甘露聚糖酶水解酵母細(xì)胞壁水解條件的研究.doc

-甘露聚糖酶水解酵母細(xì)胞壁水解條件的研究摘要： 采用單因素實(shí)驗(yàn)研究了底物濃度、加酶量、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度和 pH 值 5 個因素對 -甘露聚糖酶水解酵母細(xì)胞壁的影響。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過正交實(shí)驗(yàn)確定了 -甘露聚糖酶水解酵母細(xì)胞壁的最佳水解條件為：底物濃度為 8%，加酶量為 55%，水解時間為 4.5 h，水解溫度為 55 ，pH 值 6.0。關(guān)鍵詞： -甘露聚糖酶；水解條件；正交實(shí)驗(yàn)；優(yōu)化Study on optimization of hydrolysis by -mannanasein yeast cell wallAbstract: The effects of five factors on the -mannan enzyme hydrolysis of yeast cell wall, such as thesubstrate concentration, enzyme dosage, reaction time, reaction temperature and pH value, were studied. Theorthogonal test showed that the best optimized hydrolysis conditions were as follow： pH value of 6.0,temperature of 55 , time of 4.5 hours, enzyme dosage of 55%, substrate concentration of 8%.Key words: -mannanase; decompose by protease; orthogonal experiment; optimize-甘露聚糖酶(-mannanase)是一類能夠水解含有甘露糖苷鍵的甘露聚糖(包括異甘露聚糖)的內(nèi)切水解酶1，廣泛存在于動植物和微生物中，其主要水解產(chǎn)物為單糖、二糖、三糖、四糖等低聚糖2。隨著人們對甘露寡糖生理功能的發(fā)現(xiàn)和對自然界中纖維素資源的利用， -甘露聚糖酶的研究和開發(fā)進(jìn)入了一個新高潮，已被廣泛應(yīng)用于食品、藥品、飼料、造紙、印刷業(yè)、印染、紡織、石油開采和生物學(xué)研究等領(lǐng)域3-6。目前，-甘露聚糖酶主要用于水解含有-1,4-D-甘露糖苷鍵的魔芋粉、角豆角、瓜兒豆等植物原料以生產(chǎn)甘露寡糖7-8，而利用 -甘露聚糖酶水解酵母細(xì)胞壁中-1,6-甘露聚糖制取甘露低聚糖的研究未見詳細(xì)報(bào)道9。2002年以來我國啤酒產(chǎn)量實(shí)現(xiàn)連續(xù)五年穩(wěn)居世界第一，有豐富的酵母甘露聚糖資源。本實(shí)驗(yàn)是利用實(shí)驗(yàn)室保藏的高產(chǎn) -甘露聚糖酶菌株產(chǎn)生的-甘露聚糖酶水解酵母細(xì)胞壁中 -1,6-甘露聚糖來制取甘露低聚糖，通過研究底物濃度、加酶量、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度和 pH 值對 -甘露聚糖酶水解酵母細(xì)胞壁效果的影響，以確定-甘生物工程7FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食 品 科 技2009 年 第 34 卷 第 2 期露聚糖酶水解酵母細(xì)胞壁獲得甘露低聚糖的最優(yōu)條件，為今后有效利用啤酒發(fā)酵殘?jiān)a(chǎn)甘露低聚糖提供參考。1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)材料酵母細(xì)胞壁：自制；高產(chǎn) -甘露聚糖酶菌株F1-5-10：實(shí)驗(yàn)室保藏。發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母細(xì)胞壁 20 g，KNO31 g，K2HPO43H2O 0.5 g， MgSO47H2O 0.5 g， FeSO47H2O 0.01 g，瓊脂 20 g，蒸餾水 1000 mL，pH7.47.6。1.2 粗酶液的制備取高產(chǎn) -甘露聚糖酶菌株(F1-5-10)在發(fā)酵培養(yǎng)基中活化，按 10%的接種量接種到 1000 mL 的三角瓶中，搖床培養(yǎng) (200 r/min)48 h，500 r/min離心5 min，去除雜質(zhì)，上清液于 9000 r/min、4 離心 10 min，取上清液10。1.3 酶活力的測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取標(biāo)準(zhǔn)甘露糖水溶液 0、0.05、0.1、0.2、0.3、1.4 mg/mL 各 1 mL 分別置于6 支具塞試管中，各加入 DNS 試劑 1 mL，沸水浴5 min，顯色，然后以流水迅速冷卻，加蒸餾水8mL，以空白液調(diào)零，在 540 nm 處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。0.9 mL 0.5% (w/v)角豆膠溶液(由 pH 值 7.0的KH2PO4-NaOH緩沖液配制)，50 保溫 5 min，加入 0.1 mL 適當(dāng)稀釋的酶液，60 水浴 10 min，DNS 法2測還原糖含量。在上述條件下，每 min釋放相當(dāng)于 1 mol D-甘露糖的還原糖所需的酶量為一個酶活單位(U)。2 結(jié)果與分析2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制按照 1.3 方法測得數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖 1。2.2 粗酶液的酶活由酶活力的定義計(jì)算得到粗酶液的酶活為78.59 U/mL。2.3 單因素條件下 -甘露聚糖酶水解效果的研究2.3.1加酶量對 -甘露聚糖酶水解效果的影響取自制酵母細(xì)胞壁 0.8 g，加入到水、酶液中，加入的酶液占總體積的30%、40%、50%、60%和70%。水解 5 h 后，迅速取出放在沸水浴中滅酶活。離心取上清液，測定水解液中甘露低聚糖的含量。加酶量對 -甘露聚糖酶水解效果的影響見圖2。從圖 2 中可以看出，在 -甘露聚糖酶水解自制酵母細(xì)胞壁的過程中，隨著 -甘露聚糖酶的添加量的提高，水解產(chǎn)物中甘露低聚糖的濃度也提高。在酶用量達(dá) 50%后，隨著 -甘露聚糖酶的添加量的提高，甘露低聚糖的濃度提高的趨勢不大。因此，選加酶量為 50%為最佳范圍。2.3.2水解時間對 -甘露聚糖酶水解效果的影響取自制酵母細(xì)胞壁 0.8 g，在 -甘露聚糖酶最適用量的條件下，60 下分別水解 2、3、4、5 h 和 6 h，迅速取出放在沸水浴中滅酶活。離心取上清液，測定水解液中甘露低聚糖的含量。水解時間對 -甘露聚糖酶水解效果的影響見圖 3。從圖3 中可以看出，在 -甘露聚糖酶水解自制酵母細(xì)胞壁的過程中，隨著 -甘露聚糖酶水解時間的增加，甘露低聚糖的含量也隨之增加，當(dāng)水解4 h 后含量繼續(xù)延長時間，但增加趨勢變小。因此，選擇4 h 為最佳水解范圍。2.3.3水解溫度對 -甘露聚糖酶水解效果的影響-甘露聚糖酶最適用量的條件下，分別在45、50、55、60 和 65 水解 4 h。迅速取出放0.80.60.40.200 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5甘露低聚糖濃度/(mg/mL)吸光度（A）y=1.9269x-0.0374R2=0.9941圖 1 甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線4.204.003.803.6030 40 50 60 70 80加酶量/(v/v，%)甘露低聚糖的含量/(mg/mL)圖 2 加酶量對 -甘露聚糖酶水解效果的影響4.204.003.802 3 4 5 6水解時間/h甘露低聚糖的含量/(mg/mL)圖 3 水解時間對 -甘露聚糖酶水解效果的影響生物工程8FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食 品 科 技2009 年 第 34 卷 第 2 期4.94.64.343.7加酶量 底物濃度 水解時間 溫度 pH甘露低聚糖的含量/(mg/mL)圖 7 因素指標(biāo)關(guān)系圖在沸水浴中滅酶活，離心取上清液，測定水解液中甘露低聚糖的含量。水解溫度對 -甘露聚糖酶水解效果的影響見圖 4。蛋白酶在適宜的溫度下其活力最高，從圖 4可以看出，在 55 時，甘露低聚糖的濃度最高，隨著溫度升高，由于酶失去活性，水解效果減弱。因此，選擇 55 范圍較適宜。2.3.4 底物濃度對 -甘露聚糖酶水解效果的影響5%、6%、7%、8%和 9%濃度的自制酵母細(xì)胞壁在 -甘露聚糖酶最適用量的條件下，55 進(jìn)行水解反應(yīng) 4 h 后，迅速取出放在沸水浴中滅酶活。離心取上清液，測定水解液中甘露低聚糖的含量。底物濃度對 -甘露聚糖酶水解效果的影響見圖 5。從圖 5 中可以看出，在 -甘露聚糖酶水解自制酵母細(xì)胞壁的過程中，隨著自制酵母細(xì)胞壁濃度的增加，甘露低聚糖的含量也隨之增加，自制酵母細(xì)胞壁濃度為 7%時，甘露聚糖酶對自制酵母細(xì)胞壁的降解程度達(dá)到最大。繼續(xù)增大酵母細(xì)胞壁的濃度，甘露低聚糖的含量卻減少，說明底物濃度過大會抑制 -甘露聚糖酶的活性。所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取最佳的自制酵母細(xì)胞壁加入量為 7%。2.3.5 pH 值對 -甘露聚糖酶水解效果的影響 在-甘露聚糖酶最適用量的條件下，控制一定的 pH值范圍進(jìn)行水解反應(yīng)，pH 值對 -甘露聚糖酶水解效果的影響見圖6。改變 pH 值的大小，即改變?nèi)芤褐袣潆x子濃度會影響蛋白酶作用的環(huán)境，進(jìn)而影響酶活性。從圖 6 中可以看出，隨著 pH 的變化，甘露低聚糖的濃度呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，當(dāng)pH值為 6.0時，甘露低聚糖的濃度最高。因此，選擇 pH 值6.0 為最適作用范圍。2.4 -甘露聚糖酶水解條件的優(yōu)化考慮到各因素的相互作用和相互制約導(dǎo)致對水解效果的影響，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)以確定各參數(shù)的最佳組合。按正交表 L16(45)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，以水解液中甘露低聚糖的濃度為測定指標(biāo)。擬定出實(shí)驗(yàn)方案(見表 1)來考察 5 個因素對 -甘露聚糖酶水解自制酵母細(xì)胞壁效果的影響。根據(jù)以上單因素水解條件，確定最佳水解條件的因素與水平，見表 1。采用 L16(45)表設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表 2。根據(jù)表 2 各因素的 k、R 的大小，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。從圖 7 可以判斷出，各因素對指標(biāo)影響的主次順序?yàn)榈孜餄舛燃用噶拷到鈺r間pH 值降解溫度，最優(yōu)組合是 A3B3C4D3E2。由此得出最佳條件為：加酶量為 55%，底物濃度為8%，水解時間為 4.5 h，水解溫度為 55 ，pH值為6.0。由于最優(yōu)組合并未出現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)中，所以需要對實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表 3。由驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)可知，最優(yōu)組合水解所得甘露低聚糖的濃度與正交實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的最高值接近，所4.704.404.1045 50 55 60 65水解溫度/甘露低聚糖的含量/(mg/mL)圖 4 水解溫度對 -甘露聚糖酶水解效果的影響3.803.603.403.203.005 6 7 8 9 10底物濃度/%甘露低聚糖的含量/(mg/mL)圖 5 底物濃度對 -甘露聚糖酶水解效果的影響4.604.203.803.403.005 6 7 8 9 10pH甘露低聚糖的含量/(mg/mL)圖 6 pH 值對 -甘露聚糖酶水解效果的影響表 1 因素與水平表1 45 6 3 45 52 50 7 3.5 50 63 55 8 4 55 74 60 9 4.5 60 8水平因素加酶量(v/v，%) A底物濃度(w/v，%) B降解時間/hC溫度/DpH 值E生物工程9FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食 品 科 技2009 年 第 34 卷 第 2 期表 2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)號因素甘露低聚糖的含量/(mg/mL)A B C D E1 1 1 1 1 1 3.502 1 2 2 2 2 4.243 1 3 3 3 3 4.754 1 4 4 4 4 4.165 2 1 2 3 4 3.816 2 2 1 4 3 4.027 2 3 4 1 2 4.838 2 4 3 2 1 4.179 3 1 3 4 2 4.1610 3 2 4 3 1 4.5711 3 3 1 2 4 4.8012 3 4 2 1 3 4.4313 4 1 4 2 3 3.9914 4 2 3 1 4 4.3315 4 3 2 4 1 4.6216 4 4 1 3 2 4.35k14.163 3.865 4.168 4.273 4.215k24.208 4.290 4.275 4.300 4.395k34.488 4.750 4.353 4.375 4.298k44.322 4.278 4.388 4.240 4.275R 0.325 0.885 0.220 0.135 0.180以選擇 A3B3C4D3E2為最終組合。3 結(jié)論研究 -甘露聚糖酶水解條件的優(yōu)化以水解產(chǎn)物中甘露低聚糖的濃度為指標(biāo)，研究單因素下加酶量、底物濃度、水解時間、溫度和 pH 對自制酵母細(xì)胞壁的水解效果，進(jìn)而通過正交實(shí)驗(yàn)得到最佳水解條件為：底物濃度為 8%，加酶量為 55%，水解時間為 4.5 h，水解溫度為 55 ，pH 值為6.0。目前報(bào)道的-甘露聚糖酶都是水解含有 -1,4-D-甘露糖苷鍵的魔芋粉、角豆角、瓜兒豆等植物原料，對于水解含有 -1,6-甘露聚糖的啤酒酵母細(xì)胞壁的研究還未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)室保藏的菌種發(fā)酵獲得的-甘露聚糖酶可以水解含有 -1,6-甘露聚糖的啤酒酵母細(xì)胞壁。本實(shí)驗(yàn)對影響-甘露聚糖酶水解效果的 5 個因素進(jìn)行研究并確定了最佳的水解條件，可以為甘露低聚糖的來源、啤酒發(fā)酵殘?jiān)挠行Ю煤蜏p少啤酒工業(yè)帶來的環(huán)境污染提供新的思路。參考文獻(xiàn)：1 Schombug D, M Salzmann. Eyzyme handbook. SpringerVerlag Berlin Heideberg,1991,(4):1-52 Akino T, Nakamura Nand Horikoshi K. Production of -mannosidase and -mannanase by an alkalopHilic Bacillussp. Appl Microbio Biotechnol,1987,26(4):323-3273 Kempf M, Theobald U, Fiedler HP. Influence of dissolvedO2on the fermentative production of gallidermin byStapHylococcus gallinarum. Biotechnol Lett,1997,19:1063-10674 Clarke J H, Davidson K, Rixon J E, et al. Hazlewood GPA comparison of enzyme-aided bleaching of softwood paper pulp using combinations of xylanase,mannanase andagalactosidase. Appl Microbiol Biotechnol,2000,53:661 -6675 Kansoh A L, Nagieb Z A. Xylanase and mannanase enzymes from St