【畢業(yè)學位論文】（Word原稿）辣椒分子連鎖圖譜的構(gòu)建及抗疫病QTL定位-蔬菜學碩士論文

密級 ： 論文編號 ： 學位論文 辣椒分子連鎖圖譜的構(gòu)建及抗疫病 位 ap ap I 摘 要 辣椒是世界上最重要的蔬菜作物之一， 辣椒疫病 (.) 是一種毀滅性的土傳病害 , 在世界各地均有發(fā)生，且有逐年加重的趨勢。世界許多辣椒生產(chǎn)國已將辣椒抗 疫病育種作為辣椒育種的主要目標之一 , 我國從 “八 五 ”開始將選育辣椒抗疫病品種列入了國家科技攻關項目。 本研究用抗辣椒疫病的材料 “與 綜合 園藝性狀優(yōu)良 的高 感 材料 “83及其 群體（ 144 株）為試材，采用 術，利用親本從 物組合中篩選多態(tài)性引物，在 椒分子遺傳圖譜的構(gòu)建 及 研究。本研究得到如下結(jié)果： （ 1） 從 512 對 物組合中篩選出具有多態(tài)性 的引物組合 380 對 ，應用其中的 28 對引物組合在 群體中進行抗病性標記的分析。得到 146 個多態(tài)性標記，結(jié)合 子標記（胡勇勝，碩士論文），應用 件進行分析，取 等于 ，構(gòu)建了一張有 12 個連鎖群， 70 個分子標記的辣椒分子連鎖圖譜，其中 54 個為 子標記。 圖譜覆蓋長度為 每個連鎖群長度在 間，標記間平均圖距為 （ 2） 采取切莖法進行抗病性鑒定 ，病原菌為辣椒疫霉菌 ( )長沙分離株，在 養(yǎng)基上 恒溫培養(yǎng) 3 天， 濃度為 103 個游動孢子 /種 10 天后調(diào)查發(fā)病情況。以病斑長度和病斑形態(tài)進行抗病性分級。 0 級 24 株、 1 級 29 株、 2 級 41 株、 3 級 20 株、 4 級 18株、 5 級 12 株。 （ 3） 運用 件的區(qū)間作圖法進行 析。應用能，計算出顯著 值區(qū)間是 在第四連鎖群上檢測到 2 個 點 ，一個 點的 為 在連鎖群上的支持區(qū)域是 0 距離最近的標記 一個 點的 為 連鎖群上的支持區(qū)域 是 距離最近的分子標記 7個 釋表型差異的貢獻率分別為 本試驗的研究結(jié)果為分子標記輔助育種提供可 參考 的標記，為加快辣椒抗疫病優(yōu)良品種的 培育提供可 能的途徑。 關鍵詞 ：辣椒 ， 抗疫病 ， 分子連鎖圖譜 ， 分子標記輔助育種 I is of in As a . in is a . in . in &D In a F2 44 83of 2 a of TL . as (1) 380 of 12 of 28 of to of 2 146 A of on 2 by 4 5 , 2 an (2) to . , 832 .,DA at 8 03 in 0th (to of (3) ,000on , of TL is 41TL is 41of of of 文縮略表 縮寫符號 英文名稱 中文名稱 擴增片斷長度多態(tài)性 過硫酸銨 堿基對 2 混合分離個體分析法 酶解擴增多態(tài)序列 厘摩爾根 十六烷基三甲基溴銨 脫氧核苷三磷酸 溴化乙錠 乙二胺四乙酸 標記輔助選擇 聚丙烯酞胺凝膠電泳 聚合酶鏈式反應 脈沖電場凝膠電泳 聚乙烯毗咯烷酮 隨機擴增多態(tài)性 限制片段長度多態(tài)性 序列特異擴增區(qū)域 簡單重復序列 硼酸電泳緩沖液 緩沖液 N,N,N,N四甲基乙二胺 錄 第一章 文獻綜述 . 1 1 1 辣椒疫病的研究概況 . 1 1 1 1 辣椒疫病 . 1 1 1 2 辣椒疫病抗源的篩選 . 1 1 1 3 辣椒疫病接種鑒定方法 . 2 1 1 4 辣椒抗疫病遺傳規(guī)律的研究 . 2 1 2 分子標記技術 . 3 1 2 1 分子標記的類型 . 3 1 2 2 分子標記在辣椒育種上的應用 . 4 1 2 3 術在蔬菜育種中的應用 . 4 1 3 分子遺傳圖譜 . 6 1 3 1 親本選擇 . 6 1 3 2 作圖群體 . 6 1 3 3 作圖群體的大小 . 7 1 3 4 辣椒分子遺傳圖譜的研究進展 . 7 1 4 數(shù)量性狀基因定位方法及應用 . 8 1 4 1 位方法 . 8 1 4 2 辣椒抗疫病的 析 . 9 1 5 研究目的、意義及試驗設計 . 10 1 5 1 研究目的及意義 . 10 1 5 2 試驗設計 . 11 第二章 辣椒分子連鎖圖譜的構(gòu)建 . 12 2 1 材料與方法 . 12 2 1 1 試驗材料 . 12 2 1 2 模板 提取 . 12 2 1 3 析及反應體系的優(yōu)化 . 12 2 1 4 標記數(shù)據(jù)記錄 . 16 2 1 5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 . 16 2 2 結(jié)果與分析 . 16 2 2 1 提取 . 16 2 2 2 應體系的優(yōu)化 . 17 2 2 3 利用親本進行 物篩選 . 17 2 2 4 構(gòu)圖分子標記的篩選 . 19 2 3 辣椒分子連鎖圖譜的構(gòu)建 . 22 2 4 小結(jié) . 22 第三章 辣椒抗疫病 位 . 24 3 1 材料與方法 . 24 3 1 1 試驗材料 . 24 3 1 2 辣椒疫病人工接種鑒定 . 24 3 1 3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 . 24 3 2 結(jié)果與分析 . 25 3 2 1 抗病性鑒定結(jié)果 . 25 2 2 析 . 29 3 3 小結(jié) . 30 第四章 討 論 . 32 4 1 試驗親本及作圖群體的選擇 . 32 4 2 辣椒疫病抗病性鑒定方法 . 32 4 3 辣椒分子遺傳圖譜的構(gòu)建 . 32 4 4 辣椒抗疫病 析 . 33 第五章 全文結(jié)論 . 32 5 1 采用切莖法進行辣椒疫病的人工接種及抗病性鑒定 . 32 5 2 構(gòu)建辣椒分子連鎖圖譜 . 32 5 3 初步檢測到 2 個辣椒抗疫病性狀的 . 32 參考文獻 . 35 附錄 . 38 致謝 . 41 作者簡介 . 42 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 文獻綜述 1 第一章 文獻綜述 椒疫病的研究概況 辣椒 (.)是一種重要的蔬菜作物 ，為農(nóng)民創(chuàng)造了很高的經(jīng)濟效益， 自 2002年以來我國的辣椒播種面積均在 130 萬公頃以上， 在世界上排名第一 ，并且 種植 面積還在不斷的增加。 該病于 1918 年首次在美國新墨西哥洲發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已在世界各辣椒產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生。近年來，國內(nèi)很多地方都有大面積發(fā)生的報道，給辣椒生產(chǎn) 帶來了很大的損失，使 農(nóng)民的收入 受 到了嚴重的影響，我國從 “八五 ”開始將選育辣椒抗疫病品種列入了國家科技攻關項目。 椒疫病 辣椒疫病是由辣椒疫霉菌引起的一種毀滅性的土傳病害。 辣椒疫霉菌（ .）是由 1922 年命名的，屬于鞭毛菌亞門疫霉屬。 辣椒疫霉菌的寄主范圍很廣，除可侵染辣椒外，還可侵染番茄、茄子等蔬菜。辣椒疫病是一種土傳病害，病菌主要以卵孢子、厚垣孢子在病殘體、土壤及種子上越冬，越冬后的病原菌在適合的條件下從植株根部入侵，病菌也會隨著雨水或 灌溉進行傳播。 溫度對該菌潛育期影響較大，潛育期最適溫度 25 35 。不同的季節(jié)土壤中病原菌的數(shù)量也明顯不同（徐秉良 等 ， 1996）， 黃鳳蓮等 對辣椒疫霉病田土壤進行病菌分離、菌株配對培養(yǎng)、越冬存活形式等研究，發(fā)現(xiàn)病田土壤中的疫霉菌數(shù)量有明顯的季節(jié)性變化，以 5 8 月最多，冬季和初春最少（黃鳳蓮 等， 1999）。 辣椒疫病是一種 易暴發(fā)、易流行、毀滅性很強的病害，該病一旦大暴發(fā)就 會導致 辣椒的大面積減產(chǎn)，甚至絕產(chǎn) ， 所以在辣椒感病前或感病初期進行防治就特別重要。一般來講，在感病初期采取的是化學防治或生物防治，化學防治 應 在植株地上部分發(fā)現(xiàn)病癥前用藥，如果在疫病大面積發(fā)生時再用藥，就基本上沒有效果；生物防治采用對辣椒疫霉菌有較強的抑制作用的生防菌 在土壤和植物根際建立起有效的群體，控制或減少辣椒疫霉病菌孢子的產(chǎn)生，從而控制辣椒疫病的流行。 在 病害 發(fā)生后進行防治 通常 效果 都不理想，所以至今還沒有一種有效的疫病防治方法，而培育抗病品種可以解決這一問題。 培育抗病品種的主要方法 仍然是常規(guī)育種 ，但常規(guī)育種在進行抗性選擇時操作程序較為繁瑣，而且選育時間較長，也易受環(huán)境條件的影響。隨著生物技術的 逐漸成熟 ，通過生物技術選育抗病品種已逐漸成為重要 的防治手段之一，即 子標記輔助育種。 椒疫病抗源的篩選 培育抗病品種的 關鍵 是尋找合適的抗源，有了合適的抗源材料，就為 抗 病品種的培育打下了良好的基礎。 尖辣椒一般對疫病的抗性較強，甜椒大多不抗病。尋找優(yōu)良的辣椒疫病的抗源 一般是在現(xiàn)有的辣椒主栽品種或 野生種 中 尋找及人工誘變。 目前 我國利用苗期灌根法鑒定了 2061份辣、甜椒種質(zhì)資源對疫病的抗性，發(fā)現(xiàn)達到中抗以上的材料有 93份，其中可做抗源的有 9份（李振歧等，中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 文獻綜述 2 2005） （表 1） 。 表 1 我國篩 選的辣椒抗疫病材料 to of 全國辣椒科研育種工作者的共同努力下，采用合適的辣椒抗疫病的材料， 現(xiàn) 已育成了一批優(yōu)良的抗（耐）疫病的辣、甜椒品種，其中包括蘇椒 5 號、甜雜 6 號、中椒 5 號、碧玉、 85 1、西雜 1 號、西雜 2 號、 9185、湘研 2 號、湘研 3 號、湘研 5 號、哈雜椒 1 號等（李樹德， 1995）。 椒疫病接種鑒定方法 準確可靠的抗病性鑒定結(jié)果是開發(fā)抗病分子標記的基礎。 “八五 ”國家 攻關項目課題組（ 1992）制定了辣椒苗期對 簡述如下 ： 選擇本地區(qū)致病力中等偏上 、 來源于青椒上的辣椒疫霉用于接種鑒定。接種體的制備 ， 推薦使用 養(yǎng)基或 V 8 汁液體培養(yǎng)基 ， 25 28 條件下 , 前者光照培養(yǎng) 7 10 d， 后者先暗培養(yǎng) 3 4 d 后 ， 再培養(yǎng) 3 4 d。 近年來，一些學者對影響抗病性鑒定結(jié)果的因素做了進一步的 研究， 林柏青等 （ 1994） 提出單株根際灌根接種 3000個游動孢子 , 與 “八五 ”攻關要求的 3一致，但認為接種苗齡應使用 60日齡幼苗； 毛愛軍 （ 1998） 提出接種量應為 5，接種苗齡為 8究發(fā)現(xiàn)，接種方法、接種體濃度、辣椒生育期、接種時的環(huán)境溫度等對品種的抗病性有較大的影響 （林柏青等， 1994）。易圖永等比較了離體葉片接種、切莖接種、游動孢子液灌根接種 3種方法對 8 個辣椒品種 (品系 )的影響。其中離體葉片接種法是從田間采集葉片進行室內(nèi)鑒定，能夠在短時間內(nèi)檢測多個品種，并且對植株的生長無明顯影響，最適合對種質(zhì)資源稀少株的生長無明顯影響，最適合對種質(zhì)資源稀少的品種進行抗疫病鑒定； 切莖接種法操作簡單，可以測量病斑的長度，反映病斑的擴展 速度，適宜對抗病性進行量化；游動孢子液灌根接種法基本上模擬田間病害的發(fā)生過程， 最能反映品種的真實抗病性，但工作量大，操作較復雜 （易圖永等， 2003） 。 所以 這 3種方法均能用于鑒定辣椒對辣椒疫霉菌的抗病性 在實驗中可根據(jù)自己的實際情況選擇合適的接種鑒定方法。 椒抗疫病遺傳規(guī)律的研究 辣椒疫病的抗病機制比較復雜，最早開始對辣椒抗疫病遺傳規(guī)律進行研究的是 et 1967） ,他從 1967 年開始研究 ,認為辣椒抗疫病是由兩個顯性基因控制的。在隨后的幾十年中，有許 多 學者也致力于辣椒抗 疫病遺傳規(guī)律的研究，認為辣椒抗疫病呈遺傳多樣化的特點，不同的材料名稱 選單位 of 料名稱 選單位 of 119 北京農(nóng)業(yè)大學蔬菜科學系 牛角椒 黑龍江省哈爾濱市農(nóng)科所 蘇省農(nóng)科院蔬菜研究所 79 號 遼寧省農(nóng)科院園藝研究所 941001 天津市農(nóng)科院蔬菜研 究所 5904 湖南省農(nóng)科院蔬菜研究所 93國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所 京市蔬菜研究所 關中線椒 西北農(nóng)業(yè)大學園藝系 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 文獻綜述 3 抗病品種，甚至不同的株系，其抗病性的遺傳方式也會有差異。一般認為辣椒疫病的抗病性是由：單基因遺傳、寡基因遺傳或多基因遺傳。 多年來，許多學者應用不同的抗病材料進行了辣椒抗疫病遺傳規(guī)律的研究，作為研究對象的抗病材料基本上都屬于 。 認為辣椒疫病抗病性是由單基因控制的，但是由一個顯性基因還是一個隱形基因控制沒有得到統(tǒng)一； 人認為是由寡基因，即兩個顯性基因或兩個隱形基 因控制；進入 90 年代后，大多數(shù)學者的研究發(fā)現(xiàn)都傾向于多基因控制。之所以多位學者研究得到的結(jié)論不同，可能是由于在某些辣椒材料 中 水平抗性和垂直抗性并存，而且辣椒疫霉菌不同的生理小種的致病力也由差異。此外，不同的抗病性鑒定方法以及接種鑒定時的環(huán)境條件的差異，都會導致得到不同的結(jié)果。 子標記技術 分子標記是在 繼形態(tài)學標記 、 細胞學標記及生化標記之后出現(xiàn)的 ， 經(jīng)過二十多年的發(fā)展，分子標記已廣泛地應用于種質(zhì)資源遺傳多樣性研究、品種品系鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、目的基因的定位和克隆以及標記輔助選擇育種等各個方面。 子標記的類型 近年來用于蔬菜遺傳育種上的分子標記越來越多 ， 分子育種與常規(guī)育種結(jié)合的方式已經(jīng)成為育種工作主要的發(fā)展趨勢 。 常用的分子標記包括 術 (擴增片段長度多態(tài)性 )、 術 (隨機擴增多態(tài)性 微衛(wèi)星技術 (簡單重復序列 )等等， 每種分子標記技術都有其優(yōu)缺點，可根據(jù)研究內(nèi)容采用適合的分子 標記技術。 基本原理是基因組 用限制性內(nèi)切酶切割 ， 然后將雙鏈接頭連接到 段的末端 ， 通過選擇在 3端分別添加 1 3 個選擇性堿基的不同引物 ， 選擇性地識別具有特異配對順序的酶切片段與之結(jié)合 ， 從而實現(xiàn)特異擴增 。 然后用聚丙烯酰銨凝膠電泳將擴增的 段分離。術近年來被廣泛應用在圖譜的構(gòu)建、品種的鑒定等很多方面。 優(yōu)點主要是所需少；多態(tài)性檢測能力高， 能檢測酶切位點不同造成的多態(tài)性，又能檢測隨機選擇堿基造成的多態(tài)性；簡單高效， 次選擇擴增就能比較幾十甚至 上百個位點；分辨率高，增片段短，片段多態(tài)性檢出率高。 有自身的缺點 ： 技術流程長、難度較大，對操作人員的技術水平要求高；模板反應遲鈍，譜帶可能發(fā)生錯配與缺失；成本較高。 以一個人工合成的隨機寡核苷酸序列為引物 ， 通過凝膠電泳分析擴增產(chǎn)物 增片段多態(tài)性反應了基因組相應區(qū)域的 板 15 25純度要求不高； 事先無需知道 沒有種屬的特異性 ， 一套引物可適用于不同基因組分析 ； 快速 ， 無需克隆制備、同位素標記、 10年來， 點是擴增產(chǎn)物易受反應條件的影響，實驗結(jié)果的重復性差，這些缺點限制了其應用。 6個微衛(wèi)星長度一般小于 同品種中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 文獻綜述 4 或個體核心序列的重復次數(shù)不同，但重復序列兩側(cè)的 用與核心序列互補的引物，通過 復性好、共顯性、在基因組中隨機分布、操作簡單。但是由于 而需要大量的人力、物力和時間，另外其種屬特異性強，開發(fā)所需的費用高昂，因此一些實驗室進行了合作，共同開發(fā)微衛(wèi)星引物。 子標記在辣椒育種上的應用 分子標記技術在國內(nèi)的廣泛應用使得辣椒育種得到了很快的發(fā)展， 現(xiàn) 已將 子純度的鑒定、遺傳圖譜的構(gòu)建和基因定位等方面的工作。李麗等 （ 2004） 應用 記的方法對甜 (辣 )椒進行了多態(tài)性分析。黃三文等 （ 2001） 對辣椒 應的各個環(huán)節(jié)進行了篩選和優(yōu)化 ， 確定了一個簡單、高效、相對穩(wěn)定的 統(tǒng) ， 并篩選出 12 個較穩(wěn)定的 記 ， 可以用于 “中椒 ”系列辣椒的 9 個雜交種的純度鑒定。在基因定位方面，已有多個辣椒抗病及其他性狀基因被定位，大多數(shù)的基因定位都是采用 子標記方法，也有少數(shù)基因定位應用的是 其它分子標記技術 （表 2） 。 術在蔬菜育種中的應用 辨率高等 優(yōu)點，在蔬菜育種上得到了廣泛地應用，主要應用在品種純度鑒定、親緣關系分析、圖譜構(gòu)建及基因定位等方面上。 種純度鑒定 在親緣關系較近，遺傳背景較窄的蔬菜品種純度鑒定方面， 比常規(guī)的根據(jù)田間表型性狀的鑒定方法相比，利用分子技術鑒定有著簡單、方便、用時短等優(yōu)點。 常被用來進行品種純度的鑒定。 有研究者 利用 個甘藍雜交組合及其 到了清晰的 雷等， 2001）。 緣關系分析 利用分子標記技術進行親緣關系的分析是在 受外界環(huán)境的干擾，準確性高。孫德嶺等（ 2001）利用分子標記技術對白菜類蔬菜間的親緣關系進行了研究，使用 10對選擇性引物組合，擴增出 4173條擴增帶，并對其進行聚類分析，結(jié)果表明：蕪菁與結(jié)球白菜和不結(jié)球白菜親緣關系遠；而結(jié)球白菜與雞冠菜和毛白菜親緣關系較近，與其它不結(jié)球白菜親緣關系較遠。顧興芳等（ 2000）利用 果認為： 用該技術對黃瓜進行遺傳多樣 性和物種親緣關系分析是完全可行的。 譜構(gòu)建 分子遺傳圖譜的構(gòu)建是蔬菜遺傳研究的重要內(nèi)容之一，建立有效的、準確的遺傳圖譜是基因定位、基因克隆的基礎。 復性好，且在一次相互實驗中可觀察到大量的 以目前 盧剛等利用白菜和蕪菁雜交建立的 建了含 131個 蓋 1810 9（盧 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 文獻綜述 5 表 2 辣椒主要抗病基因及其它性狀的 位 in 狀 關基因 圖群體 ( 數(shù)目 ) 圖標記 （ 數(shù)目） 在染色體or 獻 節(jié)花數(shù) 22(46) 218) 2， P， 1993 抗 69) 117) , 1995 果實形態(tài) H(169) 117) , 1995 控制辣味 c 69) 117) , 1995 控制果實顏色 2(151) , 1998 抗疫病 18H(94) 9 同工酶 1 表型 5 003 抗 2(23) 4 ， 1996 抗 2(23) 4 ， 1996 抗 ，1996 抗 ，1996 抗 H(94) 38 ， 1997 抗 2(151) ， 1999 抗細菌性斑點病 H， 1999 抗 2(153) 10 ， 2000 抗 3(29) 0 C， 2000 抗 2(200) 0 ， 2000 育性恢復 2 X， 2000 抗白粉病 5H(101) 4 5,6,9,10,12 ， 2003 果實相關性狀 53(183) B， 2001 產(chǎn)量相關性狀 848) 2 U， 2003 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 文獻綜述 6 剛等， 2002）。 2群體為作圖群體，將 177個標記（ 建了一張辣椒分子遺傳圖譜（ B et 2001）。 因定位 基因定位是以后基因分離及克隆的基礎，質(zhì)量性狀的基因定位一般是利用近等基因系或分離群體分組分析法（ （ 1995）利用 術結(jié)合 檢測與番茄抗葉霉病基因 密連鎖的標記，在 78 對引物所產(chǎn)生的 42000 個 段中，發(fā)現(xiàn)了 3 個標記與 因表現(xiàn)共顯性，通過轉(zhuǎn)座子標記法分離 因，分析含此基因的質(zhì)粒克隆，將其中 2 個 因 位點兩側(cè)約 區(qū)域內(nèi)。蔬菜很多的農(nóng)藝性狀和抗病性狀都是數(shù)量遺傳，數(shù)量性狀的基因定位，即 位也被研究得越來越多。郜剛等（ 2005）運用 記技術對馬鈴薯青枯病抗性基因進行了定位。鄭曉鷹等（ 2002）將大白菜耐熱品種 177 和熱敏感品種 276進行雜交，從雜交后代中獲得遺傳性穩(wěn)定的重組近交系群體，采用 術并結(jié)合 同工酶方法鑒定了與大白菜耐熱數(shù)量性狀相關的遺傳標記，單因子方差分析和多元線性回歸分析檢測到了 9 個與耐熱性 密連鎖的分子標記。 1 3 分子遺傳圖譜 在蔬菜作物中， 目前已構(gòu)建了番茄、馬鈴薯、辣椒、萵苣、甘藍、胡蘿卜、芥菜、豌豆、黃瓜、白菜 、 芹菜等約 20種蔬菜遺傳圖譜 ， 其中有些圖譜包含了上千個分子標記（陸朝福等， 1995）。其中番茄和馬鈴薯的遺傳圖譜相對其他蔬菜作物更為飽和。 本選擇 親本的選擇直接影響到構(gòu)建連鎖圖譜的難易程度及所建圖譜的適用范圍。一要選擇 態(tài)性好的作為親本，這樣圖譜上連鎖的標記就會越多，圖譜的經(jīng)濟價值也就越大；二要選擇純度較高的材料作為親本； 三要考慮親本雜交后代的可育性。在已構(gòu)建成的辣椒分子遺傳圖譜中， 種間親本的多態(tài)性 較 好（ et 1993； et 1999） ，但 如果從育種的實際意義來考慮，種 內(nèi) 圖譜則更有優(yōu)越性，較為常用的抗源材料有 些材料都屬于 et 995； et 002； 張寶璽， 2003） 。 圖群體 到目前