微生物遺傳與分子生物學(xué)

微生物遺傳與分子生物學(xué) 5 15 1 25 100 分 本課程主要涉及到微生物中主要的模式菌株 原核微生物 放線菌 鏈霉菌 大腸桿菌 芽孢桿菌 乳酸菌 古菌等 真核微生物 漢遜酵母 釀酒酵母 白念珠菌等 第 1 章 概論 基因的符號(hào) 每個(gè)基因 如色氨酸基因 trp 同一表型的不同基因 如 trpA 或 trpB 等 當(dāng)染色體上發(fā)生缺失時(shí)可用 表示 如 trpA 或 trpA 基因突變 如亮氨酸缺陷型 leu 抗藥性基因 r 表示抗性 加 s 表示敏感 如鏈霉素抗性基因表示為 strr 敏感基因表示為 strs 1 微生物基因突變一般分幾種類型 突變有什么生物學(xué)意義 譚老師 基因突變可從突變發(fā)生方式和突變引起的表型改變和遺傳物質(zhì)改變等方面進(jìn)行 分類 按突變體表型特征的不同 可把突變分為以下 4 個(gè)類型 1 形態(tài)突變型 2 生化突變型 3 致死突變型 按突變所引起的遺傳信息的改變 又可把突變分為 1 錯(cuò)義突變 2 同義突變 3 無(wú)義突變 根據(jù)遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變 可分為堿基置換 移碼 DNA 片段插入和缺失 根據(jù)突變發(fā)生的方式 可分為自發(fā)突變和誘發(fā)突變 突變的生物學(xué)意義 基因突變導(dǎo)致了基因表達(dá)出來(lái)的性狀發(fā)生了改變 對(duì)突變個(gè)體本身來(lái)講 絕大多數(shù)是有害的 因?yàn)楝F(xiàn)有的生物基本上都適應(yīng)了現(xiàn)在的環(huán)境 但是環(huán)境是可變的 如果生物不變 那就很可能被淘汰 所以 對(duì)整個(gè)生 物群體來(lái)說(shuō) 突變使群體不會(huì)滅亡 環(huán)境不斷改變 生物通過(guò)不斷突變而適應(yīng) 也就使其被保存下來(lái) 最終 物種的面貌特征與祖先不同 所以說(shuō) 突變是生物進(jìn)化的內(nèi)因 是 進(jìn)化的主要?jiǎng)恿?無(wú)數(shù)事實(shí)說(shuō)明了一個(gè)真理 即宇宙間的所有物種變是絕對(duì)的 不變則是相對(duì)的 2 應(yīng)用于鏈霉菌基因組編輯與大片段 DNA 克隆的技術(shù)都有哪些 能否用在你 們今后的實(shí)驗(yàn)中 劉鋼老師 基因組編輯是指在基因組水平上對(duì) DNA 序列進(jìn)行改造的遺傳操作技術(shù) 原 理是構(gòu)建一個(gè)人工內(nèi)切酶 在預(yù)定的基因組位置切斷 DNA 切斷的 DNA 在被細(xì) 胞內(nèi)的 DNA 修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生突變 從而達(dá)到改造基因組的目的 鏈霉菌基因組編輯有 I SecI endonuclease 介導(dǎo)的同源重組系統(tǒng) 敲除質(zhì)粒上含有一串聯(lián)的與靶片段左右臂同源的兩個(gè) DNA 片段以及 I SecI 識(shí)別 的 18 個(gè)堿基的位點(diǎn) sceS 將該質(zhì)粒導(dǎo)入鏈霉菌細(xì)胞 并通過(guò)抗性篩選質(zhì)粒 插入到基因組上的克隆 如果發(fā)生同源單交換 該質(zhì)粒將被完整導(dǎo)入基因組靶 位點(diǎn) 通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá) SecI SecI 在 18 個(gè)堿基的位點(diǎn) sceS 切斷基因組 DNA 菌體不能夠存活 如果發(fā)生同源雙交換 sceS 被刪除 即使誘導(dǎo)表達(dá) SecI 也 不會(huì)造成基因組 DNA 的斷裂 菌體仍然存活 并表現(xiàn)出抗性敏感 CRISPR Cas9 介導(dǎo)的同源重組系統(tǒng) 首先優(yōu)化 cas9 的密碼子 將其放置在強(qiáng)啟動(dòng)子之后并克隆到敲除質(zhì)粒上 敲除 質(zhì)粒上含有 sgRNA 并置于組成型啟動(dòng)子之后 sgRNA 中的引導(dǎo)序列為靶位點(diǎn)的 同源序列 敲除質(zhì)粒必須包括靶基因兩側(cè)的同源臂 將該質(zhì)粒導(dǎo)入鏈霉菌 CRISPR Cas9 系統(tǒng)將靶位點(diǎn)切斷 同時(shí)質(zhì)粒上的同源臂與基因組上的同源臂發(fā)生 雙交換 將斷裂的靶基因區(qū)刪除 基因組重新連接 CRISPR Cas9 系統(tǒng)先切斷靶序列后直接發(fā)生雙交換 最后斷裂的靶基因直接被 敲除 位點(diǎn)特異性整合酶介導(dǎo)的基因組編輯 cre lox 系統(tǒng) 利用兩次同源單交換分別將兩個(gè) loxP 位點(diǎn)整合到目的基因片段的上下游 再將 Cre 蛋白表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入鏈霉菌 在 Cre 蛋白的作用下 兩個(gè) loxP 位點(diǎn)發(fā)生位點(diǎn) 特異性重組 完成目的基因片段的敲除 而環(huán)化的 DNA 由于不能在鏈霉菌中復(fù) 制 隨著傳代而丟失 大片段 DNA 克隆的技術(shù) 依賴于酵母菌的轉(zhuǎn)化介導(dǎo)的大片段 DNA 重組克隆 TAR 基于 FBT1 attp attB int 整合系統(tǒng)的鏈霉菌基因組 DNA 大片段克隆技術(shù) 通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)移將質(zhì)粒 pSV attB6Up 導(dǎo)入鏈霉菌 卡那霉素篩選獲得 pSV attB6Up 同源整合到目的位置的菌株 S attB6 再將 pKC1139 attP6Dn 導(dǎo)入 S attB6 在 40 度培養(yǎng) pKC1139 attP6Dn 通過(guò)同源單交換整合到目的位置獲 得 S attB6P6 通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)移將含有 FBT1 整合酶的 pIJ10500 導(dǎo)入 S attB6P6 中 利用整合酶將目的基因簇環(huán)出 并克隆到載體 pKC1139 上 在今后的實(shí)驗(yàn)中可能會(huì)用到 我們實(shí)驗(yàn)室是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室 這些技術(shù)方法對(duì)于我今后的研究室有助 益的 我們平時(shí)多采用基本的遺傳操作 構(gòu)建敲除質(zhì)粒載體 然后導(dǎo)入受體菌 株進(jìn)行同源重組進(jìn)行單交換 利用抗生素進(jìn)行篩選 隨后還需要進(jìn)行雙交換 我們可以考慮使用基因編輯技術(shù)來(lái)進(jìn)行遺傳操做 比如應(yīng)用 CRISPR Cas9 介導(dǎo)的 同源重組基因編輯技術(shù)來(lái)使之直接發(fā)生雙交換而直接敲除靶標(biāo)基因 這樣操作 起來(lái)并不繁瑣 也省去了些過(guò)程 并且對(duì)是否發(fā)生雙交換也比較好判斷 3 作為絲狀細(xì)菌的鏈霉菌經(jīng)歷一個(gè)怎樣的分化過(guò)程 對(duì)其自身有何意義 劉 鋼老師 作為絲狀細(xì)菌鏈霉菌的分化過(guò)程為 1 孢子萌發(fā)形成基質(zhì)菌絲 2 基質(zhì)菌絲延伸 分枝 光禿表型 3 向空氣中生長(zhǎng)形成氣生菌絲 4 氣生菌絲產(chǎn)生螺旋和分隔 白表型 5 分隔加深形成孢子鏈 6 孢子鏈變灰 成熟 灰表型 7 釋放游離孢子 鏈霉菌的發(fā)育分化過(guò)程中有部分的基質(zhì)菌絲和未分化成為孢子的氣生菌絲存 在有死亡現(xiàn)象 這些菌絲的死亡發(fā)生在鏈霉菌分化過(guò)程中的特定時(shí)間和區(qū)域 首先是死亡的菌絲體并未顯示出 PCD 所特有的表觀特征 其次是死亡的菌絲 體并未完全消失 保留的殘?bào)w既可以作為機(jī)械支撐用于氣生菌絲分化從而脫離 培養(yǎng)基表面 同時(shí)也可作為水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸通道 對(duì)其自身的意義 營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段 基質(zhì)菌絲經(jīng)過(guò)頂端生長(zhǎng)和分支 在感受到環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)限制或 者其他壓力后 以應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫 鏈霉菌通過(guò) bld 基因級(jí)聯(lián)信號(hào)通路產(chǎn)生疏水 分子 SapB 從而賦予菌絲表面疏水特性而使其突破培養(yǎng)基表面的氣 水張力進(jìn)入 繁殖性的氣生菌絲階段 然后又通過(guò) whi 基因等的級(jí)聯(lián)信號(hào)通路控制下產(chǎn)生孢 子 孢子成熟后飄落到適宜的環(huán)境中在進(jìn)行上述過(guò)程生活 這種分化過(guò)程可以 賦予鏈霉菌抵御環(huán)境脅迫的能力 進(jìn)行生殖生長(zhǎng)產(chǎn)生氣生菌絲和孢子 成熟孢 子隨風(fēng)或其他生物帶到更加適宜其生活的環(huán)境中 對(duì)于鏈霉菌自身是十分重要 的生活方式 使之區(qū)別物其他的原核生物 所以這種發(fā)育分化過(guò)程對(duì)于鏈霉菌 自身意義重大 鏈霉菌發(fā)育分化中的細(xì)胞死亡過(guò)程其生理學(xué)意義可能在于 當(dāng)鏈霉菌在生長(zhǎng)過(guò)程中感受到環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)限制或者其它壓力時(shí) 通過(guò)細(xì)胞死 亡可為其孢子形成提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 伴隨著基質(zhì)菌絲向氣生菌絲的轉(zhuǎn)變 鏈霉菌 通常會(huì)在這一時(shí)期產(chǎn)生抗生素 這對(duì)于鏈霉菌專一性的重新利用自身裂解產(chǎn)物 可能具有重要的意義 鏈霉菌發(fā)育分化和次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成一般都是起始于 對(duì)環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)匱乏的感應(yīng) 4 鏈霉菌為什么會(huì)產(chǎn)生如此多樣性的次級(jí)代謝產(chǎn)物 他們對(duì)鏈霉菌本身有何意 義 劉鋼老師 次級(jí)代謝產(chǎn)物通常是指不是生物體生長(zhǎng)發(fā)育所必需的分子量小于 3KDa 的 小分子物質(zhì) 越來(lái)越多的證據(jù)表明 次級(jí)代謝實(shí)際上參與了生物體對(duì)環(huán)境因子 應(yīng)答等多種生理作用 廣泛意義上的抗生素囊括了幾乎所有的微生物次級(jí)代謝 產(chǎn)物 這些次級(jí)代謝產(chǎn)物在極低的濃度在生化水平調(diào)控微生物的生長(zhǎng)過(guò)程 抗生素是逐步合成的代謝產(chǎn)物 每一步都需要約 10 一 30 個(gè)基因來(lái)決定其 結(jié)構(gòu)和起自我保護(hù)作用抗性基因 以及控制結(jié)構(gòu)基因活性的調(diào)控基因 并使它們 隨特性生存需要給予表達(dá) 這常常與活性營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和抱子形成之間的轉(zhuǎn)變相一 致 鏈霉菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)其本身的意義 當(dāng)鏈霉菌在生長(zhǎng)過(guò)程中感受到環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)限制或者其它壓力時(shí) 伴隨著 由基質(zhì)菌絲形成氣生菌絲 菌體周圍的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸被消耗 鏈霉菌開(kāi)始降解 自身的基質(zhì)菌絲為形成繁殖型的氣生菌絲提供營(yíng)養(yǎng) 同時(shí)各種次級(jí)代謝產(chǎn)物 抗生素 開(kāi)始產(chǎn)生 而次級(jí)代謝產(chǎn)物可以幫助鏈霉菌抵御環(huán)境脅迫 從而創(chuàng) 造利于自身生活的環(huán)境 這對(duì)于鏈霉菌專一性的重新利用自身裂解產(chǎn)物可能具 有重要的意義 這些次級(jí)代謝產(chǎn)物在極低的濃度下 可以在生化水平調(diào)控微生 物的生長(zhǎng)過(guò)程對(duì)菌體的生長(zhǎng)也具有重要的生物學(xué)意義 抗生素還具有抑制它種 微生物生長(zhǎng)活動(dòng) 甚至殺滅它種微生物的能力 這就為鏈霉菌的生活創(chuàng)造了相 對(duì)較好的條件 5 調(diào)控基因在抗生素生物合成中有何主要功能 抗生素生物合成基因簇一般由調(diào)控基因 結(jié)構(gòu)基因和相關(guān)抗性基因組成 而 且這些基因總是成簇排列 在抗生素生物合成中調(diào)控基因起到了一個(gè)開(kāi)關(guān)的作 用 它可決定一種抗生素能否被合成 什么時(shí)候合成和什么時(shí)候被終止的精細(xì) 調(diào)控作用 1 抗生素生物合成的途徑特異性調(diào)控 鏈霉菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇 通常成簇排列 包括一個(gè)或多個(gè)調(diào)控基因 一般只負(fù)責(zé)調(diào)控所在基因簇基因表 達(dá)的調(diào)控稱之為途徑特異性調(diào)控 途徑特異性調(diào)控蛋白如 SARP 蛋白 SARP 蛋 白都含有 OmpR 類的 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域 通過(guò)招募 RNA 聚合 酶到靶基因的啟動(dòng)子上游激活基因的轉(zhuǎn)錄 大多數(shù) SARP 蛋白都是途徑特異性調(diào) 控子 一般只調(diào)控與其相鄰的基因 2 全局性調(diào)控 相對(duì)于鏈霉菌次級(jí)代謝中的其他調(diào)控模式而言 全局調(diào)控是一 種更為多樣 普遍 復(fù)雜的調(diào)控模式 全局調(diào)控基因可以調(diào)控多條次級(jí)代謝途 徑 全局性調(diào)控蛋白對(duì)抗生素生物合成的調(diào)控通常是通過(guò)直接或間接地調(diào)控途徑特 異性調(diào)控蛋白實(shí)施的 而除了調(diào)控次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成外 很多全局調(diào)控 蛋白還控制著鏈霉菌的形態(tài)分化 還有一些能夠調(diào)控初級(jí)代謝 并成為初級(jí)代 謝向次級(jí)代謝轉(zhuǎn)換的媒介 Eg 雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng) AdpA 3 抗生素生物合成的自調(diào)控 反饋調(diào)控和前饋調(diào)饋 抗生素介導(dǎo)的自調(diào)控 反饋調(diào)控 指一種微生物代謝反應(yīng)的終產(chǎn)物在代謝合成過(guò)程中對(duì)合成基因簇中 調(diào)控基因或生化反應(yīng)關(guān)鍵酶基因的調(diào)控 如抗生素 前饋調(diào)控 指一種微生物代謝反應(yīng)的底物或中間物在代謝合成過(guò)程中對(duì)合成基 因簇中調(diào)控基因或生化反應(yīng)關(guān)鍵酶基因的調(diào)控 抗生素作為終產(chǎn)物介導(dǎo)的自調(diào)控系統(tǒng)可取代雙組分系統(tǒng)中通過(guò)磷酸化作用 的應(yīng)答調(diào)控機(jī)制 并證明這種新調(diào)控機(jī)制在微生物次級(jí)代謝生物合成中是 廣泛存在的 6 鏈霉菌信號(hào)分子有哪幾種類型 GBL 類型的信號(hào)分子在抗生素生物合成中如 何發(fā)揮其功能 菌群群體反應(yīng)感應(yīng)信號(hào)分子 當(dāng)信號(hào)分子達(dá)到閾值 啟動(dòng)特定基因表達(dá) 改變和協(xié)調(diào)細(xì)胞間行為使群體呈現(xiàn)某種生理特征 鏈霉菌信號(hào)分子的類型 高絲氨酸內(nèi)酯 HSL 自誘導(dǎo)肽 AIP AI 2 丁酸內(nèi)酯 GBL DSF PQS 法尼 醇等 目前研究得最多的群體感應(yīng)系統(tǒng)有以下四種 革蘭氏陰性菌中的?；?絲氨酸內(nèi)酯 AHL 介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng) 革蘭氏陽(yáng)性菌中的自誘導(dǎo)肽 AIP 介導(dǎo)的 群體感應(yīng)系統(tǒng) 呋喃硼酸二酯結(jié)構(gòu)的 AI 2 介導(dǎo)的種間群體感應(yīng)系統(tǒng)和 丁酸 內(nèi)酯 GBL 介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng) GBL 類型的信號(hào)分子在抗生素生物合成中發(fā)揮功能 鏈霉菌廣泛使用 丁酸內(nèi)酯 GBL 類化合物作為自調(diào)控因子 GBL 在胞內(nèi)合 成并分泌到胞外 當(dāng)達(dá)到一定閾值濃度時(shí) 能夠被胞內(nèi)的受體蛋白所感知 從 而引起群體反應(yīng) 抗生素合成或產(chǎn)孢 信號(hào)分子 A 因子 GBL 的受體蛋白 ArpA 與多效調(diào)空基因 adpA 的啟動(dòng)子區(qū)結(jié) 合 阻遏了 adpA 的轉(zhuǎn)錄 當(dāng) A 因子 GBL 積累到閾值時(shí) 它與 ArpA 結(jié)合 使 ArpA 從 adpA 上解離 導(dǎo)致 adpA 有效地進(jìn)行轉(zhuǎn)錄 翻譯后的 AdpA 控制鏈霉素 生物合成基因簇中調(diào)控基因 strR 的轉(zhuǎn)錄 StrR 激活 strB1 開(kāi)始的這個(gè)轉(zhuǎn)錄單元的 基因轉(zhuǎn)錄 從而調(diào)控鏈霉素的生物合成 7 有哪些方法或策略可以得到新型抗生素 1 更多鏈霉菌基因組的測(cè)序及挖掘 隨著更多鏈霉菌基因組的不斷完成和信息 積累 為抗生素生物合成基因簇的研究 發(fā)現(xiàn)新型抗生素提供了重要的條件 大量的鏈霉菌尚未測(cè)序 這極大地影響了新型抗生素的發(fā)現(xiàn) 每個(gè)基因組平均 含有 20 30 個(gè)左右次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇 大多數(shù)是未知的 這將是發(fā) 現(xiàn)新型抗生素的龐大資源 2 培養(yǎng)條件的優(yōu)化 微生物只能在適合的條件下生長(zhǎng)和繁殖 不同的營(yíng)養(yǎng) 如 不同的碳源和氮源等 條件導(dǎo)致不同的生理代謝 次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成是 與前體的提供和相關(guān)因子的誘導(dǎo)密切相關(guān)的 同時(shí) 相關(guān)菌株的共同培養(yǎng)可以 提供互補(bǔ)的重要物質(zhì)和信息交流 這為隱性次級(jí)代謝基因簇的激活提供了可能 的條件 3 調(diào)控子的遺傳操作 隱性次級(jí)代謝基因簇在受阻遏和缺乏激活因子的情況下 不能得到表達(dá) 去除負(fù)調(diào)控基因的阻遏和構(gòu)建正調(diào)控基因的有效表達(dá)是激活隱 性次級(jí)代謝基因簇表達(dá)的策略之一 此外 對(duì)轉(zhuǎn)錄單元中啟動(dòng)子的替換和定向 改造也是隱性次級(jí)代謝基因簇激活的有效方法 4 基因簇的異源表達(dá) 為了消除菌株本身的一些限制因素 進(jìn)行隱性次級(jí)代謝 基因簇的異源表達(dá)也是值得嘗試的方法 5 信號(hào)分子介導(dǎo)的激活 丁酸內(nèi)酯 GBL 作為放線菌的信號(hào)分子 通過(guò)與 相應(yīng)的受體蛋白相互作用 進(jìn)而激活多種次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成 除 GBL 外 在抗生素生物合成中信號(hào)分子具有多樣性和多效性 如抗生素本身可作為信號(hào) 分子 ATP 和肌醇等可作為信號(hào)分子參與抗生素的生物合成和形態(tài)分化的分子調(diào) 控 發(fā)現(xiàn)新信號(hào)分子 研究其在抗生素產(chǎn)生和種間交流中的作用機(jī)制 同時(shí)可用于 激活隱性基因簇 探索抗生素作為信號(hào)分子在自然生境中的生物學(xué)功能 6 核糖體工程 在鏈霉菌中 核糖體蛋白 S12 的突變同樣可以影響抗生素的產(chǎn) 量 7 其他新方法和策略 未來(lái)可能的突破 以鏈霉菌為模式 進(jìn)一步闡明抗生素生物合成與調(diào)控機(jī)制 為提高重要抗生素的產(chǎn)量乃至激活隱基因簇 挖掘新型活性次級(jí)代謝產(chǎn)物方面 做出創(chuàng)新性的研究成果 深入開(kāi)展抗生素的組合生物合成和合成生物學(xué)的研究 突破天然產(chǎn)物合成過(guò)程中的瓶頸 獲得在結(jié)構(gòu)和功能上具有突出特點(diǎn)的新型活 性化合物 第四章 大腸桿菌 芽孢桿菌 棒桿菌 乳酸菌 8 結(jié)合大腸桿菌 致病和非致病 的細(xì)胞結(jié)構(gòu)特征及其生物大分子的生物合成 規(guī)律 簡(jiǎn)述若干種藥物研發(fā)的策略 1 藥物研發(fā)策略 生產(chǎn)某種物質(zhì) 綜合策略 拓展底物利用能力和范圍 進(jìn) 加快產(chǎn)物轉(zhuǎn)到胞外 出 加強(qiáng)目標(biāo)合成酶活性 加 減少分支合成途徑 減 引入新的合成途徑 或延伸已有途徑 增 改善細(xì)胞的耐受性 定向遺傳修飾 利用大腸桿菌合成相關(guān)藥物 A 大腸桿菌產(chǎn)生蛋白類藥物 優(yōu)先選用的蛋白藥物表達(dá)宿主 即利用上述的 策略來(lái)進(jìn)行定向遺傳改造而合成蛋白類藥物 首先 利用大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源質(zhì)粒 構(gòu)建包含有目標(biāo)蛋白質(zhì)的基因的質(zhì)粒 載體 也可以將其導(dǎo)入到大腸桿菌中通過(guò)同源重組過(guò)程整合到其染色體上進(jìn)行 穩(wěn)定表達(dá) 我們可以改進(jìn)大腸桿菌的分泌系統(tǒng) 從而加速其產(chǎn)生的生物大分子 蛋白質(zhì)排除體外的效率 從而合成生物大分子蛋白質(zhì)類藥物 B 大腸桿菌細(xì)胞高產(chǎn)抗癌藥物前體 紫杉醇 taxol 前體 taxadiene Taxol 是 萜類化合物 三環(huán)二萜 含異戊二烯類單元 天然的大腸桿菌的 MEP 途徑可 合成其中 2 個(gè)前體異戊烯焦磷酸 IPP 和二甲基烯丙基焦磷酸 DMAPP 因此 上游模塊 增加整個(gè) MEP 途徑的拷貝數(shù) 在染色體中引入 T7 RNA 聚合 酶 并在限速酶前引入 T7 啟動(dòng)子 通過(guò)不同質(zhì)粒的引入和改變啟動(dòng)子強(qiáng)度來(lái)協(xié) 調(diào)不同基因的拷貝數(shù)以及表達(dá)量 將合成酶基因整合到染色體上 減小代謝負(fù) 擔(dān) 下游模塊 改變 GGPS 和 TS 兩個(gè)合成基因的順序 通過(guò)啟動(dòng)子更換以及改造 協(xié)調(diào)基因的表達(dá)量 去除代謝抑制子 indole 多位點(diǎn)協(xié)調(diào)上下游兩個(gè)模塊 使 前體生物大分子 taxadiene 的產(chǎn)量提高了約 15000 倍 達(dá)到 1 0 g L C 輔因子工程 降低細(xì)胞內(nèi)的能量水平能顯著提高酵解速度 ATP NADH NAD NADPH NADP 等輔因子參與很多重要胞內(nèi)代謝過(guò)程 其水平及 比例可導(dǎo)致微生物代謝及生理發(fā)生全局變化 與生物大分子的合成相關(guān) NADPH NADP 增加有利于生物大分子的合成 厭氧高產(chǎn)正丁醇 還原力驅(qū)動(dòng) 產(chǎn)生 1 丁醇需要 4 還原力改造方法 敲除 3 個(gè)消耗 NADH 的途徑 使 NADH 的含 量為 4 敲除產(chǎn)生乙酸的途徑 節(jié)約了 1 分子前體乙酰輔酶 A 綜合改造后生 物大分子的產(chǎn)量提高了 100 多倍 作用于致病大腸桿菌的藥物的研發(fā) D 外排泵的抑制子作為潛在的藥物靶標(biāo) TetR 類抑制子控制本底水平的外排泵 AcrA 和 AcrB 的表達(dá) AraC 類的激活子能解除 TetR 的抑制 使外排泵大量表達(dá) MarR 類的抑制子能夠抑制 AraC 的轉(zhuǎn)錄 間接影響外排泵表達(dá) 抗生素或小分子與抑制子結(jié)合 減弱其與靶標(biāo) DNA 的結(jié)合 從而解除其對(duì)激活 子抑制作用 進(jìn)而促進(jìn)下游外排泵的高表達(dá) 從以上的外排泵的調(diào)控方式可以知道 抑制子能夠減弱外排泵的表達(dá) 從而降 低菌株對(duì)藥物的耐受性 使其容易被殺死 例如 篩選能夠結(jié)合抑制子 RamR 的 小分子 藥物 使其對(duì)激活子 RamA 的抑制作用加強(qiáng) 從而降低外排泵的表達(dá) 而降低細(xì)菌的抗性 由 RamR 和小分子復(fù)合物結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵殘基 Phe155 從而 有助于篩選與其結(jié)合的潛在藥物 D 轉(zhuǎn)肽酶 這些酶大多是藥物的潛在作用靶點(diǎn) 對(duì)其結(jié)構(gòu) 功能的研究是熱點(diǎn) 例如 青霉素可以競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合轉(zhuǎn)肽酶 導(dǎo)致肽橋不能形成而抑制 細(xì)胞生長(zhǎng) 從而可以篩選其他可以與轉(zhuǎn)肽酶結(jié)合的藥物來(lái)開(kāi)發(fā)新藥物 E 抗生素作用的靶標(biāo)或抗性菌株突變的位點(diǎn) 例如 萬(wàn)古霉素作用位點(diǎn)為雙丙氨酰 抑制細(xì)胞壁的合成 而其對(duì)應(yīng)的耐藥菌株 末尾的丙氨酸突變?yōu)槿樗?2 細(xì)胞結(jié)構(gòu)特征 細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有成形的細(xì)胞核 含有質(zhì)粒 基因組或質(zhì)粒上含有 致病島 它是一段特殊的 DNA 片段 包含毒素分泌系 統(tǒng) 粘附素等 能夠在菌株和相近種之間轉(zhuǎn)移 大腸桿菌大部分是無(wú)害的 與 宿主互利共生 部分通過(guò)獲得毒素因子適應(yīng)新環(huán)境或?qū)е录膊?含有由肽聚糖組成的細(xì)胞壁 只含有核糖體簡(jiǎn)單的細(xì)胞器 革蘭氏陰性 G 短桿菌 兩端鈍圓 大小 1 0 1 5 m 2 0 6 0 m 周身鞭毛 能運(yùn)動(dòng) 有菌毛 毒性因子 菌毛 大多由質(zhì)粒編碼 成束狀 起粘附宿主作用 腸毒素 外毒素 分為耐熱和不耐熱 耐熱型 免疫原性弱 100 20 min 不破壞 不耐熱型 免疫原性強(qiáng) 65 30 min 破壞 類脂 A 內(nèi)毒素 熱穩(wěn)定 100 1 h 不破壞 莢膜多糖 抗吞噬作用 3 大腸桿菌生物大分子的生物合成規(guī)律 生物大分子主要是指蛋白質(zhì) 核酸以及高相對(duì)分子量的碳?xì)浠衔?與低 相對(duì)分子量的生物有機(jī)化合物相比 生物大分子具有更高級(jí)的物質(zhì)群 它 們是由低相對(duì)分子量的有機(jī)化合物經(jīng)過(guò)聚合而成的多分子體系 從化學(xué)結(jié) 構(gòu)而言 蛋白質(zhì)是由 L 氨基酸脫水縮合而成的 核酸是由嘌呤和嘧啶堿 基與糖 D 核糖或 2 脫氧 D 核糖 磷酸脫水縮合而成 多糖是由單糖脫水縮 合而成 由此可知 由低相對(duì)分子量的生物有機(jī)化合物變?yōu)樯锎蠓肿拥幕?學(xué)反應(yīng)都是脫水縮合反應(yīng) 生物大分子合成前相應(yīng)基本結(jié)構(gòu)單元需要活化 活化后的分子具有高能量 便于后續(xù)合成反應(yīng) Eg 以葡萄糖為原料合成糖原時(shí)需要經(jīng) UTP 活化為 UDPG 以乙酰 CoA 為原料合成脂肪酸需要 ACP 活化為丙二酰 CoA 以氨基 酸為原料合成蛋白質(zhì)時(shí)需 tRNA 活化為氨酰 tRNA 以核苷酸或脫氧核糖核 氨酸 NMP dNMP 為原料合成核酸時(shí)活化為核苷三磷酸 NTP dNTP 生物大分子的合成都需要酶 都需要溫和的反應(yīng)條件 9 Bacillus cereus group 的概念 包括哪些種 簡(jiǎn)述種內(nèi)間的聯(lián)系與區(qū)別 Bacillus cereus group 均為能夠形成孢子的菌株 基因及基因組序列數(shù)據(jù)顯示其 種間密切相關(guān) 即染色體具有很高的的相似性和共線性 甚至被認(rèn)為屬于相同 的種 其包含 6 個(gè)不同的種 1 B B cereuscereus sensusensu stricto stricto 狹義的蠟狀芽孢桿菌 廣泛存在于土壤中 能 引起食品污染 導(dǎo)致人類嘔吐和腹瀉 并且有些菌株能引起軟組織感染的 機(jī)會(huì)致病菌 2 B B anthracisanthracis 可引起炭疽熱 被用于生物武器 3 B B thuringiensisthuringiensis 能產(chǎn)生殺蟲晶體蛋白 被用作重要的微生物殺蟲劑 4 B B mycoidesmycoides 腐生細(xì)菌 能夠形成根狀菌落 5 B B pseudomycoidespseudomycoides與B B weihenstephanensisweihenstephanensis 放射狀的菌落形態(tài) 脂肪 酸的組成與群中其他菌不同 6 B B cytotoxicuscytotoxicus 最新從蠟狀芽孢桿菌中分離出來(lái) 主要與食物中毒有關(guān) 在系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系上與蠟狀芽孢桿菌群里其他成員較遠(yuǎn) BacillusBacillus cereuscereus groupgroup 種間聯(lián)系與區(qū)分 雖然BacillusBacillus cereuscereus groupgroup 種間染色體具有很高的相似性和共線性 但是其 包含幾百個(gè)菌株 也顯示了很高的基因異質(zhì)性及菌株特異的基因組適應(yīng)性 比 如有些蠟狀芽胞桿菌具有跟炭疽芽胞桿菌類似的特征 包括其致病性 但是并 不含有與后者完全一樣的質(zhì)粒 蠟狀芽孢桿菌群種間的區(qū)分依據(jù) 一般蠟狀芽胞桿菌群不同種之間的主要區(qū)分標(biāo)志是其表型 特別是對(duì)于 B cereus sensu stricto B anthracis B thuringiensis 這些表型的差異 往往由位于質(zhì)粒上的遺傳物質(zhì)所決定 a 炭疽芽孢桿菌引起炭疽熱的毒力因子基因主要位于兩個(gè)大質(zhì)粒上 pXO1pXO1 和 pXO2pXO2 這兩個(gè)質(zhì)粒對(duì)于炭疽芽胞桿菌的致病至關(guān)重要 也是其區(qū)別于其他成 員的主要特征 a 蘇云金芽胞桿菌主要特征是在芽胞形成的同時(shí)產(chǎn)生伴胞晶體即 內(nèi)毒素 而編碼這些晶體蛋白的基因主要位于質(zhì)粒上 b 蠟狀芽胞桿菌合成嘔吐毒素的基因位于一個(gè)大質(zhì)粒上 c B cereus group 中的質(zhì)粒 1 是非常重要的形態(tài)因子 如 B thuringiensis 的晶體毒蛋白基因與 B anthracis 的炭疽毒素基因均位于質(zhì)粒元件上 2 B cereus group 中 質(zhì)粒普遍存在 單個(gè)菌種可能含有 6 個(gè)不同的質(zhì)粒 3 質(zhì)粒大小變化也很大 從 2kb 到大于 600kb 且不同菌株的質(zhì)粒譜型并不總 與其系統(tǒng)發(fā)育相匹配 4 在 B cereus 群的進(jìn)化過(guò)程中 質(zhì)粒是染色體的延伸 質(zhì)粒和染色體之間 基因交換頻繁 有利于菌株得以生存于不同的多變的環(huán)境之中 10 在芽孢桿菌生物膜形成過(guò)程中 最主要的抑制子是什么 簡(jiǎn)述其是如何被 解除并促進(jìn)生物膜的形成的 形成生物膜是芽孢桿菌在自然環(huán)境中形成有利條件維持生存的一種群體性行 生物膜形成過(guò)程中的最主要抑制子 SinR 它是一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控子 可以抑制基質(zhì)形成基因的表達(dá) 也可以促進(jìn)細(xì)胞 運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因的表達(dá) 因此形成生物膜需抑制 SinR 蛋白的表達(dá) 破解并促進(jìn)生物膜形成的過(guò)程 抗阻遏蛋白 SinI 可拮抗 SinR 活性 通過(guò)對(duì)環(huán)境的感知 芽孢桿菌種控制孢子 形成的雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中磷酸化的應(yīng)答調(diào)控蛋白 RR 轉(zhuǎn)錄調(diào)控子 Spo0A 可以激活 SinI 基因表達(dá) 從而產(chǎn)生抗阻遏蛋白 SinI 通過(guò)與 SinR 的結(jié)合來(lái)降 低 SinR 濃度 從而使細(xì)胞喪失運(yùn)動(dòng)性而形成細(xì)胞鏈并產(chǎn)生基質(zhì) 刺激感受態(tài)形 成 最終促進(jìn)生物膜的形成 11 簡(jiǎn)述芽孢桿菌感受態(tài)形成過(guò)程中關(guān)鍵調(diào)控子 ComK 的作用 降解及釋放的 過(guò)程 感受態(tài)的形成主要包括三個(gè)過(guò)程 群感效應(yīng)系統(tǒng) 主要調(diào)控子 ComK 的激活 ComK 激活下游感受態(tài)相關(guān)基因 在 B subtilis 感受態(tài)形成過(guò)程中 DNA 結(jié)合 攝取及重組相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄都是 受到感受態(tài)調(diào)控子 ComK 的調(diào)控 ComK 直接或間接調(diào)控的基因多達(dá) 100 個(gè) 1 ComK 的自激活循環(huán) ComK 的自激活循環(huán)是形成感受態(tài)的關(guān)鍵步驟 ComK 以二聚體組成的四聚物形式結(jié)合于各啟動(dòng)子上 激活下游基因轉(zhuǎn)錄 包括自身 基因 2 ComK 的抑制 ComK 在自激活循環(huán)后 轉(zhuǎn)錄被激活并翻譯 ComK 但是合成的 ComK 與 MecA 結(jié)合 MecA 募集 ComK 結(jié)合到蛋白酶 ClpCP 使 ComK 被降解 從而無(wú)法調(diào)控感受態(tài)的 形成 3 ComK 的釋放 群感效應(yīng)信號(hào)分子 ComX 及 CSF 可以促使 ComA P 的水平升高 ComA P 能 夠促進(jìn)表面活性素 surfactin 基因簇的轉(zhuǎn)錄 而位于此基因簇上的 comS 同時(shí)被 轉(zhuǎn)錄 ComS 是 46 個(gè)氨基酸的小肽 可以與 MecA 結(jié)合使 ComK 從 ComK MecA ClpC 復(fù)合物上釋放 而 ComS 及 MecA 被 ClpCP 降解 4 ComK 激活下游基因 當(dāng) ComK 濃度足夠高 ComK 可激活 DNA 攝取基因 comC E G F DNA 整合基因 recA addAB 及自身基因 comk 的表達(dá) 綜上所述 ComK 在感受態(tài)的形成過(guò)程中起到了承上啟下的作用 12 簡(jiǎn)述納豆激酶產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路 納豆激酶 NK 是芽孢桿菌分泌酶 可溶解血纖維蛋白 有顯著的溶栓的作用 具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景 通過(guò)枯草芽孢桿菌培養(yǎng) 利用 NH4 2SO4 沉淀 Sephadex G100 柱層析對(duì)該酶 發(fā)酵液進(jìn)行分離純化 已經(jīng)分離純化出了枯草芽孢桿菌溶栓酶 納豆激酶產(chǎn)品開(kāi)發(fā)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路 納豆激酶的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)是以納豆為原料 接種納豆芽孢桿菌 對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵 分 離純化而得到的 納豆激酶的分離純化粗提方法即是將發(fā)酵液或納豆浸提液離 心取上清 用硫酸銨或乙醇沉淀 再經(jīng)離心除去上清液中的粘性物質(zhì) 離心后 取沉淀 溶于緩沖液中即為粗酶液 隨后將粗酶液進(jìn)行精提 將粗酶液進(jìn)行脫 鹽 離子交換 柱層析 透析 最后冷凍干燥制得酶干粉 可以利用分子生物學(xué)技術(shù)在 L lactis 中表達(dá)納豆激酶 這種方式大大加快了納 豆激酶的生產(chǎn)效率 在乳酸菌中表達(dá) nisK R 納豆激酶基因 目的基因用 nisA 啟動(dòng)子控制 在 nisin 作為誘導(dǎo)物誘導(dǎo)時(shí)目的基因表達(dá) 這個(gè)誘導(dǎo)表達(dá)系 統(tǒng)稱為 NICE 系統(tǒng) 此系統(tǒng)可嚴(yán)謹(jǐn)控制 高效表達(dá) 是很成熟的乳酸菌外源基因 表達(dá)系統(tǒng) Nisin 是食品級(jí)的安全誘導(dǎo)物 可直接應(yīng)用的食品中 少量 nisin 即可誘導(dǎo)外源基因的表達(dá) 首先 構(gòu)建含有納豆激酶基因的質(zhì)粒載體 將質(zhì)粒載體導(dǎo)入到 L lactis 中 在 培養(yǎng)液中加入淡豆豉 誘導(dǎo)納豆激酶的表達(dá) 最后優(yōu)化培養(yǎng)條件 最終得到商 品化的納豆激酶產(chǎn)品 最終 納豆激酶的分離純化過(guò)程比較繁瑣 但目前并沒(méi) 有特別簡(jiǎn)易的方法 有研究者研究過(guò)以下方法 鹽析法分離提純納豆激酶 超 濾法分離提純納豆激酶等 但我覺(jué)得這些方法就目前的研究水平還不適合大規(guī) 模生產(chǎn)的應(yīng)用 13 B subtilis 分泌蛋白有哪 4 種不同途徑 簡(jiǎn)述每種途徑分泌蛋白過(guò)程及所分 泌蛋白特點(diǎn) B subtilis 分泌蛋白有四種不同途徑蛋白特點(diǎn)及分泌過(guò)程 Sec SRPSec SRP cooperationcooperation pathway pathway 絕大多數(shù)蛋白通過(guò) Sec SRPSec SRP 途徑運(yùn)輸 轉(zhuǎn) 運(yùn)未折疊的蛋白質(zhì) B subtilis 中最主要的蛋白質(zhì)分泌途徑 可以分為 3 個(gè)功能階段 蛋白定位 分泌蛋白首先由核糖體合成前體 前體蛋白在 N 端含有信號(hào)肽 細(xì)胞質(zhì)分子伴侶可以幫助前體蛋白保持能夠被遷移的狀態(tài) SRP 與信號(hào)肽相 互識(shí)別 將前體定位于膜上的 Sec 易位酶復(fù)合物 蛋白易位 信號(hào)肽帶正電荷的 N domain 與膜上負(fù)電荷的磷脂相互作用 導(dǎo) 致 H domain 彎曲地插入膜上 當(dāng) H domain 變直之后 前體蛋白的第一部分 被拉至胞外 蛋白的折疊及釋放 在易位過(guò)程中或易位之后的瞬間 信號(hào)肽被 type I Spases 切除 使成熟肽從 Sec 易位酶復(fù)合物上釋放 最后 胞外分子伴侶參與 分泌蛋白的折疊及質(zhì)量控制 twin argininetwin arginine translocationtranslocation Tat pathway Tat pathway 相較于 Sec SRP 途徑 Tat 途徑可以從 B subtilis 的細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)緊密折疊的蛋白甚至多聚酶復(fù)合物 到培養(yǎng)基中 分泌蛋白至培養(yǎng)基 細(xì)胞壁及插入蛋白至細(xì)胞質(zhì)膜 Tat 途徑的信號(hào)肽 轉(zhuǎn)運(yùn)已折疊好的蛋白 Tat 途徑的蛋白分泌過(guò)程 具有 RR KR 類型信號(hào)肽的前體蛋白在易位之前可以在輔因子的幫助下在細(xì)胞 質(zhì)中折疊 前體蛋白可以通過(guò) Tat 蛋白復(fù)合物 Tat 易位酶 組成的通道而穿過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜 在轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)程中 經(jīng)過(guò)信號(hào)肽酶和細(xì)胞壁通道的加工 折疊的成熟蛋白分泌 至培養(yǎng)基中 ATP bindingATP binding cassettecassette ABC ABC transporters transporters 在真核 原核生物中發(fā)現(xiàn) 既可輸出也可輸入各種分子 如離子 氨基酸 肽 抗生素 多糖及蛋白 質(zhì)等 1 與核糖體合成的羊毛硫細(xì)菌素 lantibiotics 和信息素 pheromone 合成有關(guān) 2 lantibiotics or pheromones 的信號(hào)肽叫做前導(dǎo)肽 lantibiotics 的前導(dǎo)肽大概 有 23 30 個(gè)氨基酸殘基 與 lantibiotics 的翻譯后修飾有關(guān) pseudopilinpseudopilin exportexport pathway pathway 感受態(tài)形成相關(guān) 假菌毛蛋白通過(guò) Com 系 統(tǒng)運(yùn)輸 14 Bt 菌株在孢子形成期及營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期分別形成哪些不同的殺蟲毒素 簡(jiǎn)述 Cry 蛋白殺蟲機(jī)制 Bt 在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中可產(chǎn)生多種對(duì)昆蟲有致病性的殺蟲毒素 在孢子形成開(kāi)始和穩(wěn)定生長(zhǎng)期 Bt 菌株合成 Cry 和 Cyt 毒素 即 內(nèi)毒 素或伴孢晶體毒素 在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期 Bt 菌株也可以合成其他的殺蟲蛋白 這些蛋白會(huì)被分泌至 培養(yǎng)基中 并被定義為 Vip 和 Sip Vip 與 Sip 毒素都顯示了對(duì)一些鞘翅目 昆蟲的殺蟲活性 Cry 伴孢晶體 蛋白殺蟲機(jī)制 孔洞形成模型 Step1 在堿性的昆蟲幼蟲中腸 可溶的非活性復(fù)合物 Cry1A 被蛋白酶消化 形 成活性的蛋白酶抗性的三域結(jié)構(gòu)的單體 Step2 Cry1A 低親和力 大量地結(jié)合被 GPI 錨定受體錨定在膜脂上的 APN 和 ALP 受體 這種結(jié)合方式促進(jìn)了活性 toxins 定位與富集 Step3 4 與鈣粘素受體的結(jié)合促進(jìn)了 N 末端 helix 1 的蛋白切除 Step5 N 末端的切除誘導(dǎo)了前孔洞寡聚物的形成并且增強(qiáng)了寡聚物與 GPI 錨 定在膜脂上的 APN 和 ALP 受體的親和力 Step6 寡聚物插入細(xì)胞膜 導(dǎo)致孔洞形成與細(xì)胞裂解 最終使害蟲無(wú)法存活 達(dá)到殺蟲的目的 15 結(jié)合谷氨酸棒桿菌中谷氨酸生物合成途徑 代謝調(diào)控 基因組轉(zhuǎn)錄組信息 及其對(duì)環(huán)境的響應(yīng)機(jī)制 闡述提高谷氨酸產(chǎn)量的可能途徑或方法 谷氨酸生物合成途徑以及代謝途徑 谷氨酸生物合成 三羧酸循環(huán)中產(chǎn)生 酮戊二酸 當(dāng) KGA 酮戊二酸 脫氫酶酶活性微弱或喪失時(shí) 酮戊二酸會(huì)在 NADPH 和 NH4 在谷氨酸脫氫酶 作用下 合成谷氨酸 而不會(huì)生成琥珀酸 脫離三羧酸循環(huán)而生成谷氨酸 最 后透過(guò)細(xì)胞膜分泌到胞外 內(nèi)在因素 谷氨酸生產(chǎn)菌的生化特征 具有 CO2 固定反應(yīng)的酶系 菌種能利用 CO2 產(chǎn)生大量草酰乙酸 有利于谷 氨酸大量積累 KGA 酮戊二酸 脫氫酶酶活性微弱或喪失 這是菌體生成并積累 KGA 的關(guān)鍵 KGA 是菌體進(jìn)行 TCA 循環(huán)的中間性產(chǎn)物 很快在 KGA 脫氫酶的作用下氧化脫羧生成琥珀酸輔酶 A 在正常的微生物體內(nèi)濃度很 低 只有當(dāng)體內(nèi) KGA 脫氫酶活性很低時(shí) TCA 循環(huán)才能夠減弱 KGA 才得以積累 為谷氨酸的生成奠定物質(zhì)基礎(chǔ) 谷氨酸產(chǎn)生菌體內(nèi)的 NADPH 氧化能力欠缺或喪失 NADPH 是 KGA 還 原氨基化生成谷氨酸的必須物質(zhì) 該還原氨基化所需要的 NADPH 與檸檬 酸氧化脫羧相偶聯(lián) 由于 NADPH 的氧化能力欠缺或喪失 使得體內(nèi)的 NADPH 有一定積累 NADPH 對(duì)于抑制 KGA 的脫羧氧化有一定的意義 菌體有強(qiáng)烈的 L 谷氨酸脫氫酶活性 L 谷氨酸脫氫酶 谷氨酸產(chǎn)生菌體內(nèi) 該酶的酶活性都很強(qiáng) 酮戊二酸易生成谷氨酸 該反應(yīng)的關(guān)鍵是與異 檸檬酸脫羧氧化相偶聯(lián) 產(chǎn)生菌體內(nèi)乙醛酸循環(huán) DCA 的關(guān)鍵酶 異檸檬酸裂解酶 該酶是一 種調(diào)節(jié)酶 或稱為別構(gòu)酶 其活性可以通過(guò)某種方式進(jìn)行調(diào)節(jié) 通過(guò)該酶 酶活性的調(diào)節(jié)來(lái)實(shí)現(xiàn) DCA 循環(huán)的封閉 DCA 循環(huán)的封閉是實(shí)現(xiàn)谷氨酸發(fā) 酵的首要條件 糖的代謝才能沿著 酮戊二酸的方向進(jìn)行 從而有利于谷 氨酸的積累 外在因素 供氧濃度過(guò)量 NADPH 的再氧化能力會(huì)加強(qiáng) 使 KGA 的還原氨基化受 到影響 不利于谷氨酸的生成 供氧不足 積累大量的乳酸 使發(fā)酵液的 pH 值下降 不利于谷氨酸的產(chǎn)生 同時(shí) 一部分葡萄糖轉(zhuǎn)成了乳酸 影響 了糖酸轉(zhuǎn)化率 降低了產(chǎn)物的提出率 因此當(dāng)供氧量合適的時(shí)候 才有助 于谷氨酸的合成 過(guò)多或多少都不利于谷氨酸的合成 NH4 濃度 影響到發(fā)酵液的 pH 值 與產(chǎn)物的形成有關(guān) NH4 過(guò)量 菌體增殖階段會(huì)抑制菌體生長(zhǎng) 產(chǎn)酸階段 Glu 會(huì)受谷氨酰胺合成酶作用轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺 Gln NH4 不足 不利于 KGA 的還原氨基化 酮戊二酸積累 引起反饋 調(diào) 節(jié) 磷酸鹽過(guò)量 促進(jìn) EMP 途徑 打破 EMP 與 TCA 之間的平衡 積累丙酮酸 產(chǎn)生乳酸等 產(chǎn)生并積累纈氨酸 Val 因此 在發(fā)酵過(guò)程中 要嚴(yán)格控制 NH4 和磷酸鹽的含量 發(fā)酵液的碳氮比 發(fā)酵液中糖含量與谷氨酸的發(fā)酵有密切的關(guān)系 在一定 范圍內(nèi) 谷氨酸的產(chǎn)量隨糖含量的增加而增加 但糖含量過(guò)高 滲透壓過(guò) 大 對(duì)菌體生長(zhǎng)不利 谷氨酸對(duì)糖的轉(zhuǎn)化率低 生物素 當(dāng)生物素過(guò)量時(shí) 菌體生長(zhǎng)繁殖快 谷氨酸合成途徑受阻 發(fā)酵液中 由菌種細(xì)胞排出的谷氨酸僅能占氨基酸總量的 12 生物素適量時(shí) 菌體代 謝失調(diào) 細(xì)胞膜通透性增強(qiáng) 細(xì)胞內(nèi)的谷氨酸能及時(shí)排出 有利于谷氨酸的積 累 因此 要根據(jù)發(fā)酵時(shí)期來(lái)控制生物素的含量 發(fā)酵溫度 谷氨酸發(fā)酵前期應(yīng)采取菌體生長(zhǎng)最適溫度 即 30 32 溫 度過(guò)低 菌體生長(zhǎng)繁殖慢 若溫度過(guò)高 菌體易衰老 生產(chǎn)中表現(xiàn)為 O D 值 增長(zhǎng)慢 耗糖慢 pH 值高 最終發(fā)酵周期長(zhǎng) 產(chǎn)酸少 發(fā)酵中 后期菌體 生長(zhǎng)基本停止 為積累大量谷氨酸 應(yīng)適當(dāng)提高發(fā)酵溫度 但溫度過(guò)高 酶 易失活 谷氨酸生成受阻 pH 值 pH 值影響谷氨酸產(chǎn)生菌的生長(zhǎng) pH 前期 pH 7 5 8 0 中后期 pH7 0 7 6 通過(guò)采用流加尿素 氨水或液氨等辦法調(diào)節(jié) pH 補(bǔ)充氮源 泡沫 谷氨酸發(fā)酵是好氣性發(fā)酵 因通風(fēng)和攪拌產(chǎn)生泡沫是正常的 但泡 沫過(guò)多會(huì)帶來(lái)一系列問(wèn)題 1 泡沫形成泡蓋時(shí) 代謝產(chǎn)生的氣體不能及 時(shí)排出 妨礙菌體呼吸作用 影響菌體的正常代謝 2 泡沫過(guò)多 發(fā)酵液 會(huì)外溢 造成浪費(fèi)和污染 3 泡沫過(guò)多 易沖上罐頂 造成染菌 因此 在 谷氨酸的發(fā)酵過(guò)程中控制好過(guò)多的泡沫是發(fā)酵成敗的關(guān)鍵 也就是說(shuō)谷氨酸產(chǎn)生菌的主要特征 酮戊二酸氧化能力微弱 酮戊 二酸脫氫酶喪失或活性低 谷氨酸脫氫酶活性強(qiáng) 還原性輔酶 NADPH H 進(jìn) 入呼吸鏈能力缺陷或微弱 異檸檬酸裂解酶活力微弱 不利用谷氨酸 耐高糖 耐高谷氨酸 CO2 固定能力強(qiáng) 解除谷氨酸反饋抑制 具有向胞外分泌谷氨 酸的能力 基因組信息 谷氨酸棒桿菌的碳代謝及氨基酸合成系統(tǒng)構(gòu)建 糖吸收 PTS 系統(tǒng) 葡萄糖 果糖 甘露糖以及蔗糖 果糖攝取的 PTS 系統(tǒng)相關(guān)基因 ptsI cg2118 pfkB ptsF ptsH 葡萄糖 甘 露糖 蔗糖相關(guān)基因 ptsG ptsM ptsS 碳源的中心代謝系統(tǒng) 基因成簇 如 gap pgk tpippc aceA aceB 或 sdhC sdhA sdhB 含多種同工酶 含有功能未知酶 如 cg0441 和 cg0790 假設(shè)的硫鋅酰胺脫氫酶 cg0949 和 cg0798 檸檬酸鹽 合成酶 生物合成及轉(zhuǎn)運(yùn)代謝系統(tǒng)的重建 對(duì)于利用天冬氨酸鹽或丙酮酸鹽過(guò)量生產(chǎn) L 氨基酸和維生素具有重要作用 進(jìn)行基因組操作來(lái)提高谷氨酸的產(chǎn)量 a 單基因敲除 失去 ODHC 酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體 活性 無(wú)需誘導(dǎo)劑便 可產(chǎn)生 L 谷氨酸 存在誘導(dǎo)劑時(shí)產(chǎn)量可增加 10 通過(guò)改變代謝流來(lái)增 加 L 谷氨酸產(chǎn)量 b 雙基因敲除 dtsR1 和 pyc 的敲除抑制菌體生長(zhǎng) 但可使菌體在無(wú)誘導(dǎo)劑 的條件下產(chǎn) L 谷氨酸 加入生物素 雙突變菌株 L 谷氨酸產(chǎn)量較野生型 提高 13 1 加入吐溫 40 雙突變菌株 L 谷氨酸產(chǎn)量較野生型提高 9 8 吐溫 40 可通過(guò)抑制 DstR 活性使脂肪酸合成降低 進(jìn)而提高谷氨酸產(chǎn)量 dtsR1 或 pyc 敲除后 PEPC 活性提高 通過(guò) PEPC 活性的提高來(lái)彌補(bǔ) dtsR1 或 pyc 敲除對(duì) TCA 的損傷 c 引入外源基因 C glutamicum ATCC14067 pJCtacvgb 具有較高的氧吸 收率 VHb 蛋白提高了重組菌的呼吸效率 發(fā)酵罐發(fā)酵 產(chǎn)量提高 22 搖瓶培養(yǎng) L 谷氨酸的產(chǎn)量提高 23 菌體量提高 30 轉(zhuǎn)錄組信息 調(diào)控蛋白 regulators C glutamicum 158 個(gè)調(diào)控蛋白 128 個(gè) DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 13 個(gè) TCS 應(yīng)答蛋白 10 個(gè)其它調(diào)控蛋白以及 7 個(gè) 因子 占蛋白編碼基因的 5 3 DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 大部分與 DNA 結(jié)合的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子是 HTH 模體 依 據(jù)氨基酸序列相似性可分為 29 個(gè)蛋白家族 大部分都參與負(fù)調(diào)控 抑制可 能 是 C glutamicum 主要調(diào)控方式 雙組份調(diào)控中的應(yīng)答調(diào)控蛋白 這些雙組份系統(tǒng)在感受傳遞外界信號(hào) 調(diào) 控 細(xì)胞生理活動(dòng)過(guò)程中具重要作用 其它調(diào)控基因 主要包括 DnaA CspA IHF PhoU WhiA LytR 以及 PyrR 家族 這些蛋白高度保守 如 PyrR 在多種細(xì)菌中通過(guò)與靶基因 mRNA 上特 異 性序列的結(jié)合調(diào)控嘧啶核苷酸合成基因的表達(dá) 因子 主要包括 其中 SigH 在熱和氧的壓力調(diào)控中具有重要作用 它 調(diào) 控 SigB WhcE HspR ClgR 等基因的表達(dá)以及伴侶蛋白的水解 轉(zhuǎn)錄調(diào)控實(shí)例 全局轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子 GlxR GlxR cAMP 感應(yīng)蛋白 Crp Fnr 超家族 雙調(diào)節(jié)子 調(diào)控 150 個(gè)基因 所 有棒桿菌中保守 參與調(diào)控 芳香化合物的降解 有氧及無(wú)氧呼吸 糖的吸收 酵解及再生 谷氨酸鹽的吸收及氮的同化 醋酸鹽 乳酸鹽 葡萄糖酸鹽 乙醇代謝 脂肪酸和脫氧核糖核酸的合成 細(xì)胞的壓力應(yīng)答及復(fù)蘇 因此會(huì)影響谷氨酸 的生物合成 可以改變適當(dāng)?shù)臈l件來(lái)提高谷氨酸的產(chǎn)量 谷氨酸棒桿菌對(duì)環(huán)境響應(yīng) 谷氨酸棒桿菌的熱激調(diào)控網(wǎng)絡(luò)極為復(fù)雜 它不僅上調(diào) dnaK grpE dnaJ groES groEL 等分子伴侶編碼基因和 hsp 的表達(dá) 還 上調(diào)或下調(diào) 300 個(gè)基因的表達(dá) 谷氨酸棒桿菌中還存在對(duì)滲透壓的信號(hào)感知系統(tǒng) MtrAB 系統(tǒng) 來(lái)感應(yīng) 滲透壓并傳遞信號(hào) 調(diào)控胞內(nèi)基因的表達(dá) MtrAB 系統(tǒng)作用 調(diào)控細(xì)胞壁的 合成以及維持高滲環(huán)境下細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的平衡 谷氨酸棒桿菌耐受高滲 透壓機(jī)制 當(dāng)外界的滲透壓較高時(shí) 胞內(nèi)大量的水分流出 使胞內(nèi)溶質(zhì)的 濃度升高 這種升高的信號(hào)會(huì)被 MtrB 識(shí)別 并活化 MtrA 啟動(dòng) betP 的表 達(dá) BetP 則會(huì)啟動(dòng)細(xì)胞相容性物質(zhì)甜菜堿的轉(zhuǎn)運(yùn) ROS reactive oxygen species 是微生物在有氧代謝中產(chǎn)生的副產(chǎn)物 過(guò) 量的 ROS 會(huì)導(dǎo)致氧脅迫和細(xì)胞損傷 為了保護(hù)微生物免受 ROS 的損害 微 生物在進(jìn)化過(guò)程中形成了一系列的抗氧化系統(tǒng) 谷氨酸棒桿菌對(duì)冷的應(yīng)答 谷氨酸棒桿菌對(duì)酸的應(yīng)答 在中性或低 pH 時(shí) 谷氨酸棒桿菌會(huì)因氧化脅 迫而受損 氧化脅迫的存在會(huì)干擾鐵離子的活性 調(diào)控谷氨酸棒桿菌的代 謝 在酸性條件下半胱氨酸的積累會(huì)抑制谷氨酸棒桿菌的生長(zhǎng) 谷氨酸 棒桿菌對(duì) pH 的應(yīng)答是個(gè)復(fù)雜的過(guò)程 它與氧化脅迫 鐵離子平衡以及新陳 代謝相聯(lián)系 16 什么是多位點(diǎn)序列分型技術(shù) 簡(jiǎn)述其在乳酸菌中的應(yīng)用 多位點(diǎn)序列分型技術(shù) MLST 是一種基于核酸序列測(cè)定的細(xì)菌分型方法 通過(guò) PCR 擴(kuò)增 6 10 個(gè)管家基因內(nèi)部 400 600bp 核苷酸序列 測(cè)定其序列 分 析菌株的變異 從而進(jìn)行分型 與傳統(tǒng)分子生物學(xué)分型方法相比 MLST 操作 簡(jiǎn)單 具有更高的分辨力 能將同種細(xì)菌分為更多的亞型 并確定不同序列型 之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系以及與疾病的聯(lián)系 隨著測(cè)序速度的加快和成本的降低 以及分析軟件的發(fā)展 MLST 逐漸成為細(xì)菌的常規(guī)分型方法 多位點(diǎn)序列分型技術(shù)在乳酸菌中的應(yīng)用 通過(guò)比較 ST 可以發(fā)現(xiàn)菌株的相關(guān)性 即密切相關(guān)菌株具有相同的 ST 或僅有極 個(gè)別基因位點(diǎn)不同的 ST 而不相關(guān)菌株的 ST 至少有 3 個(gè)或 3 個(gè)以上基因位點(diǎn) 不同 對(duì)于已有的成熟 MLST 方案的細(xì)菌 可直接從 MLST 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取分型方 案 乳酸菌種間同源性較高 部分種或亞種的分類學(xué)地位模糊不清 常規(guī)分類技術(shù) 常常很難區(qū)分其近緣種或亞種 多位點(diǎn)序列分型技術(shù)在細(xì)菌分類鑒定中存在明 顯優(yōu)勢(shì) 近些年開(kāi)始應(yīng)用于乳酸菌分類鑒定中 17 簡(jiǎn)述乳酸菌基因組的特點(diǎn) 乳酸菌基因組的特點(diǎn) 基因數(shù)目差異大 不同乳酸菌種之間基因數(shù)目從 1600 到 3000 個(gè)不等 基 因數(shù)差異大 表明乳酸菌處于一個(gè)動(dòng)態(tài)的進(jìn)化過(guò)程之中 大量的基因發(fā)生 丟失 重復(fù)或者獲得新的基因 原因可能是乳酸菌通常生活在豐富的營(yíng)養(yǎng) 環(huán)境中 能夠直接攝取生長(zhǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 進(jìn)而促使基因組簡(jiǎn)化和退化 尤其是糖代謝 攝取和發(fā)酵相關(guān)的基因的衰退 基因組中都含有假基因 所有的乳酸菌都含有假基因且數(shù)目變化很大 如 在腸膜明串珠菌中 20 個(gè) 嗜熱鏈球菌含有 200 個(gè)假基因 假基因數(shù)目的差 異表明乳酸菌基因組處于一個(gè)活躍的退化過(guò)程 基因組中有很多插入序列 乳酸菌基因組中中含有轉(zhuǎn)座因子插入序列 IS 大小一般在 750 2500bp 數(shù)量由格氏乳桿菌基因組的 0 2 到乳酸乳球菌乳 脂亞種的 5 說(shuō)明這些菌有較高的遺傳可塑性 18 簡(jiǎn)述羊毛硫細(xì)菌素的生物合成基因簇的組成及生物合成過(guò)程 羊毛硫細(xì)菌素的生物合成基因簇的組成 參與羊毛硫細(xì)菌素合成的基因一般位于一個(gè)基因簇中 簇中基因一般包括羊毛 硫細(xì)菌素結(jié)構(gòu)基因 修飾基因 轉(zhuǎn)運(yùn)加工蛋白基因 免疫蛋白基因及調(diào)控蛋白 基因 羊毛硫細(xì)菌素的生物合成過(guò)程 結(jié)構(gòu)基因 LanA 首先通過(guò)核糖體合成前體分子 包括 N 端的前導(dǎo)序列和 C 端的 原肽區(qū) 再經(jīng)過(guò)修飾基因產(chǎn)物 LanBC LanM 翻譯后修飾 在前導(dǎo)肽以及加工轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 LanP T 的作用下轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜以及對(duì)前導(dǎo)肽進(jìn) 行切除 將最終形成具有活性的成熟分子運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞膜外側(cè) 在誘導(dǎo)或自誘導(dǎo)條件下 作用于調(diào)控蛋白組氨酸蛋白激酶 LanK 雙組份信號(hào) 系統(tǒng)的組氨酸蛋白激酶 使其磷酸化將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到應(yīng)答調(diào)控蛋白 LanR 雙 組分信號(hào)轉(zhuǎn)到系統(tǒng)的應(yīng)答調(diào)控蛋白 上 通過(guò) LanR 的磷酸化 來(lái)控制結(jié)構(gòu)基因 LanA 對(duì)羊毛硫細(xì)菌素的生物合成 前肽的修飾酶 LanBC LanM 的作用以