趨磁細(xì)菌磁小體與磁小體形成蛋白的應(yīng)用

趨磁細(xì)菌磁小體與磁小體形成蛋白的應(yīng)用 魏靜怡 生命科學(xué)學(xué)院 1400012136 摘 要 趨磁細(xì)菌的磁小體因其優(yōu)良的性質(zhì) 具有很大的合成和應(yīng)用價(jià)值 本文 在介紹趨磁細(xì)菌和磁小體形成的基礎(chǔ)上 重點(diǎn)研究磁小體和類磁小體納米顆粒 的合成 由于趨磁細(xì)菌直接培養(yǎng)與合成磁小體的障礙頗多 所以文章轉(zhuǎn)向研究 磁小體合成相關(guān)的蛋白研究 并重點(diǎn)考察了Mms6蛋白 對(duì)其在體外的礦化作用 與合成的單分散納米磁顆粒 MNP 的性質(zhì)進(jìn)行了探索 此外 文章還研究了 Mms6蛋白合成MNP的方法 確定了較優(yōu)的反應(yīng)條件 具有良好的前景 關(guān)鍵詞 趨磁細(xì)菌 磁小體 Mms6 MNP 1 趨磁細(xì)菌與磁小體 1 1 趨磁細(xì)菌 趨磁細(xì)菌 magnetotactic bacteria MTB 是一類胞內(nèi)含有可感應(yīng) 磁場(chǎng)的磁小體 在鞭毛的輔助下可沿磁場(chǎng)運(yùn)動(dòng)的革蘭氏陰性細(xì)菌 這類微生物分布很廣 常見(jiàn)于氧化還原過(guò)渡界面附近 在酸性環(huán)境 海底 熱泉等特殊環(huán)境也有發(fā)現(xiàn) 系統(tǒng)發(fā)育分析表明 這類菌主要 屬于Proteobacteria 門的 亞屬 自養(yǎng)菌可以通過(guò)氧化鐵等無(wú) 機(jī)物獲得能量 異養(yǎng)菌可以從酒石酸等有機(jī)酸中獲得能量 1 2 磁小體的性質(zhì) 磁小體 magnetosome MS 是指趨磁細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)生成的由膜包圍 的 磁性顆粒 每個(gè)趨磁細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)可包含有1 條至多條磁小體鏈 位 置靠近細(xì)胞壁 一般沿細(xì)胞的長(zhǎng)軸方向分布 磁小體大小一般35 120 nm 強(qiáng)磁性 由生物膜包被 具有單磁疇 呈有序鏈狀排列于胞內(nèi) 磁小體主要成分是Fe3O4 magnetite 或Fe3S4 greigite 形態(tài)有 八面體 立方體 棱柱體 球狀體 牙齒狀和子彈狀等 1 3 磁小體的優(yōu)點(diǎn)與應(yīng)用 磁小體與一般人造磁性納米顆粒相比有許多優(yōu)點(diǎn) 1 有生物膜包 被 且處于超順磁性范圍 不易聚集 具有良好的分散性 2 磁 小體膜上帶有大量生物活性基團(tuán) 可用于與其他分子的共價(jià)連接 且連接其他分子后可方便地通過(guò)外加磁場(chǎng)分離純化 3 載藥磁小 體在體內(nèi)通過(guò)降解磁小體外膜的方式即可實(shí)現(xiàn)藥物的釋放 4 生 物來(lái)源使其具有良好的生物相容性和安全性 所以 磁小體在多個(gè)領(lǐng)域有潛在的應(yīng)用價(jià)值 如細(xì)胞分離 核酸提 取與分離 核酸特異識(shí)別 磁介導(dǎo)熱療 藥物靶向傳送 生物分子 載體 磁性探針 醫(yī)學(xué)成像和環(huán)境重金屬處理等領(lǐng)域 尤其值得注意的是磁小體在信息存儲(chǔ)中的應(yīng)用 因?yàn)榇判◇w具有 超微性 納米級(jí) 均勻性和無(wú)毒性 可生產(chǎn)品位高的磁性生物材料 可以進(jìn)行高清晰 高保真的大容量超高密度磁記錄材料的開(kāi)發(fā) 2 趨磁細(xì)菌合成磁小體的研究與主要障礙 磁小體具有極高的應(yīng)用價(jià)值 故而利用趨磁細(xì)菌直接合成磁小體 是一個(gè)自然的想法 事實(shí)上 有不少研究者已進(jìn)行了趨磁細(xì)菌性質(zhì)的探索與應(yīng)用 如表 1 但是很少有大規(guī)模生產(chǎn)和商業(yè)化應(yīng)用的實(shí)例 這主要由以下原因造成 1 生長(zhǎng)條件苛刻 由于趨磁細(xì)菌主要在氧化還原過(guò)渡界面附近 所以它們的生長(zhǎng) 需要特殊的氧化物與還原性物質(zhì)的濃度梯度 大多數(shù)趨磁細(xì)菌是厭氧的 少數(shù)趨磁細(xì)菌能在較低的氧氣濃度 10 12 條件下生存 但氧氣濃度太高或太低都會(huì)影響其生存 為實(shí)驗(yàn)室大量培養(yǎng)造成了困難 2 磁小體的合成影響因素較多 研究表明 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 鐵離子濃度 碳含量 和氧氣濃度都會(huì) 影響磁小體的產(chǎn)量 甚至是磁小體的大小 這就為大規(guī)模統(tǒng)一 生產(chǎn)磁小體造成了很大障礙 3 生物安全 使用細(xì)菌進(jìn)行磁小體生產(chǎn)并從其體內(nèi)提取磁小體 可能攜帶有 生物膜 蛋白質(zhì) 核酸等污染 這在醫(yī)藥中可能引起很大問(wèn)題 表1 趨磁細(xì)菌相關(guān)研究成果 直接利用趨磁細(xì)菌合成磁小體受到阻礙時(shí) 下一步就是研究磁小體 合成中相關(guān)基因 試圖找到重要的可以在其它工程菌中表達(dá)的基因 進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn) 3 磁小體合成與Mms6蛋白 3 1 磁小體的合成與相關(guān)基因 趨磁細(xì)菌基因組上有一段特殊的區(qū)域 磁小體島 該基因島與磁 小體的合成密切相關(guān) 負(fù)責(zé)細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)陷成為磁小體囊泡 磁小體 蛋白的定位 磁小體排列成鏈 磁鐵礦的生物礦化等步驟 每個(gè)步 驟分別有獨(dú)立的基因控制 研究表明 MagA 有助于趨磁細(xì)菌從外界環(huán)境中吸收鐵 膜蛋白 MamB MamQ MamI 和MamL 在細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)陷成為磁小體囊泡的 過(guò)程中發(fā)揮作用 磁小體可以沿著MamK 蛋白所形成的纖維結(jié)構(gòu)在 胞內(nèi)排列成鏈 酸性蛋白MamJ 可以控制磁小體鏈的形成 另外 還有一種礦化蛋白Mms6 可以輔助磁小體形成與形態(tài)調(diào)控 該蛋白 在近年來(lái)研究很廣 以下具體分析Mms6蛋白性質(zhì)與應(yīng)用 3 2 Mms6蛋白 Mms6蛋白是磁小體形成中起重要作用的蛋白 最先在趨磁螺菌Magnetospirillum magneticum AMB 1中被發(fā)現(xiàn) 并能 與AMB 1體內(nèi)的立方八面體MNP緊密結(jié)合 Mms6的N端疏水 可能 與磁小體的脂膜結(jié)合有關(guān) 其C端可能與鐵離子 磁小體前體或形成 過(guò)程中的晶體表面結(jié)合 羧基的酸性 從而輔助了體內(nèi)MNP立方八 面體性態(tài)的形成 3 3 Mms6蛋白在體外的礦化作用 Arakaki 2 等人發(fā)現(xiàn)Mms6在體外同樣可以輔助立方磁顆粒的形成 且這種體外形成的磁鐵礦呈現(xiàn)出立方八面體的晶體形態(tài) 晶體顆粒 尺寸均勻 超順磁性 與與AMB 1 中的磁小體非常相似中的磁小體非常相似 該發(fā)現(xiàn)就引 發(fā)了后續(xù)對(duì)Mms6合成類磁小體的單分散納米磁顆粒 MNP 的研究 4 Mms6蛋白體外合成單分散納米磁顆粒 MNP 4 1 Mms6蛋白體外合成MNP的性質(zhì) Tanya Prozorov 3 等研究者對(duì)Mms6在體外的礦化作用做了對(duì)比驗(yàn) 證 通過(guò)將Mms6 鐵結(jié)合蛋白 脂籠蛋白Lcn2和BSA放入Fe III 和Fe II 1 2的溶液 在室溫下進(jìn)行共沉淀實(shí)驗(yàn) RTCP 可以觀察 到Mms6礦化效果的明顯優(yōu)勢(shì) 納米顆粒形態(tài)規(guī)則 統(tǒng)一 大小合 適 30nm 圖 1B 而其他鐵結(jié)合蛋白形成的納米顆粒形態(tài)不一且大小偏小 圖1 圖圖 1 1 TEM images of magnetite nanoparticles obtained by co precipitation of FeCl2 and FeCl3 A without protein B with Mms6 C with ferritin Note that ca 5 nm iron oxide nanoparticles seen as darker small dots appear embedded in surrounding globular bodies most likely protein D with Lnc2 and E with BSA 此外 Mms6合成的MNP還具有良好的磁學(xué)性質(zhì) 比較不同鐵結(jié)合蛋 白形成的納米顆粒的磁滯回線 可得Mms6合成的MNP的優(yōu)勢(shì) 1 易磁化 易退磁 由Mms6合成的納米磁顆粒磁滯回線狹長(zhǎng) 包圍面積小 磁滯損 耗小 矯頑力小 說(shuō)明其易磁化 退磁 2 超順磁性 由Mms6合成的納米磁顆粒在較低磁場(chǎng)時(shí)較快達(dá)到飽和 說(shuō)明其磁矩 較大 呈現(xiàn)強(qiáng)磁性 在阻隔溫度TB之上 磁滯現(xiàn)象幾乎消失 曲線 都符合Langevin 方程 說(shuō)明其在阻隔溫度TB之上的超順磁性 圖 2 所以 Mms6在體外合成MNP的可行性與優(yōu)越性已被證明 2 4 2 Mms6在體外合成MNP的方法研究 在Tanya Prozorov的研究中 磁納米顆粒分散在溶液中 收集和應(yīng) 用有一定困難 而現(xiàn)今科技 尤其是高通量的數(shù)據(jù)存儲(chǔ) 急需的是 能結(jié)合在固定相上的單分散的MNP 所以 在2012年Johanna M Galloway等人對(duì)Mms6在體外合成納米磁 顆粒的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行了研究與優(yōu)化 完成了對(duì)Mms6表達(dá) 固定 與 礦化這一系列的操作 1 Mms6表達(dá)與純化 在2007年 Tanya Prozorov等研究者已經(jīng)成功表達(dá)與提取了Mms6蛋 白 他們通過(guò)選用AMB 1 趨磁細(xì)菌 設(shè)計(jì)Mms6基因編碼區(qū)的引物 用PCR法成功克隆出Mms6基因 將基因轉(zhuǎn)入pTrcHis TOPO質(zhì)粒 在 Mms6的N端加上多組氨酸標(biāo)簽 并選用大腸桿菌作為載體 成功表達(dá) 并提取了His tagged Mms6 相關(guān)序列如圖3 圖3 Mms6重組蛋白序列與堿基序列 Johanna M Galloway等人在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了優(yōu)化 為了提高產(chǎn) 率 研究者在蛋白后加入了N端麥芽糖結(jié)合蛋白 MBP 以提高 重組蛋白的溶解度 His tag也被插入N端 使得提純更為方便 用固定化金屬離子親和層析 IMAC 進(jìn)行提純 在Mms6序列 和N端還加入了一個(gè)蛋白酶切位點(diǎn) 使得在加入His6 TEV 蛋白 酶的情況下可以切去Mms6后的His8 MBP tag 圖4 圖4 Mms6重組蛋白構(gòu)建 2 固定相的構(gòu)建與Mms6蛋白附著 研究人員使用了自組裝單分子層 SAM 進(jìn)行操作 具體而言 在金表面加上烷硫醇構(gòu)建SAM 實(shí)驗(yàn)使用了兩種SAM 分別為四乙二醇烷基硫醇 PEG 和一端 含羧基的烷硫醇 PEG COOH PEG主要解決生物污損問(wèn)題 即 抵抗蛋白的結(jié)合 而PEG COOH在碳化亞胺 EDC 和N 羥基琥珀 酰亞胺 NHS 存在的條件下可以形成酯鍵 能與蛋白的N端高 效連接 所以 在加入Mms6后 即可進(jìn)行蛋白的固定相附著 如圖5 注 圖5中聚二甲硅氧烷 PDMS 主要作為stamp起隔絕作用 與PEG一起構(gòu)建SAM的pattern 圖5 SAM固定相的構(gòu)建與蛋白附著 3 Mms6礦化方法 回顧2007年已使用的RTCP法 發(fā)現(xiàn)MNP難以結(jié)合在固定相上 這主 要由于溶液中存在可移動(dòng)的Mms6 在溫和條件下一旦滴入堿性液體 可以很快催化礦化反應(yīng) 在液相表面就形成MNP 而在底部的固定相 與堿性液體接觸較晚 礦化效果不佳 所以研究者研究了氫氧化物法POFHK 該方法先用氫氧化鉀對(duì)鐵的 氫氧化物進(jìn)行了部分氧化 再利用Mms6進(jìn)行礦化 原理圖如圖6 圖6 POFHK原理圖 該方法的特點(diǎn)是氫氧化物反應(yīng)較慢 且需加熱 所以在反應(yīng)過(guò)程中 所有反應(yīng)物都能進(jìn)行充分混合和反應(yīng) 這使得在固定相上的Mms6蛋 白能與反應(yīng)物充分反應(yīng) 控制一定實(shí)驗(yàn)條件 可達(dá)到較好的礦化效 果 圖7 圖7 POFHK法Mms6礦化效果圖 在不同實(shí)驗(yàn)條件下操作 得到圖8所示各圖 可見(jiàn)圖8 a 效果最佳 對(duì)應(yīng)條件為80 C 2小時(shí) 試劑 共 10 mL 50 mMFeSO4 40 L 50 60 N2H4 200 mL 26 NH4OH 100 mM KNO3 圖8 不同方法下Mms6礦化效果圖 通過(guò)研究 使用生物方法 Mms6蛋白 進(jìn)行固定相上納米顆粒MNP的 合成已有了較為完善的方案 4 3 Mms6蛋白合成MNP的優(yōu)缺點(diǎn) 1 優(yōu)點(diǎn) 相比化學(xué)方法 如己烷 甲苯 氯仿 290 C反應(yīng) 在 試劑上更易獲得 且生物方法可以持續(xù)生產(chǎn) 反應(yīng)條件上相對(duì)溫和 80 C 2 缺點(diǎn) 實(shí)驗(yàn)試劑的用量 比例 需嚴(yán)格調(diào)控 且仍有一些 MNP附著在了PEG上 PEG應(yīng)該是防止附著的 使得形成的pattern并 不很理想 5 展望與設(shè)想 第一 從目前得到的研究成果看 關(guān)于趨磁細(xì)菌的研究還存 在著巨大的挑戰(zhàn) 尤其是趨磁細(xì)菌的培養(yǎng)和利用 還亟待進(jìn)一步研 究 下一步的研究重點(diǎn)應(yīng)是篩選較易培養(yǎng)的趨磁細(xì)菌并對(duì)其培養(yǎng)條 件進(jìn)行優(yōu)化 可以通過(guò)研究趨磁菌原始生活環(huán)境的理化參數(shù)來(lái)進(jìn)行 實(shí)驗(yàn)室模擬培養(yǎng)或通過(guò)對(duì)其原始生境的改良以發(fā)展固體平板培養(yǎng)獲 得單菌落 尤其可以改造現(xiàn)已研究較多的MSR 1 AMB 1 等大規(guī)模培 養(yǎng)和生產(chǎn)磁小體 第二 可以考慮將趨磁細(xì)菌磁小體合成的相關(guān)基因 磁小體島 轉(zhuǎn)入其他工程菌 如大腸桿菌 進(jìn)行磁小體的大規(guī)模生產(chǎn) 不過(guò) 磁小體合成的相關(guān)基因研究尚不完全 整個(gè)基因島的異源表達(dá)也未 有研究 進(jìn)展較為緩慢 第三 可以考慮重點(diǎn)利用Mms6蛋白合成類似磁小體的MNP 而且 該方面已有較為深入的研究 Mms6蛋白的表達(dá)與體外礦化方法已較 為成熟 且體現(xiàn)出生物方法的獨(dú)特優(yōu)勢(shì) 不過(guò)Mms6礦化還需在實(shí)驗(yàn) 條件上做進(jìn)一步優(yōu)化 相信利用趨磁細(xì)菌磁小體合成的Mms6蛋白進(jìn) 行MNP合成前景光明 參考文獻(xiàn) 1 Magnetotactic Bacteria Performances and Challenges Abhilasha Singh Mathuriya Kratika Yadav B D Kaushik Geomicrobiology Journal 2015 32 780 788 2 A Novel Protein Tightly Bound to Bacterial Magnetic Particles in Magnetospirillum magneticum Strain AMB 1 A Arakaki J Webb T Matsunaga J Biol Chem 278 2003 8745 8750 3 Protein Mediated Synthesis of Uniform SuperparamagneticMagnetite Nanocrystals Tanya Prozorov Surya K Mallapragada Adv Funct Mater 2007 17 951 957 4 Nanomagnetic Arrays Formed With the Biomineralization Protein Mms6 Gavin