌落）。3.2實(shí)驗(yàn)步驟 接種環(huán)燒灼滅菌分別取膿汁標(biāo)本與糞便標(biāo)本點(diǎn)在普通平板和依紅美藍(lán)平板上，各做兩份，燒掉接種環(huán)上多余的標(biāo)本冷卻后，應(yīng)用分區(qū)劃線分離法，將膿汁標(biāo)本接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板（2份），糞便標(biāo)本接種于伊紅美藍(lán)平板（2份）接種環(huán)燒灼滅菌將平板倒置37培養(yǎng)1824h觀察結(jié)果 。4.細(xì)菌的純培養(yǎng)甲普通平板金黃色菌落(auratus，golden yellow)1支斜面 乙普通平板白色菌落(albus，white)1支斜面 丙 EMB平板紫黑色菌落(atropurpureus)1支斜面 丁 EMB平板粉紅色菌落(pink) 1支斜面 斜面正面上2/3作標(biāo)記：組號(hào) + 金黃、白色、紫黑、粉紅。5.細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢測(cè)5.1革蘭試劑染色5.2顯微鏡油鏡使用步驟10物鏡看清標(biāo)本滴加香柏油100油鏡浸泡油中模糊物象細(xì)調(diào)節(jié)調(diào)焦，觀察物像記錄結(jié)果關(guān)閉電源 擦鏡紙拭去香柏油 擦鏡紙沾少許乙醇和乙醚（7:3）混合液擦拭擦鏡紙擦拭油鏡。5.3肉湯接種法 接種環(huán)燒灼滅菌分別在斜面培養(yǎng)物中挑取菌苔少許立即移入肉湯培養(yǎng)基管中在接近液面的管壁上輕輕研磨沾取少量肉湯調(diào)和混勻試管口通過(guò)火焰2-3次滅菌塞好棉塞35培養(yǎng)46小時(shí) 6.細(xì)菌的生化試驗(yàn)6.1細(xì)菌的糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)接種針燒灼滅菌用滅菌接種針?lè)謩e刮取實(shí)驗(yàn)所得到的紫黑色和粉紅色菌苔分別接種在葡萄糖發(fā)酵微量管中和乳糖發(fā)酵微量管內(nèi)接種環(huán)燒灼滅菌將微量管平放在平板內(nèi)37培養(yǎng)過(guò)夜后觀察結(jié)果。6.2藥敏實(shí)驗(yàn)接種環(huán)燒灼滅菌分別取之前實(shí)驗(yàn)中得到的四種菌液在普通平板密集涂布（如圖6）接種環(huán)燒灼滅菌 標(biāo)記:青、頭、慶 鑷子火焰消毒貼青霉素、頭孢曲松、慶大霉素紙片 按壓鑷子消毒倒置37培養(yǎng)6.3凝固酶實(shí)驗(yàn)取干凈玻片一張?jiān)谧笥覂蛇叿謩e滴加兔血漿1-2滴，生理鹽水1滴接種環(huán)燒灼滅菌冷卻分別用接種環(huán)取之前實(shí)驗(yàn)所得到的白色和黃色菌苔(23個(gè)菌落的菌量)與血漿研磨混合邊混勻邊觀察結(jié)果接種環(huán)燒灼滅菌稍等片刻，觀察結(jié)果6.4動(dòng)力實(shí)驗(yàn)接種針燒灼滅菌分別用接種針在紫黑色和粉紅色的斜面取菌從半固體培養(yǎng)基中心垂直刺入，可刺達(dá)近底管處，但不要到達(dá)管底循原來(lái)的路線退出接種針試管口迅速通過(guò)火焰2-3次滅菌塞好棉塞燒灼滅菌接種針37培養(yǎng)24小時(shí)觀察結(jié)果7.細(xì)菌的血清學(xué)試驗(yàn)取潔凈的載玻片一張將磨面近端設(shè)為對(duì)照區(qū)滴加生理鹽水15ul遠(yuǎn)端設(shè)為試驗(yàn)區(qū)滴加福氏志賀菌診斷血清15ul接種環(huán)燒灼滅菌用接種環(huán)分別取粉紅色菌苔研磨于鹽水或血清內(nèi)，混合均勻接種環(huán)燒灼滅菌載玻片來(lái)回傾側(cè)觀察結(jié)果四、結(jié)果與討論1.人體體表細(xì)菌學(xué)檢查洗手前細(xì)菌較多，有黃色和白色兩種菌；洗手后細(xì)菌總數(shù)沒(méi)有明顯減少甚至有增加，以白色菌為主。用碘酒擦拭過(guò)的手無(wú)明顯的細(xì)菌菌落，空白對(duì)照無(wú)菌落。洗手可能只能洗掉部分暫住菌（黃色），而不能完全去除手上的全部細(xì)菌，碘酒具有很好的殺菌功能，可基本殺滅手上的細(xì)菌。2.細(xì)菌的分離培養(yǎng)結(jié)果標(biāo)本膿汁糞便菌落顏色黃色白色紫黑色粉紅色形態(tài)特征圓形、隆起、表面光滑、邊緣整齊、不透明，菌落直徑2mm左右具有金屬光澤、大而隆起、不透明，菌落直徑23mm半透明，直徑12mm結(jié)果分析：糞便標(biāo)本在伊紅美藍(lán)平板上，形成的紫黑色、淡粉紅色兩種菌落，菌落色素是水溶性的，不是細(xì)菌本身的顏色，顏色的產(chǎn)生是因?yàn)榇竽c埃希菌分解乳糖產(chǎn)酸，酸使伊紅與美藍(lán)結(jié)合，形成紫黑色，而致病菌不分解乳糖，菌落呈伊紅的顏色，淡粉紅色。 觀察伊紅美藍(lán)平板，發(fā)現(xiàn)個(gè)別菌落中心黑色，邊緣粉紅色，此種類型的菌落多出現(xiàn)在劃線密集，菌落較集中的地方，推測(cè)原因是，大腸桿菌利用完乳糖以后，就要利用蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)分解大多產(chǎn)生堿性物質(zhì)，中和了乳糖分解時(shí)產(chǎn)生的酸，導(dǎo)致了大腸桿菌菌落顏色的改變。3.細(xì)菌的純培養(yǎng) 從普通平板上挑選的黃色或白色菌落接種的斜面，觀察菌苔的顏色與之前無(wú)明顯差別；從伊紅美藍(lán)平板上挑取的紫黑色和粉紅色菌落失去了原來(lái)的顏色，都變灰白色，表面光滑濕潤(rùn)，這是因?yàn)樗苄陨刂挥性谝良t美藍(lán)中才能顯現(xiàn)出紫黑色和粉紅色。4.細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢測(cè) 菌落來(lái)源膿汁糞便菌落顏色金黃色白色紫黑色粉紅色油鏡特征呈紫紅色，排列不規(guī)則，呈葡萄串狀，是典型的葡萄球菌呈粉紅色，紫黑色菌呈長(zhǎng)弧狀，粉紅色呈短桿狀，散在排列，從形態(tài)上不能鑒別是什么細(xì)菌。分析討論革蘭氏染色原理：G菌：細(xì)胞壁厚，肽聚糖網(wǎng)狀分子形成一種透性障，當(dāng)乙醇脫色時(shí)，肽聚糖脫水而孔障縮小，故保留結(jié)晶紫-碘復(fù)合物在細(xì)胞膜上。呈紫色。G菌：肽聚糖層薄，交聯(lián)松散，乙醇脫色不能使其結(jié)構(gòu)收縮，其脂含量高,乙醇將脂溶解，縫隙加大，結(jié)晶紫-碘復(fù)合物溶出細(xì)胞壁，沙黃復(fù)染后呈紅色。綜上所述，金黃、白色兩種菌落，顯微鏡油鏡下均為G+球菌，結(jié)合鏡檢特征可知這兩株細(xì)菌屬于葡萄球菌，再結(jié)合菌落色素，這兩株葡萄球菌分別是金黃色葡萄球菌和白色葡萄球菌。；紫黑色菌落，粉紅色菌落，顯微鏡下均為G-桿菌。5.藥敏實(shí)驗(yàn)菌落黃色白色紫黑色粉紅色青霉素+-頭孢曲松+慶大霉素+備注：“+”為敏感，“-”為耐藥 表 1藥敏試驗(yàn)結(jié)果分析討論紙片擴(kuò)散法將含有定量抗菌素的紙片，平貼在已經(jīng)接種了試驗(yàn)細(xì)菌的平板上。紙片中的抗菌素吸收培養(yǎng)基的水分，溶解后不斷向周圍擴(kuò)散，形成遞減的梯度濃度。敏感細(xì)菌在紙片周圍的生長(zhǎng)受到抑制，而形成沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)的抑菌圈。G+球菌對(duì)青霉素和頭孢曲松敏感。 G-桿菌對(duì)青霉素耐藥，對(duì)頭孢曲松敏感。G+球菌和G-桿菌對(duì)廣譜抗菌素慶大霉素都敏感。6.凝血酶實(shí)驗(yàn)致病性葡萄球菌能產(chǎn)生血漿凝固酶，可使血漿中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄岳w維蛋白,附著于菌體表面,形成凝塊。因此金黃色菌為有致病性的金黃色葡萄球菌，白色為無(wú)致病性的白色葡萄球菌。7.糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)與動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)菌落葡萄糖發(fā)酵現(xiàn)象乳糖發(fā)酵現(xiàn)象動(dòng)力試驗(yàn)現(xiàn)象紫黑色黃色，產(chǎn)酸又產(chǎn)氣，分解糖黃色，產(chǎn)酸又產(chǎn)氣，分解糖擴(kuò)散生長(zhǎng)，培養(yǎng)基呈擴(kuò)散云霧混沌狀態(tài)粉紅色黃色，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，分解糖紫黃色，分解少量糖，不產(chǎn)氣沿穿刺線生長(zhǎng)，穿刺線邊緣整齊，周圍培養(yǎng)基清澈透明分析討論具有鞭毛能夠真正運(yùn)動(dòng)的細(xì)菌，在半固體培基中,能沖破低濃度瓊脂的阻力，自接種部位向周圍移動(dòng)擴(kuò)散生長(zhǎng)，使培養(yǎng)基呈根須狀或云霧狀混濁狀態(tài)。無(wú)鞭毛不能運(yùn)動(dòng)的細(xì)菌，只能沿著穿刺線生長(zhǎng)繁殖，穿刺線邊緣清晰，周圍培養(yǎng)基清澈透明。所以紫黑色菌右鞭毛，粉紅色菌無(wú)鞭毛。根據(jù)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象與生化反應(yīng)鑒別表（圖22）可判斷出紫黑色菌為大腸埃希菌，粉紅色菌為福賀志氏菌。8.細(xì)菌血清學(xué)實(shí)驗(yàn) 在載玻片上滴加生理鹽水的血液沒(méi)有發(fā)生凝集，而滴加福氏志賀菌的血清發(fā)生了明顯的凝集。在適量電解質(zhì)存在的情況下，顆粒性抗原(細(xì)菌)與特異性抗體結(jié)合，如果比例合適，則出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集塊，稱為凝集反應(yīng)。滴加生理鹽水的血沒(méi)有發(fā)生凝集，滴加福氏志賀菌的福氏志賀菌診斷血清發(fā)生凝集反應(yīng)，證明福氏志賀菌具有致病性。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果膿汁和糞便標(biāo)本細(xì)菌檢測(cè)結(jié)果標(biāo)本菌落形態(tài)血漿凝固酶葡乳半福痢血清青鏈慶結(jié)論膿汁黃色G+球 +金黃色葡萄球菌白色G+球-+白色葡萄球菌糞便紫黑G桿 +-+大腸埃希菌粉紅G桿+-+-+福氏志賀菌膿汁標(biāo)本中分離得黃色菌落為金黃色葡萄球菌，白色菌落為白色葡萄球菌，致病菌為金黃色葡萄球菌；糞便標(biāo)本中分離得紫黑色菌落為大腸埃希菌，粉紅