生化反應(yīng)工程-周華從

,制藥反應(yīng)工程,第六章 生化反應(yīng)工程基礎(chǔ) 趙瑞芬 周華從 2015年11月,生化反應(yīng)工程基礎(chǔ)知識；生化反應(yīng)工程特點；,酶催化反應(yīng)及其動力學(xué)；微生物反應(yīng)及其動力學(xué)；,6.1,概述,6.2,生化反應(yīng)動力學(xué)基礎(chǔ),固定化生物催化劑,生化反應(yīng)器,酶和細胞的固定化；固定化生物催化劑的催化動力學(xué)；,生化反應(yīng)器類型；生化反應(yīng)器計算,6.3,6.4,生化反應(yīng)工程基礎(chǔ)知識；生化反應(yīng)工程特點；,酶催化反應(yīng)及其動力學(xué)；微生物反應(yīng)及其動力學(xué)；,6.1,概述,6.2,生化反應(yīng)動力學(xué)基礎(chǔ),6.1 概述,生化反應(yīng) 工程,生物化學(xué) 工程,化學(xué)反應(yīng) 工程,使用生物催化劑；生物技術(shù)實現(xiàn)產(chǎn)業(yè) 化的關(guān)鍵之一。,生化反應(yīng)本質(zhì)是化學(xué)反應(yīng)；用化學(xué)反應(yīng)工程的原理和方 法解決生化反應(yīng)問題,生化反應(yīng)工程將化學(xué)反應(yīng)工程的原理和方法用于生化反應(yīng)及生化反應(yīng)器設(shè)計、分析及確定最優(yōu)操作條件的一門科學(xué)分支。,6.1.1 生化反應(yīng)工程基礎(chǔ)知識,研究對象：生物催化劑與生化反應(yīng)、生化反應(yīng)器設(shè)計與分析,6.1 概述,反應(yīng)工程研究內(nèi)容,反應(yīng)工程,反應(yīng)動力學(xué),反應(yīng)器設(shè)計與分析,研究內(nèi)容：,？,生化,生化,生化,6.1.1 生化反應(yīng)工程基礎(chǔ)知識,游離酶或固定化酶、游離細胞或固定化細胞。,6.1 概述,原料預(yù)處理；生物催化劑制備及生化反應(yīng)；產(chǎn)品分 離與純化。,應(yīng)用生物學(xué)、化學(xué)和工程學(xué)的基本原理，利用生物體 （如微生物、動/植物細胞）或其組成部分（如酶或細 胞器)來生產(chǎn)有用物質(zhì)，或為人類提供某種服務(wù)的技術(shù)。,生物催化劑：,生化反應(yīng)：,生物技術(shù)：,由生物催化劑催化的反應(yīng)。包括三個過程：,與化學(xué)反應(yīng)過程相比較，生化反應(yīng)過程具備以下特點：,6.1 概述,6.1.2 生化反應(yīng)工程特點,生物催化劑除單酶體系外，多酶或微生物細胞催化體系復(fù)雜；通常為氣液固多相系統(tǒng)，反應(yīng)物系復(fù)雜，；具有反應(yīng)條件溫和、催化專一性強和反應(yīng)選擇性高的優(yōu)點；生物催化劑對環(huán)境敏感，對反應(yīng)器的構(gòu)造和過程控制要求較高；反應(yīng)速率通常受到反應(yīng)物和產(chǎn)物濃度的限制，且所需反應(yīng)器體積較大。,一、 酶的概述,1 酶的分類：,酶(Enzyme)是由活細胞產(chǎn)生的具有催化活性和高度 選擇性的特殊蛋白質(zhì)。,組 成,單純蛋白質(zhì),酶蛋白分子與輔助因子組成全酶,酶的分類：按照酶催化反應(yīng)類型，分為：,氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、異構(gòu)酶和合成酶,參考：生物化學(xué)，王鏡巖 等，第三版，北京大學(xué)出版社,6.2 生化反應(yīng)動力學(xué)基礎(chǔ),6.2.1 酶催化反應(yīng)及其動力學(xué),酶具有一般化學(xué)催化劑所具有的性質(zhì)。,降低反應(yīng)的活化能；不影響反應(yīng)的平衡常數(shù)；加速反應(yīng)的進行；酶本身不被消耗，且能恢復(fù)到原來的狀態(tài)。,酶同時具有蛋白質(zhì)的性質(zhì)。,需要適宜的反應(yīng)溫度、pH、溶劑的介電常數(shù)、離子強度等，極易受到物理因素和化學(xué)因素的影響，容易失活甚至變性。,6.2 生化反應(yīng)動力學(xué)基礎(chǔ),6.2.1 酶催化反應(yīng)及其動力學(xué),2 酶的特性 ：,E (Enzyme), 酶；,S (Substrate), 底物；,以單底物S生成產(chǎn)物P的酶催化反應(yīng)為例，其反應(yīng)歷程為：,P (Product), 產(chǎn)物；,酶和底物非共價鍵結(jié)合，形成酶-底物中間絡(luò)合物ES；ES絡(luò)合物解離，生成產(chǎn)物P并釋放E, 開始下一個底物 的反應(yīng)。,6.2 生化反應(yīng)動力學(xué)基礎(chǔ),6.2.1 酶催化反應(yīng)及其動力學(xué),3 酶催化反應(yīng)歷程 ：,酶的活性：即酶催化反應(yīng)速率，在規(guī)定條件下，每微摩爾酶每分鐘催化底物轉(zhuǎn)化的微摩爾數(shù)。,酶單位：在規(guī)定條件下，每分鐘催化1微摩爾底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量，定義為一個酶單位（U, Unit）。,二者關(guān)系：若酶的活性為 a mol /(min mol ），則一個酶單位可表示為 1/a mol/(min mol ),6.2 生化反應(yīng)動力學(xué)基礎(chǔ),6.2.1 酶催化反應(yīng)及其動力學(xué),4 酶的活性定義：,酶催化與化學(xué)催化反應(yīng)能量變化,與化學(xué)催化相比較，酶催化有如下特點：,6.2 生化反應(yīng)動力學(xué)基礎(chǔ),6.2.1 酶催化反應(yīng)及其動力學(xué),5 酶催化特點：,酶的催化效率高：通常比非酶催化高107 1013倍。,？,酶催化降低了從底物到過渡態(tài)絡(luò)合物所需的活化能，且不改變反應(yīng)中總能量的變化。,專一性,酶對底物的專一性,底物結(jié)構(gòu)專一性,立體專一性,酶對基團的專一性, 酶催化反應(yīng)具有高度的專一性：,酶對反應(yīng)的專一性,6.2 生化反應(yīng)動力學(xué)基礎(chǔ),6.2.1 酶催化反應(yīng)及其動力學(xué),5 酶催化特點：,6.2 生化反應(yīng)動力學(xué)基礎(chǔ),6.2.1 酶催化反應(yīng)及其動力學(xué), 反應(yīng)條件溫和；, 選擇性高，副產(chǎn)物少，易于分離；,對環(huán)境因素敏感，具有適宜的反應(yīng)溫度、pH、離子 強度等。,5 酶催化特點：,反應(yīng)溫度：酶催化反應(yīng)速率與溫度曲線呈鐘罩形。 反應(yīng)pH：影響酶與底物結(jié)合和解離的速率；甚至影響 酶的空間結(jié)構(gòu),6.2 生化反應(yīng)動力學(xué)基礎(chǔ),6.2.1 酶催化反應(yīng)及其動力學(xué),6 影響酶催化反應(yīng)速率的因素：, 酶濃度、底物濃度、產(chǎn)物濃度、離子強度和抑制劑等。,對于典型的單底物酶催化反應(yīng)：,反應(yīng)機理可表示為：,6.2 生化反應(yīng)動力學(xué)基礎(chǔ),6.2.1 酶催化反應(yīng)及其動力學(xué),二 單底物酶催化反應(yīng)動力學(xué)米氏方程,一定條件下，反應(yīng)速率 r與底物濃度S關(guān)系：,通過米氏方程(Michaelis-Menten Equation)定量描述反應(yīng)速率與底物濃度的關(guān)系：,cS為底物S的濃度；rmax=k2cE0是最大反應(yīng)速率(所有酶分子均與底物結(jié)合)，其中cE0為酶的初始濃度；,6.2 生化反應(yīng)動力學(xué)基礎(chǔ),6.2.1 酶催化反應(yīng)及其動力學(xué),，稱為米氏常數(shù)，表示酶和底,物間的親和力大?。篕m越小，則親和力越大，ES越不易解離； Km與酶催化反應(yīng)物系的特性及其反應(yīng)條件有關(guān)，是酶催化反應(yīng)性質(zhì)的特性常數(shù)。,底物濃度與酶催化反應(yīng)速率的關(guān)系,當cS,Km時，底物濃度低，一級反應(yīng)；,當?shù)孜餄舛葹橹虚g值時，隨著cS增大反應(yīng)從一級向零級過渡，為變級數(shù)過程。,6.2 生化反應(yīng)動力學(xué)基礎(chǔ),6.2.1 酶催化反應(yīng)及其動力學(xué),當cS,Km時，底物濃度高，零級反應(yīng)；,當Km=cS時，r = rmax/2,Km數(shù)值上等于反應(yīng)速率為rmax/2 時cS的值。,6.2 生化反應(yīng)動力學(xué)基礎(chǔ),6.2.1 酶催化反應(yīng)及其動力學(xué),米氏方程變形公式Lineweaver-Burk法（L-B法）,6.2 生化反應(yīng)動力學(xué)基礎(chǔ),6.2.1 酶催化反應(yīng)及其動力學(xué),例題分析,例題（P251）：在pH為5.1及15下，測得葡萄糖淀粉酶水解麥芽糖的初速率與麥芽糖濃度的關(guān)系如下：,求：該淀粉酶水解麥芽糖反應(yīng)的Km和rmax？,酶催化反應(yīng)中，某些物質(zhì)（外源物質(zhì)、反應(yīng)底物或產(chǎn)物等）的存在使反應(yīng)速率下降，這些物質(zhì)被稱作抑制劑(I, Inhibitor)，其效應(yīng)稱為抑制作用。,可逆抑制：酶與抑制劑之間靠非共價鍵結(jié)合，存在解離 平衡，可通過透析等方法除去,不可逆抑制：酶與抑制劑之間靠共價鍵相結(jié)合，使活性酶 濃度降低,根據(jù)抑制機理不同，可逆抑制分為：競爭性抑制、非競爭性抑制、反競爭性抑制、底物抑制。,6.2 生化反應(yīng)動力學(xué)基礎(chǔ),6.2.1 酶催化反應(yīng)及其動力學(xué),三 有抑制作用時的酶催化反應(yīng)動力學(xué),抑制作用,1 競爭性抑制,當抑制物與底物的結(jié)構(gòu)類似時，它們將競爭酶的同一可結(jié)合部位（活性位），阻礙了底物與酶相結(jié)合，導(dǎo)致酶催化反應(yīng)速率降低。,6.2 生化反應(yīng)動力學(xué)基礎(chǔ),6.2.1 酶催化反應(yīng)及其動力學(xué),6.2 生化反應(yīng)動力學(xué)基礎(chǔ),6.2.1 酶催化反應(yīng)及其動力學(xué),KI表示抑制物與酶的親和力大小；,可增加底物濃度來提高反應(yīng)速率。,KmI為有競爭性抑制時的米氏常數(shù)。,其中，,1 競爭性抑制,抑制物與酶的非活性部位結(jié)合，形成抑制物酶的絡(luò)合物后再與底物結(jié)合，或者部分底物酶絡(luò)合物與抑制物結(jié)合，所形成的底物酶抑制物不能直接生成產(chǎn)物，導(dǎo)致酶催化反應(yīng)速率降低。,2 非競爭性抑制,6.2 生化反應(yīng)動力學(xué)基礎(chǔ),6.2.1 酶催化反應(yīng)及其動力學(xué),6.2 生化反應(yīng)動力學(xué)基礎(chǔ),6.2.1 酶催化反應(yīng)及其動力學(xué),非競爭性抑制時的最大速率：,增加反應(yīng)物濃度也不能減弱非競爭性抑制物對反應(yīng)速率的影響。,2 非競爭性抑制,有些抑制劑不能直接與游離酶相結(jié)合，而只能與底物-酶絡(luò)合物相結(jié)合，形成底物酶抑制劑中間絡(luò)合物，且該絡(luò)合物不能生成產(chǎn)物，使酶催化反應(yīng)速率下降。,3 反競爭性抑制,6.2 生化反應(yīng)動力學(xué)基礎(chǔ),6.2.1 酶催化反應(yīng)及其動力學(xué),6.2 生化反應(yīng)動力學(xué)基礎(chǔ),6.2.1 酶催化反應(yīng)及其動力學(xué),3 反競爭性抑制,酶催化反應(yīng)速率隨底物濃度的升高先增大后降低，高濃度底物造成反應(yīng)速率下降。底物抑制是由于多個底物分子與酶的活性中心結(jié)合，所形成的絡(luò)合物不能分解為產(chǎn)物所致。,4 底物抑制,6.2 生化反應(yīng)動力學(xué)基礎(chǔ),6.2.1 酶催化反應(yīng)及其動力學(xué),酶催化反應(yīng)速率與底物濃度關(guān)系不是雙曲函數(shù)，而是拋物線關(guān)系。,6.2 生化反應(yīng)動力學(xué)基礎(chǔ),6.2.1 酶催化反應(yīng)及其動力學(xué),，底物抑制時的解離常數(shù),對cS求導(dǎo)，令,，得,底物抑制時r-cS關(guān)系,(optimal),4 底物抑制,rmax,6.2 生化反應(yīng)動力學(xué)基礎(chǔ),6.2.1 酶催化反應(yīng)及其動力學(xué),有/無抑制作用時的酶催化反應(yīng)動力學(xué)對比,無抑制,競爭性抑制,非競爭性抑制,反競爭性抑制,底物抑制,Km,rmax,cS , 則 r？,rmax,Km,rmax,Km,Km,X,X,微生物反應(yīng)(發(fā)酵過程)是利用微生物中特定的酶系進行的復(fù)雜生化反應(yīng)過程。,厭氧發(fā)酵（乙醇發(fā)酵、丙酮丁醇發(fā)酵和乳酸發(fā)酵等）,通氣發(fā)酵（抗生素發(fā)酵、氨基酸發(fā)酵等）,發(fā)酵產(chǎn)品種類,微生物細胞本身,微生物代謝產(chǎn)物或轉(zhuǎn)化產(chǎn)物,微生物酶,代謝過程本身（如廢水處理）,6.2 生化反應(yīng)動力學(xué)基礎(chǔ),6.2.2 微生物的反應(yīng)過程動力學(xué),對氧氣的需求,微生物反應(yīng)包括以下過程：,質(zhì)量傳遞過程：營養(yǎng)物質(zhì)向微生物細胞內(nèi)的傳遞和代謝產(chǎn)物向細胞外 的傳遞；氧氣擴散與傳遞微生物細胞生長與代謝過程；微生物群體的退化與變異過程。,以代謝產(chǎn)物為目標產(chǎn)物的微生物反應(yīng)過程中，生化反應(yīng)速率及其影響因素：1 細胞生長速率；2 基質(zhì)消耗速率；3 產(chǎn)物生成速率；4 氧的消耗速率。,6.2 生化反應(yīng)動力學(xué)基礎(chǔ),6.2.2 微生物的反應(yīng)過程動力學(xué),細胞的生長速率rx：在單位體積培養(yǎng)液中，單位時間內(nèi)生成的細胞（菌體）量，即：,在給定條件下，細胞生長可以用細胞濃度變化來定量描述。,V為培養(yǎng)液體積，mx為細胞質(zhì)量。對于恒容過程，細胞的生長速率可定義為：,cx為細胞濃度，常用單位體積培養(yǎng)液中所含細胞干重表示。,6.2 生化反應(yīng)動力學(xué)基礎(chǔ),6.2.2 微生物的反應(yīng)過程動力學(xué),一 細胞生長動力學(xué),均衡生長類似于一級自催化反應(yīng)，以細胞干重增加為基準的生長速率與細胞濃度成正比，比例系數(shù)為，即,表示單位菌體濃度的細胞生長速率，是描述細胞生長速率的一個重要參數(shù)，稱為比生長速率。比生長速率大小表示菌體增長的能力，受到菌株和各種物理化學(xué)環(huán)境因素的影響。,6.2 生化反應(yīng)動力學(xué)基礎(chǔ),6.2.2 微生物的反應(yīng)過程動力學(xué),在細胞間歇培養(yǎng)中的比生長速率為,cx0為起始菌體濃度。,6.2 生化反應(yīng)動力學(xué)基礎(chǔ),6.2.2 微生物的反應(yīng)過程動力學(xué),當細胞處于指數(shù)生長期時，一般為常數(shù)，所以,針對確定的菌株，在溫度和pH等恒定時，細胞比生長速率與限制型底物濃度的關(guān)系可以用Monod方程表示。,6.2 生化反應(yīng)動力學(xué)基礎(chǔ),6.2.2 微生物的反應(yīng)過程動力學(xué),細胞的生長均為均衡性生長，描述細胞生長的唯一變量是細胞濃度；培養(yǎng)基中僅有一種底物是細胞生長限制性基質(zhì)，其余組分均過量， 其變化不影響細胞生長。 將細胞生長視為單一反應(yīng)，且對基質(zhì)的細胞收率Yx/S為常數(shù)。 Yx/S為每消耗單位質(zhì)量基質(zhì)所生成的細胞質(zhì)量。,Monod方程假設(shè)：,6.2 生化反應(yīng)動力學(xué)基礎(chǔ),6.2.2 微生物的反應(yīng)過程動力學(xué),cS為限制性基質(zhì)的濃度（g/L）；max為最大比生長速率（h-1）;Ks為飽和系數(shù)（g/L），即Monod常數(shù)，其值等于最大比生長速率一半時限制性基質(zhì)的濃度，是表征某種生長限制性基質(zhì)與細胞生長速率間依賴關(guān)系的一個常數(shù)。,Monod方程：,，由于,得到,當cS,Ks時，,，一級動力學(xué)關(guān)系；, max，零級動力學(xué)關(guān)系。,6.2 生化反應(yīng)動力學(xué)基礎(chǔ),6.2.2 微生物的反應(yīng)過程動力學(xué),當cS,Ks時，,細胞比生長速率與限制性底物濃度關(guān)系,6.2 生化反應(yīng)動力學(xué)基礎(chǔ),6.2.2 微生物的反應(yīng)過程動力學(xué),例題分析,例題(P259)：在全混流反應(yīng)器中，以葡萄糖為限制性基質(zhì)，在一定條件下培養(yǎng)曲霉sp。實驗測得不同基質(zhì)濃度下曲霉sp比生長速率如下所示：,若該條件下曲霉sp生長符合Monod方程，試求該條件下的max和KS。,基質(zhì)的比消耗速率qS：單位細胞濃度的基質(zhì)消耗速率。,產(chǎn)物的比生成速率qP: 單位細胞濃度產(chǎn)物的生成速率。,6.2 生化反應(yīng)動力學(xué)基礎(chǔ),6.2.2 微生物的反應(yīng)過程動力學(xué),二 基質(zhì)消耗動力學(xué),基質(zhì)消耗速率：在單位體積培養(yǎng)基單位時間內(nèi)消耗基質(zhì)(碳源、氮源、氧等)的質(zhì)量。以單一限制性基質(zhì)消耗動力學(xué)為例：,在間歇培養(yǎng)中基質(zhì)消耗速率為：,6.2 生化反應(yīng)動力學(xué)基礎(chǔ),6.2.2 微生物的反應(yīng)過程動力學(xué),三 產(chǎn)物生成動力學(xué),根據(jù)產(chǎn)物形成與細胞生長間的不同關(guān)系,發(fā)酵過程可分為型、型和型。,型：細胞生長與產(chǎn)物合成耦聯(lián)型，即細胞生長與產(chǎn)物合成直接相關(guān)連，它們之間是同步的。YP/x：單位質(zhì)量細胞單位時間內(nèi)產(chǎn)物的得率。,主要是葡萄糖代謝的初級中間產(chǎn)物，如乙醇、乳酸發(fā)酵等,6.2 生化反應(yīng)動力學(xué)基礎(chǔ),6.2.2 微生物的反應(yīng)過程動力學(xué),型：細胞生長與產(chǎn)物合成半耦聯(lián)型，即產(chǎn)物的生成與細胞的生長部分耦聯(lián)，細胞生長前期基本無產(chǎn)物生成，一旦有產(chǎn)物生成后，產(chǎn)物的生成速率既與細胞生長有關(guān)，又與細菌濃度有關(guān)。,(、為常數(shù)),谷氨酸發(fā)酵和檸檬酸發(fā)酵等。, 型：細胞生