1 初步探究影響尿生成因素及腎缺血再灌注的損傷機(jī)制.doc

初步探究影響尿生成因素及腎缺血再灌注的損傷機(jī)制尚曉東1，韓忠宇，許暉陽(yáng)1，盧沛根1，殷杰1， 蘇達(dá)1(1.南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)五年制)指導(dǎo)老師：曾嶸2(2.南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，廣州 510515)摘要：目的：加深理解尿生成的機(jī)理，初步探究缺血再灌注機(jī)制。 方法：分別觀(guān)察正常情況下、IV.NS、IV.20%NS動(dòng)脈血壓，尿量和尿肌酐含量；復(fù)制腎缺血再灌注（I-R）模型，觀(guān)測(cè)動(dòng)脈血壓、尿量和尿肌酐含量。結(jié)果：腎缺血再灌注后血肌酐濃度增高，尿肌酐濃度降低，內(nèi)生肌酐清除率（Ccr）明顯降低。結(jié)論：腎I-R導(dǎo)致腎小球?yàn)V過(guò)能力下降，內(nèi)生肌酐清除率下降。Abstract: Objectives: To deepen the understanding of the mechanism of urine generated and explore the mechanism of ischemia-reperfusion .Methods: Under normal conditions, IV.NS, IV.20% NS arterial blood pressure, urine output and urine creatinine concentration; copy renal ischemia-reperfusion (IR) model, observing arterial blood pressure，urine and urine creatinine concentration. Results: Serum creatinine concentration increased in the renal ischemia-reperfusion, while the urine creatinine concentration decreased, Ccr was significantly reduced. Conclusion: I-R leads to kidney glomerular filtration capacity and the Ccrs decreasing.關(guān)鍵詞：腎缺血再灌注 尿量 肌酐腎是機(jī)體主要排泄器官，內(nèi)生肌酐清除率在一定程度上反映了腎臟排泄能力。尿生成主要包括腎小球?yàn)V過(guò)，腎小管和集合管的重吸收以及腎小管和集合管的分泌三個(gè)基本過(guò)程。腎缺血再灌注(ischemia - reperfusion , I - R) 損傷是臨床上常見(jiàn)的病理過(guò)程,為急性腎功能衰竭的重要發(fā)病環(huán)節(jié)。因此探究理解腎I-R損傷機(jī)制對(duì)于臨床有很大指導(dǎo)意義。本文旨在通過(guò)復(fù)制I-R損傷模型，尿生成和肌酐清除率來(lái)探究腎I-R對(duì)于尿生成的影響。1. 材料與方法1.1材料1.1.1主要試劑與儀器：20%烏拉坦；0.2%肝素生理鹽水；5%葡萄糖生理鹽水； 20%葡萄糖；速尿； PcLab生物醫(yī)學(xué)信號(hào)采集處理系統(tǒng)；壓力換能器；手術(shù)器械；動(dòng)、靜脈導(dǎo)管， 輸尿管導(dǎo)管；恒溫水浴箱分光光度儀，均由南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心提供。1.1.2肌酐測(cè)定試劑：試劑三，試劑四，10mol/L Cr標(biāo)準(zhǔn)品，由南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心提供1.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：家兔，體重2.5kg，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供1.2 探究影響尿生成的因素120%烏拉坦5ml/kg耳緣靜脈注射麻醉，分離右側(cè)頸總靜脈插管，補(bǔ)充5%葡萄糖生理鹽 水30ml；分離左側(cè)頸動(dòng)脈插管監(jiān)測(cè)血壓；腹正中線(xiàn)剪開(kāi)腹腔，行左側(cè)輸尿管插管術(shù)，用刻度試管收集并記錄尿量。取尿0.5ml測(cè)量尿肌酐濃度。1.3 家兔腎I-R模型復(fù)制1游離左側(cè)腎動(dòng)脈，用動(dòng)脈夾夾閉20min，觀(guān)察記錄夾閉后動(dòng)脈血壓及尿量變化。松開(kāi)動(dòng)脈夾，記錄15min尿量。對(duì)實(shí)驗(yàn)室不同實(shí)驗(yàn)組模型分別靜脈輸入NS 50ml、NS49ml+速尿1ml、NS40ml+20%GS 10 ml。觀(guān)察15分鐘記錄尿量。1.4 尿肌酐測(cè)定方法1.4.1 取樣稀釋?zhuān)喝∧蛞?0ul與2ml蒸餾水按1:200比例稀釋1.4.2 加樣配液:表1. 分光光度法測(cè)定尿液OD值各管加樣方法加樣（ml）標(biāo)準(zhǔn)管測(cè)定管空白管測(cè)試樣品上清01.60試劑一(Cr標(biāo)準(zhǔn)品)1.600蒸餾水1.6試劑三0.5 0.5 0.5 試劑四0.5 0.5 0.5 1.4.3 測(cè)定：37 10min水浴加熱，以蒸餾水調(diào)零，測(cè)510nm時(shí)吸光度1.4.4 計(jì)算：肌酐（mol/L）=(測(cè)定灌OD-空白管OD)/（標(biāo)定管OD-空白管OD）標(biāo)準(zhǔn)品濃度201倍1.5 計(jì)算內(nèi)生肌酐清除率 Ccr=尿肌酐濃度/血肌酐濃度尿量（ml/min）2. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1 血壓記錄夾閉腎動(dòng)脈后，動(dòng)脈血壓略有下降，再灌注后，動(dòng)脈血壓回升表2. 家兔腎I-R模型中動(dòng)脈血壓記錄動(dòng)脈血壓正常缺血15min再灌注后10min收縮壓(mmHg)99.86087.965100.845舒張壓(mmHg)84.11461.96787.5952.2尿量記錄2.2.1缺血再灌注后，未施加因素時(shí)，尿量明顯減少；IV 50ml生理鹽水后，尿量回升表3 腎I-R后IV 50ml NS 尿量的變化正常再灌注15min(未施加因素)再灌注（IV NS50ml）尿量(ml/min)0.2400.0600.1412.2.2 缺血再灌注后，IV生理鹽水+速尿后，由于實(shí)驗(yàn)操作問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)室未獲得有效數(shù)據(jù)2.2.3 缺血再灌注后，IV生理鹽水+20%葡萄糖，尿量相對(duì)正常情況略有減少 表4 腎I-R后 IV20%GS+NS 尿量的變化正常缺血再灌注15min（IV 20%GS+NS）尿量(ml/min)0.02250.0152.3血漿，尿液肌酐含量記錄表5.各管OD值及尿量記錄標(biāo)準(zhǔn)管OD值空白管OD值測(cè)定管OD值尿量正常再灌注15min(未施加因素)正常再灌注15min(未施加因素)0.0910.0600.0840.0720.2400.060經(jīng)數(shù)據(jù)處理可知，缺血再灌注后，尿肌酐濃度明顯下降，血肌酐濃度明顯上升表6 腎I-R 血、尿肌酐濃度的變化 正常缺血再灌注15min(未施加因素)尿肌酐濃度（mol/L）1685.81778.06血肌酐濃度（mol/L）152.30175.60umol2.4 內(nèi)生肌酐清除率計(jì)算缺血再灌注后，腎臟肌酐清除率明顯下降表7 腎I-R 腎內(nèi)生肌酐清除率的變化正常缺血再灌注15min（未施加因素）Ccr(ml/min)2.660.273. 討論3.1 影響尿生成的因素3.1.1 在本實(shí)驗(yàn)中，缺血再灌注后，靜脈快速注入大量0.9%NaCl 溶液，尿量比未施加因素時(shí)增加。機(jī)制如下：1).V 大量NS后，血漿蛋白被稀釋?zhuān)獫{膠體滲透壓下降，腎球有效濾過(guò)壓增加，腎小球血漿流量也增加，腎小球?yàn)V過(guò)率增加，尿量增多2；2）.注入大量0.9%NaCl 溶液后血容量增加，抑制抗利尿激素的分泌，導(dǎo)致遠(yuǎn)曲小管和集合管上皮細(xì)胞對(duì)水的重吸收減少，使得尿量增多。33.1.2 靜脈注射高滲葡萄糖，使腎I-R家兔尿量回升。原因是近曲小管對(duì)葡萄糖的重吸收存在一定限度，即腎糖閾。本實(shí)驗(yàn)中，注射高滲葡萄糖后血糖濃度已經(jīng)超過(guò)腎糖閾，導(dǎo)致小管液中有部分葡萄糖沒(méi)有被重吸收，使小管液中溶質(zhì)濃度增加，滲透壓增加，妨礙了腎小管尤其是近曲小管對(duì)水的重吸收，導(dǎo)致尿量增加。43.1.3 靜脈注射速尿，速尿可與髓袢升支粗段的Na+- 2Cl- K+同向轉(zhuǎn)運(yùn)體結(jié)合，由于NaCl 的重吸收被抑制，降低了腎髓質(zhì)的高滲梯度，從而使腎臟濃縮尿液的能力下降，導(dǎo)致水重吸收減少，尿量增加，產(chǎn)生明顯利尿效果。53.2 腎缺血再灌注損傷機(jī)制3.2.1 活性氧機(jī)制6活性氧產(chǎn)生機(jī)制：腎缺血20min，腎臟供血供血供氧不足，再灌注供養(yǎng)時(shí)，提供大量電子受體，使氧自由基在短時(shí)間內(nèi)爆發(fā)性增多。1）缺血時(shí)線(xiàn)粒體呼吸鏈傳遞電子的效能下降，不能產(chǎn)生足夠電子，自由基生成增加；再灌注提供大量氧氣，就會(huì)產(chǎn)生大量大量活性氧；2)血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)XO形成增加，進(jìn)而在次黃嘌呤氧化途徑中產(chǎn)生活性氧增加；3）白細(xì)胞呼吸爆發(fā)產(chǎn)生大量活性氧；4）兒茶酚胺自身氧化；5）誘導(dǎo)NOS表達(dá)合成；6）加上再灌注后體內(nèi)清除活性氧的能力下降，導(dǎo)致組織內(nèi)大量活性氧的產(chǎn)生?；钚匝醯膿p傷作用：膜脂質(zhì)過(guò)氧化，蛋白質(zhì)失活，DNA損傷7，細(xì)胞間機(jī)制破壞等都造成腎臟組織細(xì)胞損傷，腎小球?yàn)V過(guò)能力和腎小管重吸收能力均下降，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)生肌酐清除率下降。3.2.2 鈣超載機(jī)制8鈣超載產(chǎn)生機(jī)制：1)缺血造成細(xì)胞膜對(duì)鈣的通透性增加，再灌注時(shí)，大量鈣離子順濃度梯度進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；2）缺血缺氧，細(xì)胞內(nèi)PH下降，鈉-氫交換增加，進(jìn)而促進(jìn)鈉-鈣交換反轉(zhuǎn)，使胞外鈣離子大量?jī)?nèi)流；3）兒茶酚胺增多，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)釋放鈣離子。鈣超載損傷機(jī)制：1）線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔道開(kāi)放，誘發(fā)細(xì)胞凋亡9（已證明與細(xì)胞色素C相關(guān)性很大）；2）線(xiàn)粒體釋放鈣離子，使胞內(nèi)鈣濃度劇烈升高，激活各種鈣依賴(lài)性蛋白酶、磷脂酶、核酸內(nèi)企鵝們等，造成細(xì)胞膜、細(xì)胞骨架、核酸分解，導(dǎo)致細(xì)胞損傷；3）鈣超載促進(jìn)活性氧生成3.2.3白細(xì)胞作用10缺血期產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物蓄積，組織細(xì)胞碎片等可觸發(fā)急性炎癥反應(yīng)，再灌注時(shí)白細(xì)胞隨血流進(jìn)入組織加劇了炎癥反應(yīng)。白細(xì)胞活化后釋放的趨化因子促使更多白細(xì)胞聚集，引起微循環(huán)障礙；聚集的白細(xì)胞釋放活性氧和各種生物活性物質(zhì)，使驗(yàn)證反應(yīng)失控，并導(dǎo)致組織損傷。3.2.4 高能磷酸化合物合成障礙腎臟缺血時(shí)，細(xì)胞合成ATP的能力在灌注后很長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)才能恢復(fù)。機(jī)制為：線(xiàn)粒體損傷以及ATP合成的前體物質(zhì)如腺苷，次黃嘌呤等在再灌注時(shí)被沖洗出去，進(jìn)而使缺血組織失去再合成高能磷酸化合物的能力或能力減弱。參考文獻(xiàn) 1 金春華. 機(jī)能實(shí)驗(yàn)學(xué)M. 科學(xué)出版社,2006. 2 李雪飛，成春英，張?zhí)旖埽? 影響尿生成的因素綜合性實(shí)驗(yàn)的改革J. 湘南學(xué)院學(xué)報(bào),2005(01). 3 溫敏霞，王黎明，覃莉. 家兔尿生成的影響因素及其作用機(jī)制分析J. 科教文匯(上旬刊),2010(03). 4 姚萍，李云義，劉煥珠，等. 大鼠用于尿生成影響因素的實(shí)驗(yàn)研究J. 第四軍醫(yī)大學(xué)吉林軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2003(02). 5 朱順?lè)ǎ炝⑺? 新袢利尿藥:托拉塞米J. 醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),1995(03). 6 肖獻(xiàn)忠. 病理生理學(xué)M. 第二版. 高等教育出版社. 7 余曉東，崔曙，鄧顯忠等. 細(xì)胞核因子kappa B p50蛋白在腎缺血再灌注損傷中的表達(dá)及意義J. 四川醫(yī)學(xué),2010(10). 8 Wong R, Steenbergen C, Murphy E. 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