微生物產(chǎn)生的免疫抑制活性化合物S-9818的研究Ⅰ. 菌株的分類鑒定.doc

微生物產(chǎn)生的免疫抑制活性化合物S-9818的研究. 菌株的分類鑒定中國抗生素雜志 2000年第2期第25卷 論著作者：田敏張新宜劉瑜俞朵呂淑君李建明單位：田敏 張新宜劉瑜俞朵呂淑君（四川抗菌素工業(yè)研究所，成都610051）；李建明（長征制藥股份有限公司，四川樂山 614006）關鍵詞：他克莫司(FK506)；千佛鏈霉菌新種；菌種分類摘要從我國山東省濟南市郊外千佛山土壤中分離到一株放線菌，編號SIIA-9818，氣生菌絲灰白色或白色，基內(nèi)菌絲分枝、無橫隔、不斷裂。在大部分培養(yǎng)基上基絲為白色，不產(chǎn)可溶性色素，分生孢子絲直型，波曲或鉤狀，孢子橢圓型或圓柱形，孢子表面光滑，絕大部分碳源不能利用，生長溫度偏低，細胞壁化學組份分析含L，L-二氨基庚二酸和甘氨酸，產(chǎn)生新型免疫抑制劑他克莫司(tacrolimus，F(xiàn)K506)。根據(jù)分類研究，菌株SIIA-9818歸屬于鏈霉菌屬，與已知近似菌株比較存在明顯差異，定名為千佛鏈霉菌新種SIIA-9818(Streptomyces qianfoensis sp.nov.SIIA-9818)。 Taxonomic study on the S-9818 producing strain SIIA-9818Tian Min，Zhang Xinyi，Liu Yu，Yu Duo，Lu ShujunandLi Jianming(Sichuan Industrial Institute of Antibiotics，Chengdu 610051)ABSTRACTStrain SIIA-9818 was isolated from soil samples collected in the Qianfo Mountain at Jinan, Shandong province, China. It forms straight, flexible or hook chains of spores with greyish white or white colored.Smooth-surfaced spores were oval or cylindrical. It can not use many kinds of carbohydrate. Temperature range for growth is low. Chemical composition of cell wall contains L,L-DAP and glycine. The strain produces immunosuppressant compound FK506. Based on the results of morphological, physiological and chemotaxonomic characteristic studies, strain SIIA-9818 was placed in the genus Streptomyces and identified as a new species of Streptomyces, proposed the name Streptomyces qianfoensis sp.nov.KEY WORDSFK506；Streptomyces qianfoensis sp.nov.；Taxonomy他克莫司(tacrolimus，F(xiàn)K506)是1984年由日本藤澤制藥公司的研究人員以淋巴細胞IL-2(白細胞介素-2)的產(chǎn)生為靶位篩選到的與環(huán)孢素(CsA)具相似免疫作用機理的微生物產(chǎn)物，該新型免疫抑制劑抑制各種免疫反應的活性較CsA強10100倍。1993年以商品名Prograf在日本上市，并于1994年獲FDA批準在美國用于肝臟移植。在以粘附分子LFA-1(淋巴細胞功能相關抗原-1)及其配體ICAM-1(細胞間粘附分子-1)的結(jié)合抑制為靶位，從微生物次級代謝產(chǎn)物中尋找免疫抑制劑的篩選*過程中，我們從山東省濟南市郊外千佛山的土壤中分離到一株放線菌，編號SIIA-9818。該菌次級代謝產(chǎn)物S-9818經(jīng)結(jié)構論證，證明與FK506同質(zhì)。結(jié)構鑒定結(jié)果另文報道。本文報道活性化合物S-9818產(chǎn)生菌SIIA-9818的分類鑒定結(jié)果。1材料和方法1.1菌株來源從我國山東省濟南市郊外千佛山土壤中分離獲得，編號SIIA-9818。1.2形態(tài)觀察在燕麥汁瓊脂(ISP3)培養(yǎng)基平板上劃線涂菌并插入蓋玻片，28培養(yǎng)730d，用光學顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察菌絲，孢子絲及分生孢子的形態(tài)特征。1.3培養(yǎng)特征主要采用國際鏈霉菌計劃(ISP)和Waksman所推薦的培養(yǎng)基1，28培養(yǎng)730d，觀察其培養(yǎng)特征并進行描述。1.4生理生化反應采用國際鏈霉菌計劃(ISP)推薦的方法，碳源利用實驗以ISP9為基礎培養(yǎng)基，28培養(yǎng)330d，觀察并記錄結(jié)果。1.5細胞壁化學組份分析參照Lechevalier等推薦的方法進行2。2結(jié)果2.1形態(tài)特征SIIA-9818菌株在ISP2、ISP3、ISP4及ISP7培養(yǎng)基上培養(yǎng)714d，生長豐茂，基絲分枝，無橫隔，不斷裂，直徑:0.81.0m，分生孢子絲直型，波曲或鉤狀，孢子橢圓形或圓柱形，0.60.90.91.3m，孢子表面光滑(圖1、2)。2.2培養(yǎng)特征SIIA-9818菌株在酵母麥芽浸汁瓊脂培養(yǎng)基上生長豐富，孢子灰白色，基絲棕色，產(chǎn)棕色可溶性色素，該菌在其它各種培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征見表1。2.3生理生化特征SIIA-9818菌株在蛋白胨-明膠培養(yǎng)基上能液化明膠，牛奶胨化不凝固，淀粉水解陰性，不利用纖維素，硝酸鹽還原陰性，不產(chǎn)生類黑色素和H2S。碳源利用情況：僅利用水楊苷和衛(wèi)茅醇，微弱利用D(+)甘露糖，不利用葡萄糖、蔗糖、棉子糖、D-果糖、甘露醇，D-半乳糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、L-鼠李糖、肌醇和乳糖。適應于低溫生長，1028生長豐茂，高于37不生長。圖1SIIA-9818菌株孢子絲(3500)圖2SIIA-9818菌株孢子(10500)表1SIIA-9818菌株的培養(yǎng)特征培養(yǎng)基生長情況孢子絲基內(nèi)菌絲可溶性色素酵母麥芽浸汁瓊脂豐茂灰白色棕色棕色(ISP2)燕麥汁瓊脂(ISP3)豐茂灰白色白色棕色無機鹽淀粉瓊脂豐茂灰白色白色無(ISP4)甘油-天門冬素瓊脂貧乏白色白色無(ISP5)蛋白胨-酵母膏瓊脂貧乏無無色無(ISP6)酪氨酸瓊脂(ISP7)中度灰白色棕色淺棕色查氏蔗糖瓊脂中度白色白色無查氏葡萄糖瓊脂中度灰白色白色無天冬素葡萄糖瓊脂中度白色白色無高氏1號瓊脂貧乏白色白色無營養(yǎng)瓊脂貧乏無白色無蘋果酸鈣瓊脂不生長2.4細胞壁化學組份SIIA-9818菌株細胞壁含L，L-二氨基庚二酸(L，L-DAP)和甘氨酸。3菌種鑒定菌種SIIA-9818其細胞壁組分含L，L-DAP和甘氨酸，結(jié)合其形態(tài)特征，證明該菌株應歸屬于鏈霉菌屬3，將該菌株與已知近似的鏈霉菌及已知的FK506產(chǎn)生菌比較，結(jié)果見表2、3。比較結(jié)果可看出菌株SIIA-9818與各近似菌株相比均存在不同程度的差異。谷氏鏈霉菌S.gougerotii4孢子梭狀、在ISP2、ISP3、ISP4培養(yǎng)基上氣絲生長少，在ISP2、ISP3培養(yǎng)基上不產(chǎn)可溶性色素，而SIIA-9818菌在ISP2、ISP3、ISP4培養(yǎng)基上生長非常豐茂，在ISP2和ISP3培養(yǎng)基上可產(chǎn)生棕色可溶性色素。S.gougerotii菌株可利用D-木糖、葡萄糖、甘露醇、D-果糖作為生長碳源，而SIIA-9818菌株對以上各碳源均不能利用。與另一近似菌白直絲鏈霉菌S.alborectus5相比，它們孢子絲均為直型或柔曲狀，孢子橢圓至柱形，孢子表面光滑，在ISP2、ISP3、ISP4培養(yǎng)基上生長豐茂，ISP5培養(yǎng)基上生長貧乏，在大部分培養(yǎng)基上基絲白色或淡黃色，可溶性色素無或很少，淡黃，但S.alborectus菌株在ISP3培養(yǎng)基上不產(chǎn)可溶性色素，而SIIA9818菌株產(chǎn)棕色色素。S.alborectus菌株可利用葡萄糖、D-果糖和D-半乳糖，在ISP1培養(yǎng)基上有黑色素產(chǎn)生，有水解淀粉和還原硝酸鹽的能力，而SIIA-9818菌卻與之相反，兩者的代謝產(chǎn)物也不相同，SIIA-9818菌株產(chǎn)FK506，S.alborectus菌株的代謝產(chǎn)物為維吉霉素。SIIA-9818菌株與其他已知的FK506及其結(jié)構類似物FK520，F(xiàn)K523的產(chǎn)生菌相比，相似性也很小，F(xiàn)K520和FK523的產(chǎn)生菌為吸水鏈霉菌6，F(xiàn)K506的另一產(chǎn)生菌S.tsukubaensis(筑波鏈霉菌)7與SIIA-9818菌在形態(tài)特征上極為相似，在生理生化及碳源利用方面幾乎完全相同，但S.tsukubaensis菌在各培養(yǎng)基上基內(nèi)菌絲顏色為淡粉紅至紅橙黃，淡棕色，而SIIA-9818菌除在ISP2和ISP7培養(yǎng)基上基絲為棕色外，在其他培養(yǎng)基上基絲均為白色或無色。其屬水平相關性DNA-DNA同源性研究結(jié)果也顯示菌株SIIA-9818不屬于吸水鏈霉菌，也不屬于筑波鏈霉菌。由此，我們認為菌株SIIA-9818為鏈霉菌屬中的一個新種，建議定名為Streptomyces qianfoensis sp.nov.(千佛鏈霉菌新種)。該菌株保藏于國家菌種保藏委員會抗生素菌種保藏中心。表2SIIA-9818菌與已知近似菌種形態(tài)及培養(yǎng)特征比較SIIA-9818S.gougerotii(谷氏鏈霉菌)S.alborectus(白直絲鏈霉菌)S.tsukubaensis(筑波鏈霉菌)形態(tài)特征孢子絲直，波曲或鉤狀，孢子橢圓形或圓柱形， 孢子孢子絲直型，孢子梭狀，孢子表面光滑，基絲有時斷裂。孢子絲直，柔曲，孢子橢圓形至長圓形，孢子表面光滑。孢子絲直，柔曲孢子長橢圓形或圓柱形，孢子表面光滑。表面光滑。培養(yǎng)特征ISP2Am：豐茂，灰白色Am：少，白或淡黃Am：豐茂，絨狀，淺褐灰色Am：中度，淡灰色Sm：棕色Sm：無色至灰黃色Sm：薄，無色至黃褐色Sm：暗紅橙黃色Sb：棕色Sb：無Sb：淡黃褐色Sb：暗紅橙黃色ISP3Am：豐茂，灰白色Am：少，白或淡黃Am：豐茂，粉狀白色Am：中度，灰色Sm：白色Sm：無色至灰黃色Sm：薄，無色至淡黃色Sm：淡粉紅Sb：棕色Sb：無Sb：無Sb：無ISP4Am：豐茂，灰白色Am：少，白或淡黃Am：豐茂，白色Am：中度，淡黃桔至淺灰色Sm：白色Sm：無色至灰黃色Sm：黃灰色Sm：深橙黃色Sb：無Sb：無Sb：很少，淡黃Sb：無ISP5Am：貧乏、白色Am：少，白或淡黃Am：貧乏、白色Am：中度，淡粉紅至白色Sm：白色Sm：無色至灰黃色Sm：淡黃色Sm：淡粉紅Sb：無Sb：無Sb：很少，淡黃Sb：無查氏蔗糖瓊脂Am：中度，白色Am：中度、白色Am：貧乏Sm：白色Sm：無色Sm：淡粉紅Sb：無Sb：無Sb：無天冬素葡萄糖Am：中度，白色Am：薄，白色Am：豐茂，白色Am：貧乏，白色瓊脂Sm：白色Sm：無色至微黃色Sm：無色至淡黃Sm：淡棕色Sb：無Sb：無Sb：很少，淡黃Sb：無表3SIIA-9818菌株與已知近似菌種生理生化及碳源利用比較菌種名稱SIIA-9818S.gougerotii(谷氏鏈霉菌)S.alborectus(白直絲鏈霉菌)S.tsukubaensis(筑波鏈霉菌)碳源利用L-阿拉伯糖-D-木糖-+-葡萄糖-+蔗糖-肌醇-L-鼠李糖-棉子糖-甘露醇-+-D-果糖-+-D-半乳糖-+-生理生化特性ISP1-+-明膠液化+牛奶凝固-牛奶胨化+(快)+淀粉水解-+-硝酸鹽還源-+-生長溫度1028生長豐茂，高于37不生長537生長1835生長，28為最適生長溫度代謝產(chǎn)物FK506kabicidinvirginiamycinFK506(卡比殺菌素)(維吉霉素)：不利用；：利用；：利用可疑。致謝：本菌種鑒定工作得到四川抗菌素工業(yè)研究所胡潤茂研究員的指導，特此深表感謝！該模型的建立及樣品篩選為國家新藥研究基金資助項目，文號：97Q04。田敏，女，生于1965年，學士，副研究員。參考文獻1，Shirling E B, Gottlieb D. Methods for characterization of streptomyces species. Int Syst Bacteriol，1966；16：3132，Mary P, Lechevalier H. Biology of the actinomyces and related organism. Biol Actinomycetes，1976；11：783，閻遜初. 放線菌的分類和鑒定. 北京：科學出版社，1992：604，閻遜初. 放線菌的分類和鑒定. 北京：科學出版社，1992：5605，Ogata K, Matsuura M, Irie H, et al. A new species of Streptomyces producing Virginiamycin family antibiotics. J Antibiot，1978；31：13136，Hatanaka H, Iwami M, Kino T, et a