【畢業(yè)學位論文】（Word原稿）采用免疫組化法檢測u-PA與VEGF在胃癌組織中的表達，探討其與胃癌生物學行為的關(guān)系

- 1 - 第一章 前言 胃癌是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，根據(jù)最近的癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)， 2011年全球新發(fā)胃癌病例約 例，死亡病例約 例 ，約占全部癌癥死亡人數(shù)的 l/101，其在惡性腫瘤中的死亡率居第二位 1,2，胃癌高發(fā)地區(qū)主要集中在東亞、拉丁美洲和中歐地區(qū)，其中東亞地區(qū)以日本、韓國和中國為主，這三國胃癌病例數(shù)約占全球總數(shù)的 2/3。我國胃癌的年發(fā)病率占世界胃癌的 42%，是影響人民健康的主要疾病之一 3。胃癌的高發(fā)病率和高死亡率一直嚴重威脅著人類身心健康，給患者家庭和社會帶來了極其沉重的經(jīng)濟和社會負擔 4。對于可切除胃癌來說，根治性手術(shù)是主要治療手段之一，早期胃癌手術(shù)根治率可達 90%以上，然而我國胃癌早期檢出率僅為 10%，遠低于同為胃癌高發(fā)地區(qū)的日本和韓國(50%60%)5。也就是說，大部分胃癌患者就診時腫瘤已屬進展期，導致術(shù)后復發(fā)轉(zhuǎn)移率高達 406，其主要原因是胃癌患者癥狀、體征不典型，檢測時缺乏特異性標志物 ， 絕大多數(shù)患者在確診時已進入晚期，或伴有廣泛的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腹膜轉(zhuǎn)移或遠處臟器轉(zhuǎn)移而喪失了手術(shù)根治機會 7，無法行胃癌根治手術(shù)，導致胃癌患者 5 年生存率不足 20%8，其浸潤和轉(zhuǎn)移是影響生存質(zhì)量 和預(yù)后 的主要因素，也是影響治療效果的重要因素之一 9。 胃癌發(fā)生的病因尚不明確，目前尚無證據(jù)表明任何一種單一的因素是胃癌發(fā)病的直接原因，可能的致病因素有：飲食因素、膽汁反流、幽門螺桿菌感染、亞硝胺以及以上多種因素和遺傳因素等。胃癌的發(fā)生發(fā)展大部分需要經(jīng)歷正常胃粘膜慢性胃炎 萎縮性胃炎腸上皮化生上皮內(nèi)瘤變早期胃癌進展期胃癌這一多階段、多步驟、逐漸演變的過程。吸煙、幽門螺桿菌感染、攝入亞硝酸鹽食物（腌制和熏烤類食物）、高鹽飲食等多種因素造成正常胃粘膜細胞發(fā)生原癌基因激活和抑癌基因失活，導致正常胃粘膜細胞逐漸惡變?yōu)槲赴┘毎?10。多數(shù)研究表明胃癌的浸潤和轉(zhuǎn)移是多基因、多因子協(xié)同作用的結(jié)果 11，主要涉及腫瘤細胞的粘附改變；細胞外基質(zhì) ( 降解增加；細胞增殖改變；細胞遷移能力增強；新生血管形成等。其中細胞外基質(zhì) (基底膜 (降解是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中極其重要的一個步驟。胃癌患者的預(yù)后與胃癌臨床病理分期、組織類型、浸潤胃壁深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及治療措施有關(guān)，而胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移能力是影響病人預(yù)后的最主要因素，轉(zhuǎn)移往往是導致病人死亡的直接原因。 腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn) 移是一個復雜的生物學過程，涉及癌細胞從原發(fā)灶脫落 、- 2 - 侵襲和穿透基底膜，降解細胞外基質(zhì)和向遠處轉(zhuǎn)移等步驟。腫瘤轉(zhuǎn)移主要包括：血管生成，腫瘤細胞脫離原發(fā)部位，浸潤周圍正常組織，與細胞外基質(zhì) (包括基底膜 )發(fā)生粘附并使之降解，穿越血管或淋巴管壁進入管腔并到達遠處部位，在繼發(fā)部位不斷增殖形成轉(zhuǎn)移瘤。癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力與其產(chǎn)生降解細胞外基質(zhì)的蛋白酶的能力密切相關(guān)，其中纖溶酶原激活因子 (降解細胞外基質(zhì)的過程中起著關(guān)鍵性作用 12。纖溶酶原激活因子包括尿激酶型（ 組織型 (尿激酶型纖溶酶原激活劑（ 一種多功能絲氨酸蛋白酶，具有水解蛋白和信號傳導等多種功能，其中最重要的作用是激活纖溶酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w溶酶，后者可催化降解細胞外基質(zhì) (重要組成部分 (纖維蛋白和層粘連蛋白）和基底膜等多種底物，與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān) 13，它既可以通過催化纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶導致細胞外基質(zhì)和基底膜的降解，從而促進腫瘤細胞 侵襲與 轉(zhuǎn)移 14；也可通過與細胞表面的特異性受體結(jié)合促進細胞的遷移和增殖 15。另外，活性纖溶酶還能激活基質(zhì)金屬蛋白酶的前體，活化的 進一步降解 細胞遷移和腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中細胞外基質(zhì)的降解有重要作用 16。同時， 過與細胞表面特異性尿激酶受體 (合啟動 賴的蛋白水解系統(tǒng)，進而促進腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移， 統(tǒng)與多種實體腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移和腫瘤血管生成有關(guān) 17。 腫瘤生長具有明確的血管依賴性，新生血管的形成，是實體腫瘤發(fā)生、發(fā)展甚至轉(zhuǎn)移的必要途徑 18。腫瘤通過新生血管從宿主獲取營養(yǎng)成分，又經(jīng)過血管向宿主輸送腫瘤細胞，增強腫瘤灶的遠處轉(zhuǎn)移能力 19。腫瘤血管 生成與腫瘤的生長、浸潤、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān) 20。在眾多與血管新生有關(guān)的因子中，血管內(nèi)皮生長因子 (其受體 (腫瘤新生血管形成過程中起重要作用。血管內(nèi)皮生長因子（ 血管內(nèi)皮細胞的特異性有絲分裂原 21，是惡性腫瘤細胞分泌的最重要的血管生成促進因子 22，主要 通過結(jié)合 細胞外的信號傳遞到細胞內(nèi)，引起下游信號瀑布樣級聯(lián)反應(yīng)，從而發(fā)揮其重要的生物學作用 23。要通過刺激血管內(nèi)皮細胞的增殖、分化與遷移、增加微小血管的通透性及促進基質(zhì)降解等機制來促進腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移 24，它與惡性腫瘤患者預(yù)后的關(guān)系是近年來的研究熱點。本研究旨在通過采用免疫組化法檢測 胃癌組織中的表達，探討其與胃癌生物學行為的關(guān)系，并進一步為臨床診斷、治療及預(yù)后提供較為可靠地依據(jù)。 - 3 - 第二章 材料與方法 本來源 收集甘肅省人民醫(yī)院和蘭州大學第一醫(yī)院 2011 年 10 月 2012 年 10 月期間手術(shù)切除并經(jīng)病理證實的 98 例胃癌標本，所有患者術(shù)前均未接受過放化療，其中男 62 例，女 36 例，年齡 39，平均年齡 53 歲，中位年齡 55 歲，根據(jù) 2003年國際抗癌聯(lián)盟（ 布的胃癌 期標準為胃癌患者進行臨床分期， 期 30 例， 68 例；高、中分化腺癌 45 例，低分化腺癌 53 例；浸潤達漿膜層者 60 例，浸潤未達漿膜層者 38 例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者 66 例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者 32 例。隨機選取上述手術(shù)切除標本的癌旁正常胃組織（距胃癌組織邊緣 5 上）作為對照組。所選組織均經(jīng) 4多聚甲醛固定 24 h，常規(guī)石蠟包埋， 4 m 厚連續(xù)切片，供免疫組化檢測。 要試劑 試劑名稱 公司名稱 兔抗人 用型） 武漢博士德生物工程有限公司 兔抗人 用型） 武漢博士德生物工程有限公司 劑盒 武漢博士德生物工程有限公司 武漢博士德生物工程有限公司 蘇木素 蘭州大學第一醫(yī)院制備 二甲苯 西安三浦化學試劑有限公司 鹽酸 杭州市長征化工廠 磷酸鹽 (沖液 北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司 枸櫞酸三鈉 湖北省醫(yī)藥公司 主要儀器 儀器名稱 公司 名稱 - 4 - 石蠟切片機 德國 恒溫電烤箱 冰箱 山東省青島海爾公司 電磁爐 學顯微鏡 日本 濕盒 武漢博士德生物技術(shù)有限公司 不銹鋼 壓力鍋 福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司 恒溫孵育箱 上海益恒試驗儀器有限公司 顯微攝像系統(tǒng) 日本 實驗方法 石蠟切片置烤箱 58 30 使切片緊密粘附。 切片常規(guī)脫蠟水化：石蠟切片經(jīng)二甲苯和梯度酒精逐級脫蠟，水化至蒸餾水， 沖洗 5 次。 3%溫作用 10 分鐘以滅活內(nèi)源性酶。 洗 5 次。 熱修復抗原：將切片浸入 櫞酸鹽緩沖液（ 放入電熱式壓力蒸汽滅菌器中高壓修復 20 然冷卻， 5 次。 吸去片上的 加 10%正常山羊血清，室溫下置濕盒內(nèi) 30 棄去多余的血清，滴加適當稀釋的一抗， 4 過夜（ 16 h 以上）。 自冰箱中取出濕盒，室溫下復溫 30 洗 5 次。 甩去 ，滴加生物素化山羊抗兔 37 孵育 20 洗 5 次。 甩去 ，每張切片滴加過氧化物酶標記鏈酶卵白素工作液， 37 孵育 20 洗 5 次。 色 ： 使用 色試劑盒 (取 1 餾水 ， 加入試劑盒中 A、 B、 C 試劑各 1 滴 ， 混勻后加至切片。室溫顯色 ， 鏡下控制反應(yīng)時間。 蘇木素輕度復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。 - 5 - 結(jié)果判定 性染色均以腫瘤細胞胞質(zhì)為主，細胞質(zhì)呈棕黃色染色者為陽性細胞，隨機選取每張切片的 5 個高倍（ 400）視野，計數(shù)陽性細胞數(shù)并計算陽性細胞的百分率，陽性細胞數(shù) 5% 定義為 () ， 5% 25%定義為 (+)， 25%50%定義為 (+)， 50%定義為 (+)。以 (+ +)均視為陽性表達， ()視為陰性表達。 統(tǒng)計學分析 采用 計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計數(shù)資料組間比 較采用 2檢驗，等級資料相關(guān)性分析采用 相關(guān)分析。以 P差異有統(tǒng)計學意義。 - 6 - 第三章 結(jié)果與討論 果 性表達主要位于癌細胞胞質(zhì)內(nèi)，癌旁正常胃粘膜細胞胞質(zhì)少量表達，呈棕黃色或棕褐色（圖 1檢測出 胃癌組的陽性表達率為 明顯高于癌旁正常組 的 兩組間比較差異有統(tǒng)計學意義（ 2=P； 胃癌組的陽性表達率為 明顯 高于癌旁正常組 的 兩組間比較差異有統(tǒng)計學意義 （ 2= P表1）。 98 例胃癌 組織 中， 低分化 胃癌 組織中的陽性 表達 率為 明顯高于 中、高分化的 在胃癌浸潤達漿膜層中的陽性 表達 率為 85%， 明顯高于 浸潤 未達漿膜層 的 在已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 胃癌組織 中的 陽性 表達 明顯高于 未 發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的 在胃癌 組織 期（ +期）中的陽性 表達 率為 明顯高 于 期（ +期） 的 60%， 上述各組間 比較， 差異均 具有統(tǒng)計學意義（ 2=P=2=P=2=P2=P=（表 2） ； 低分化 胃癌 組織中的陽性 表達 率為 明顯高于 中、高分化的 在胃癌浸潤達漿膜層中的陽性 表達 率為 明顯高于 浸潤未達漿膜層的 在已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織中的陽性 表達 率為 明顯高于 未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的 在胃癌組織 期（ +期） 中的陽性 表達 率為 明顯高于 期（ +期）的 50%，上述各組間比較，差異均 具有統(tǒng)計學意義 （ 2=2=P=2=P=2=P（表2）。 在 98 例胃癌 組織 中， 為陽性者 62 例，同為陰性者 10 例，- 7 - 二者之間在胃癌中的表達呈顯著正相關(guān)（ P見表 3。 附表 表 1 胃癌組織和癌旁正常組織中的表達 of in 別 例數(shù)(n) 達 2值 P 值 達 2值 P 值 陽性 (n) 陰性 (n) 陽性率（） 陽性 (n) 陰性 (n) 陽性率（） 胃癌組 98 76 22 4 24 常對照 組 30 2 28 27 2 胃癌組織中 表達與臨床病理特征的關(guān)系 of in 床病理特征 例數(shù) 達 2值 P 值 達 2值 P 值 陽性（ n） 陽 性 率（ %） 陽性（ n） 陽性率（ %） 分化程度 高 、中分化 45 30 9 分化 53 46 5 潤深度 達漿膜層 60 51 2 達漿膜層 38 25 2 巴結(jié)轉(zhuǎn)移 有轉(zhuǎn)移 66 59 6 轉(zhuǎn)移 32 17 8 期 + 30 18 60 5 + 68 58 9 3 胃癌組織中表達的相關(guān)性分析 in P 值 10 11 1 0 14 5 12 13 0 1 7 10 0 1 7 6 - 8 - 附圖 圖 1 免疫組化 檢測 胃癌組織和癌旁正常組織中的表達 (200) 1 of in by P 00) A: of in B: of in - 9 - 圖 2 免疫組化 檢測 胃癌組織和癌旁正常組織中的表達 (200) 2 in by P 200) C: in D: in - 10 - 圖 3 免疫組化 檢測 胃癌組織和癌旁正常組織中的表達 (400) 3 of in by P 00) A: of in B: of in - 11 - 圖 4 免疫組化 檢測 胃癌組織和癌旁正常組織中的表達 (400) 4 in by P 400) C: in D: in - 12 - 論 惡性腫瘤是當今嚴重危害人類健康的疾病，其最重要的生物學特性是侵襲和轉(zhuǎn)移，流行病學調(diào)查顯示：大量的腫瘤 患者死亡是由腫瘤的轉(zhuǎn)移（ 起。當腫瘤被確診后，對于尚未擴散到腫瘤起始器官以外組織的腫瘤，其治愈率大多數(shù)可以達到 100%。然而當腫瘤發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移時，通常難以治愈。事實上，目前臨床新發(fā)現(xiàn)的腫瘤患者中大約 30%首診時即有轉(zhuǎn)移發(fā)生， 30%患者在隨后的幾年中將發(fā)生轉(zhuǎn)移。尤其是死亡率靠前的腫瘤，如肺癌、胃癌等，患者在被臨床確診時，往往已處于晚期。給外科手術(shù)的切除和系統(tǒng)性抗癌藥物的使用帶來一定的困難，為此 ， 探索腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移的分子機制對其早期診斷、治療及預(yù)后的評估有著重要價值。 腫瘤 細胞的侵襲轉(zhuǎn)移是一個復雜的生物學過程，主要涉及癌細胞從原發(fā)部位脫落 、 侵襲和穿透基底膜，降解細胞外基質(zhì) (包括基底膜 )和向遠處轉(zhuǎn)移等步驟。腫瘤的浸潤（ 指腫瘤細胞破壞基底膜并滲透到基質(zhì)中，但尚未進入局部毛細血管和淋巴管的階段，是惡性腫瘤的典型特征。具體包括細胞間粘著的喪失、細胞 胞外基質(zhì)的蛋白酶解以及肌動蛋白細胞骨架改變參與的移動。浸潤需要細胞間、細胞與基質(zhì)間連接的改變，這是由基質(zhì)降解和細胞遷移相 互 協(xié)調(diào)的結(jié)果。腫瘤轉(zhuǎn)移（ 指腫瘤細胞脫離原發(fā) 生長部位，通過各種途徑的轉(zhuǎn)運，在機體內(nèi)遠隔部位的器官或組織繼續(xù)增殖生長，形成同樣性質(zhì)腫瘤的一個復雜的多步驟的連續(xù)過程 25。 腫瘤轉(zhuǎn)移主要包括：血管生成 、 腫瘤細胞脫離原發(fā)部位 、 浸潤周圍正常組織 、 與細胞外基質(zhì) (包括基底膜 )發(fā)生粘附并使之降解 、 穿越血管或淋巴管壁進入管腔并到達遠處部位 、 在繼發(fā)部位不斷增殖形成轉(zhuǎn)移瘤。癌細胞的浸潤與轉(zhuǎn)移是整個轉(zhuǎn)移事件中密不可分的相互關(guān)聯(lián)的兩個方面，浸潤是轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)和前提，轉(zhuǎn)移是浸潤的結(jié)果。癌細胞浸潤四周組織為轉(zhuǎn)移鋪平道路，浸潤中有轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移中有浸潤。由此可見腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移是多步驟、多階段逐漸演進的過程，涉及腫瘤細胞與宿主細胞間的一系列相互作用，涉及某些基因的異常表達，并受多種細胞因子的影響和調(diào)控。 在 癌細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移過程中會遇到一系列的組織屏障，這些屏障由 主要成分包括：膠原、糖蛋白、層黏蛋白（ 纖連蛋白等。研究表明，腫瘤細胞的浸潤與轉(zhuǎn)移必須突破其周圍的基質(zhì)屏障。在惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的過程中 ， 細胞外基質(zhì)和基底膜是腫瘤細胞侵襲的第一道屏障 26。由于腫瘤細胞要多次穿越基底膜并 侵入周圍組織，因此對 括基底膜）的降解是腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟之一。已有充分的證據(jù)表明腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力與其產(chǎn)生或誘導宿主細胞產(chǎn)生降解 基底膜的蛋白酶能力相- 13 - 關(guān) 27，各種 分的降解需要多種基質(zhì)水解酶的協(xié)同作用才能完成，這些酶有的由癌細胞直接分泌，有的則由癌細胞誘導宿主的其他細胞產(chǎn)生。癌細胞通過其表面受體與 分粘附后，激活和釋出各種蛋白溶解酶來降解基質(zhì)成分，為癌細胞的移動形成通道。與腫瘤細胞降解 關(guān)的蛋白水解酶主要分為：絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、彈力蛋白酶和半黃氨酸蛋白酶。絲氨酸蛋白酶類包括血漿纖溶酶原激活因子（ 白細胞彈力蛋白酶及組織蛋白酶G（ ）。 尿激酶型（ 組織型（ 種形 式，分別具有不同的生理功能。 用系統(tǒng)在細胞外基質(zhì)和基底膜的降解、促進腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起核心作用 28，纖溶酶原（ 纖維蛋白溶解酶激活因子（ 作用下形成纖溶酶（ 后者可降解細胞外基質(zhì)，并且可促使膠原酶原變?yōu)榛钚缘哪z原酶共同參與 降解過程。這種組織基質(zhì)的降解作用在腫 瘤的轉(zhuǎn)移過程如腫瘤血管生成、腫瘤細胞脫落、基質(zhì)浸潤、侵入和逸出循環(huán)系統(tǒng)、繼發(fā)臟器移行和環(huán)境改造等重要步驟中體現(xiàn)出極為重要的效應(yīng)。 腫瘤的生長可分為無血管期（ 血管期（ 體積超過 1腫瘤即進入血管期，需要新生血管維持營養(yǎng)供給和排泄代謝產(chǎn)物從而迅速生長并發(fā)生轉(zhuǎn)移。否則，氧氣和營養(yǎng)在其中的擴散就會受到限制。通過血管生成形成的腫瘤血管系統(tǒng)克服了這種限制，同時也提供了腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的 通 道 。 腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的形態(tài)學基礎(chǔ)是腫瘤新生血管的形成 ， 腫瘤新 生血管的形成是多基因、多環(huán)節(jié)、多程序調(diào)控的結(jié)果。阻遏其中一個或多個基因表達，有可能抑制腫瘤新生血管的形成，從而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移 29。缺乏血管生成，腫瘤生長受到限制，腫瘤細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的可能性也較小 30。有研究表明腫瘤組織的血管新生被抑制，腫瘤的生長速度明顯變慢以及腫瘤組織的體積較不被抑制的情況 明顯減小 31。血管生成的快慢及其滋生的豐富與否，決定腫瘤發(fā)展速度的快慢和侵襲能力的強弱，也就是說，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲與血管生成密切相關(guān)。一般情況下，血管化常常是腫瘤向惡性階段演進的關(guān)鍵時期，超微結(jié)構(gòu)和免疫組化的觀察發(fā)現(xiàn)，不同人類腫瘤組織中血管的數(shù)量和密度與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移潛能密切相關(guān) 32。作為腫瘤間質(zhì)的組成成分，腫瘤內(nèi)血管生成不僅供給原發(fā)腫瘤生長所需的營養(yǎng)，也使腫瘤細胞易于向遠處播散，更是腫瘤細胞能否在轉(zhuǎn)移部位生存的重要條件。 目前一般認為血管形成有兩種形式：血管發(fā)生（ 血管生成（ 兩階段合稱為血管新生。正常情況下，血管新生主要見于胚胎發(fā)育階段，當機體處于 “ 促血管生成環(huán)境 ” 下，如傷口愈合、組織缺氧、炎癥或腫瘤 33，生理性血管生成的平衡才 會 被打破。血管發(fā)生是指在胚胎發(fā)育階段，中胚層源的成血管細胞（ 途、聚集，相互聯(lián)接形成早期原始的血管結(jié)- 14 - 構(gòu)，這一過程形成人體的主要大血管。血管生成是指源于已存在的毛細血管和毛細血管后微靜脈以出牙方式發(fā)展出來的新生血管，是腫瘤細胞為了適應(yīng)局部缺氧環(huán)境而發(fā)生的由已經(jīng)存在的微血管芽生出新的毛細血管。血管生成過程包括生理性血管生成和病理性血管生成，具體為： 血管通透性的增加； 內(nèi)皮細胞活化分泌出血管生成所需要的蛋白酶降解基底膜和細胞外基質(zhì)； 內(nèi)皮細胞增殖與遷移； 新生血管床的成熟和固定。血管生成受一些分子的調(diào)節(jié)，這些分子既存在于健康組織中，也存在與病理組織中。 腫瘤血管通過多重機制生長，其中有一些在形式上與正常血管發(fā)育中觀察到的一樣，其機制表現(xiàn)為： 內(nèi)皮細胞出牙形成橋（ 間質(zhì)組織延伸到血管腔中（ 同正常的血管發(fā)育相比，控制這些事件發(fā)生的信號是高度無序的，從而導致混亂的血管組織，不均勻的血管流以及局部的缺氧。除此之外，骨髓及外周血中的內(nèi)皮細胞前體成為腫瘤的發(fā)生源。 在這里他們能夠直接或間接地形成腫瘤血管內(nèi)皮內(nèi)襯。圍繞在腫瘤周圍的淋巴管運輸間質(zhì)液并為腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移提供通路 34。 腫瘤血管的生成是一個復雜的過程，一般涉及到腫瘤細胞、內(nèi)皮細胞、吞噬細胞及其分泌因子的緊密相互作用。腫瘤血管生成的的發(fā)生主要是由于腫瘤細胞釋放血管生成因子激活血管內(nèi)皮細胞，促進內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，同時內(nèi)皮細胞旁分泌某些血管生長因子刺激腫瘤細胞的生長。腫瘤細胞和內(nèi)皮細胞的相互作用自始至終貫穿于腫瘤血管生成的全過程。通常腫瘤新生毛細血管由之前存在的舊血管通過擴展而形成，此過程必須依靠血管內(nèi)皮細胞間的 相互 黏附。內(nèi)皮細胞通過細胞外基質(zhì)的粘附作用侵入血管周圍間質(zhì)，并通過細胞間的黏附作用促進血管條索的形成 35。與正常組織相比，腫瘤內(nèi)的毛細血管往往處于持續(xù)生長狀態(tài)。這些血管極少分化成熟，且在形態(tài)學上表現(xiàn)出很大的差異，如結(jié)構(gòu)粗糙、走形紊亂、常呈不規(guī)則的狹窄、擴張及扭曲。多數(shù)血管壁薄，細胞間間隙較大，血管基質(zhì) 不完善，這種微血管容易發(fā)生腫瘤細胞滲漏進入血管腔，進而向遠處播散，腫瘤的血管生成受到來自宿主細胞和腫瘤細胞本身產(chǎn)生分泌的血管生成刺激因子和抑制因子的 雙重 調(diào)節(jié)。目前明確的有調(diào)節(jié)血管生成作用的內(nèi)源性因子主要包括： 血管生成刺激因子： 。 血管生成抑制因子： 血管內(nèi)皮細胞的特異性有絲分裂原 21，是惡性腫瘤細胞分泌的最重要的血管生成促進因子 22， 為一種特異性作用于血管內(nèi)皮的生長因子，在腫瘤新生血管 形 成過程中起著至關(guān)重要的作用 36。其主要通過刺激血管內(nèi)皮細胞的增殖、分化與遷移、增加微小血管的通透性及促進基質(zhì)降解等機制來促進腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移 24。 腫瘤血管形成的主要誘導劑 ， 可能直接通過作用于內(nèi)皮細胞，吸引巨噬細胞、平滑肌細胞遷移并固定于微血管生成局部，使管- 15 - 腔被覆平滑肌細胞，并逐步形成肌性動脈。同時， 能間接通過刺激內(nèi)皮細胞釋放一氧化氮，引起冠狀小動脈血管擴張，使內(nèi)皮細胞產(chǎn)生利于肌性動脈生成的生長因子，并在這些因子的作用下形成肌性動脈 37。 胃癌的關(guān)系 一般特性 由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜系統(tǒng)合成的一種高度特異性的絲氨酸蛋水解白酶，長度為 6.5 編碼分子量為 55蛋白酶。基因位于第 10 號染色體長臂 ( 10它包括兩條二硫鍵相連的多肽鏈、一個 C 端的絲氨酸蛋白酶區(qū)和一個 N 端的 氨基末端片段（ 與多種途徑的信號轉(zhuǎn)導，促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，調(diào)節(jié)趨化、黏附、遷移 38。 細胞合成與分泌時為活性較弱的單鏈無活性的尿激酶原 (含有 411 個氨基酸，為糖化的單鏈多肽。激肽釋放酶、組織蛋白酶 B 等作用下轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘碾p鏈絲氨酸蛋白酶后，迅速與 激酶型纖溶酶原激活物受體）結(jié)合，活性 催化無活性的纖維蛋白溶酶原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白溶酶 13，而生成的纖溶酶又反饋激活化為有活性的 與組織修復、炎性細胞遷移、新生血管生成等病理生理過程 39；其不僅能直接降解細胞外基質(zhì)中的蛋白核心部分，還能激活基質(zhì)金屬蛋白酶 ( 系統(tǒng)這一重要的基質(zhì)降解系統(tǒng)，并加強基底膜成份如纖維蛋白、層粘連蛋白、膠原、彈性蛋白 等的降解 40。同時與纖維蛋白溶酶一起促進細胞外基質(zhì)和血管基質(zhì)的降解，從而促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移 41。此外，還可引起細胞形態(tài)改 變、細胞骨架重塑及特異性角蛋白磷酸化等 42。在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中， 用系統(tǒng)在細胞外基質(zhì)和基底膜的降解、促進腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起核心作用 28，與腫瘤血管的生成、浸潤及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。 促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的作用，主要表現(xiàn)在： 活化的 直接作用于細胞外基質(zhì)，降解細胞外基質(zhì)中的纖維連接蛋白、膠原等成分； 激活膠原酶的特 性，使膠原酶分解膠原組織，它還可以激活纖溶酶，使基底膜中多種成分降解，從而促進腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移； 通過激活基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)，進一步促進 降解 43，而 降解又有利于腫瘤新生血管的形成 ； 高表達可誘導腫瘤血管的生成，同時促使腫瘤細胞侵入血管，導致腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移； 激活 時 能上調(diào) 4， 統(tǒng)與 互促進，極大地增加了 降解及腫瘤新生血管的形成，從而促進了腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。 45 研究發(fā)現(xiàn) 其受體 合后，介導 胞內(nèi)信號的傳導，進而促進細胞- 16 - 的增殖、分化和遷移 。 表達與胃癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系 46研究報道 在腎小 管上皮細胞、單核細胞、肺上皮細胞及成纖維細胞中表達，也可在腫瘤細胞內(nèi)表達； 47研究發(fā)現(xiàn) 胃癌、肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中的表達均明顯高于正常組織，并與患者的不良預(yù)后相關(guān)；大量研究表明 乳腺癌 48、胰腺癌 49、肺癌 50等惡性腫瘤中均有過表達； 51報道胃癌、結(jié)腸癌的癌中心、癌邊緣、正常組織中 性逐漸降低， 含量以 癌中心部位最高； 52發(fā)現(xiàn)高侵襲性胃癌細胞系的 現(xiàn)高水平表達； 53研究發(fā)現(xiàn)癌組織中的 性率明顯高于癌旁非癌組織； 54的研究顯示 癌組織中 表達與正常胃組織有明顯的區(qū)別。 本研究結(jié)果表明：在用免疫組化方法檢測 98 例胃癌組織中 表達水平時， 達陽性率為 顯著高于癌旁正常組織的 兩組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（ 2=P提示 能在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用， 高表達可能成為胃癌早期診斷的重要分子生物學指標之一 。 表達與胃癌浸潤、轉(zhuǎn)移的關(guān)系 55和 56研究發(fā)現(xiàn)， 多種 腫瘤中過表達，在腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移中起重要作用； 57研究表明許多惡性腫瘤包括肺癌、乳腺癌、大腸癌及胰腺癌等組織中發(fā)現(xiàn)有 高表達，且與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)； 58發(fā)現(xiàn) 乳腺癌、卵巢癌及肺癌中的表達明顯高于正常組織， 達的增高在腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移中扮演了重要角色； 59報道， 其受體的高表達與原發(fā)性大腸癌的遠處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，而與大腸癌患者的生存率呈負相關(guān)，并認為 其受體可能是大腸癌的獨立診斷因子； 60通過對 現(xiàn)陽性表達的結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移患者進行研究，發(fā)現(xiàn)在腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移前 高表達； 38對胰腺浸潤性導管腺癌 ( 及其癌前病變患者進行長期臨床隨訪，發(fā)現(xiàn) 統(tǒng)在胰腺癌的發(fā)生 、 發(fā)展中扮演重要角色； 28與 61研究報到 激活與惡性腫瘤的侵襲力有關(guān)； 62對 4 種胃癌細胞株的 達情況進行研究，結(jié)果顯示，在胃癌細胞株 ， 達的 量最多，達的 力最強，同時，在接種過 5 的小鼠中發(fā)現(xiàn)了腹膜種植瘤，這表明 能與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。 63研究表明- 17 - 表達可能與胃癌的浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)； 64研究發(fā)現(xiàn) 胃癌的獨立預(yù)后因素； 65研究發(fā)現(xiàn)胃癌患者外周血與骨髓中 表達水平明顯高于正常對照組，并與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及術(shù)后復發(fā)顯著相關(guān)，提示外周血 達是胃癌轉(zhuǎn)移的標志。 66報道 性表達可提供胃癌患者預(yù)后的信息，提示 能促進了胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，故可 作為判斷胃癌預(yù)后的指標之一。 67研究發(fā)現(xiàn) 胃癌組織中的 性率分別為 其中浸潤型胃癌的陽性表達率明顯高于膨脹型胃癌； 胃癌的陽性表達率明顯高于 I、 胃癌；血管侵襲癌和遠處轉(zhuǎn)移的癌組織陽性表達率明顯高于無血管侵襲與無遠處轉(zhuǎn)移的癌組織。同時 ，陰性組患者的平均生存時間明顯長于陽性組。這提示 能促使腫瘤的侵襲和遠處轉(zhuǎn)移，故可作為胃癌預(yù)后的指標之一； 68研究發(fā)現(xiàn) 胃癌組織中 的陽性表達率 比正常粘膜高， 伴 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中 達水 平 較 無淋巴 結(jié) 轉(zhuǎn)移者 高 ，且 表達的胃癌患者生存率降低， 提示 統(tǒng) 可能 參 與了胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程， 統(tǒng)可 能 成為胃癌預(yù)后的重要指標 之一 ； 表達的胃癌患者預(yù)后不良， 提示高表達與腫瘤的侵襲能力 密切相 關(guān)。 本研究還發(fā)現(xiàn)胃癌分化程度不同， 表達明顯不同，低分化者（ 的陽性率明顯高于中、高分化者（ （ 2=P=浸潤深度達漿膜層者（ 85%）明顯高于未達漿膜層者（ （ 2=P=有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（ 顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（ （ 2=P隨著臨床 期的增加， 胃癌組織中的陽性表達率亦顯著增加， + 期的陽性率（ 明顯低于 + 期的陽性率（ （ 2=P=與 54的報道類似，其可能原因是高表達 因的癌細胞降解細胞外基質(zhì)和 基底膜 的能力增強，使這部分細胞更易向組織深層和脈管浸潤，更易脫離原發(fā)灶并發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，同時，高表達的 激活纖溶酶 原 轉(zhuǎn)化為纖溶酶，降解細胞外基質(zhì) ，一方面有利于增生的內(nèi)皮細胞穿過基底膜以出芽方式迅速遷移參與血管生成過程；另一方面有利于癌細胞穿過降解的基質(zhì)迅速向周圍浸潤、擴散，同時侵入血管和淋巴管向遠處轉(zhuǎn)移。提示 過表達可反映胃癌的生物學行為，并在腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移中具有重要作用，可作為判斷胃癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能及預(yù)后的分子生物學指標。 一般特性 促血管生成和抗血管生成因子的局部平衡是腫瘤生長過程中的血管生成開- 18 - 關(guān)，此種平衡一旦打亂，則使腫瘤獲得生長和轉(zhuǎn)移的能力 69。 名血管通透性因子（ 是重要的血管生成正性調(diào)節(jié)因子，1989 年 次從牛的腦垂體細胞中發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長因子（ 其在生理及病理血管再生中起關(guān)鍵性作用 70。 族成員包括 A、 B、 C 和 等，通常講的 指 基因位于染色體 6長 148 個外顯子、 7 個內(nèi)含子組成，編碼產(chǎn)物為 45同源二聚體糖蛋白，亞基之間通過二硫鍵相連。 大多數(shù)哺乳動物腫瘤中表達，具有對內(nèi)皮細胞的選擇性和調(diào)節(jié)血管生成等多個步驟的能力， 惡性腫瘤細胞分泌的最重要的血管生成促進因子 22，即有強烈的促血管內(nèi)皮細胞增殖的作用，主要通過刺激血管生成、促進內(nèi)皮細胞 的 增生和遷移、增加微小血管的通透性及促進基質(zhì)降解等機制促進腫瘤血管形成、浸潤與轉(zhuǎn)移 24。 過多方面促進腫瘤血管的生成： (1)促進血管內(nèi)皮細胞的增殖及遷移； (2)拮抗新生血管內(nèi)皮細胞的凋亡； (3)直接作用于血管內(nèi)皮細胞而增加血管通透性，有利于腫瘤細胞進入血管； (4)有促進血管構(gòu)建的作用； 通過調(diào)節(jié)腫瘤組織 生成控制血管的舒縮，增加腫瘤細胞滲透的范圍； 激活淋巴上皮細胞釋放某些趨化因子，促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。 為一種重要的促血管生成因子之一，在腫瘤血管新 生過程中起著至關(guān)重要的作用，其主要生物學功能包括 71： (1)刺激腫瘤新生血管的生成； (2)促進內(nèi)皮細胞的分裂增殖和遷移； (3)具有強烈的血管滲透性， 導致微小血管的滲透性增加，使血漿蛋白外滲并沉積在血管外基質(zhì)中，為腫瘤細胞的分化生長和新生毛細血管網(wǎng)的建立提供必須的營養(yǎng)； 72研究顯示血管內(nèi)皮細胞在作用下，能產(chǎn)生某種蛋白酶，降解之前血漿蛋白外滲形成的基質(zhì)，這為腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移提供了良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。 (4)促進某些蛋白水解酶的作用使細胞外基質(zhì)降解。 上述作用均在胃癌的血管形成、浸潤與轉(zhuǎn)移中起著重要的作用。 表達與胃癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系 目前研究發(fā)現(xiàn)， 正常人多種組織中不表達或少量表達，而在惡性腫瘤組織中常呈過量表達，并以自分泌或旁分泌作用于腫瘤細胞，促進腫瘤細胞生長和抑制凋亡，與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移、預(yù)后及復發(fā)相關(guān) 73； 74報道胃癌、食管癌、肺癌及頭頸部腫瘤等血清中 度顯著升高，而且其升高水平與腫瘤轉(zhuǎn)移及復發(fā)與否有關(guān)； 75研究表明 肝癌、肺癌、胃癌、食管癌、結(jié)腸癌及人的頭頸部鱗狀細胞癌中的陽 性表達率增高，且與血管新生顯著相關(guān)； 76研究發(fā)現(xiàn)， 腎臟惡性腫瘤組織中呈高表達，并通過與 合后，促進血管內(nèi)皮細胞的分裂增殖，從而達到腫瘤血管的- 19 - 新生作用。 表達與臨床特點和病理類型也有一定的關(guān)系，如在高齡患者和腸型胃癌更常見 77； 78研究證實胃癌組織中 表達，是比較準確的預(yù)后不良指標之一； 79報道 胃癌組織中的陽性表達率為 76 ， 且其高表達與腫瘤復發(fā) 、 預(yù)后不良等相關(guān) 80； 81研究發(fā)現(xiàn) 胃癌中的陽性表達率為 42%，而且 達 陽性 的 胃癌 更易發(fā)生血行轉(zhuǎn)移，是較為獨立的預(yù)后指標。 82報道 大多數(shù)哺乳動物腫瘤中表達，具有對內(nèi)皮細胞的選擇性和調(diào)節(jié)血管生成等多個步驟的能力 ； 同時具有很強的促血管內(nèi)皮細胞分裂增殖作用，在實體腫瘤生長過程中起著極為重要的作用。 本組資料中， 胃癌組織中的總陽性率為 顯著高于癌旁正常組織中的 10%， 兩組間比較 差異有統(tǒng)計學意義（ 2=P與 3等和 78在報道胃癌組織中 高表達方面類似。 人體多種正常組織中低表達，而在腫瘤組織中高表達，提示 促進 腫瘤 細胞增殖 與遷移，在腫瘤新生血管生成過程中起著至關(guān)重要的作用， 表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其組織中的表達水平可作為胃癌進展狀況的指標 84，這就為我們下一步探尋 胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用機制打下堅實的基礎(chǔ)。 表達與胃癌浸潤、轉(zhuǎn)移的關(guān)系 目前研究較廣泛的具有較強促血管生成的物質(zhì)，同時還與淋巴管的形成有密切關(guān)系，這些在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中均起著至關(guān)重要的作用； 85研究顯示，腫瘤細胞的增殖和侵襲性增強可能與腫瘤細胞內(nèi) 表達上調(diào)有關(guān)。 86發(fā)現(xiàn)， 胃癌組織中呈高表達，并與其病理學分級、微血管密度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和患者預(yù)后呈 顯著相關(guān)性 ， 表達越高，腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移能力也越強； 87研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌和非小細胞肺癌等腫瘤組織中， 高表達預(yù)示腫瘤轉(zhuǎn)移風險增高和預(yù)后差；在中晚期非小細胞肺癌中 表達明顯增高，且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組表達 高于陰性組，這提示 非小細胞肺癌的進展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)， 88；