生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室儀器的應(yīng)用與實(shí)驗(yàn)技術(shù).ppt

生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室儀器的應(yīng)用與實(shí)驗(yàn)技術(shù)theapplicationsandtechniquesofexperimentalequipmentsinbiology 張學(xué)琴生命科學(xué)大樓4027室tel 62732654 62734837email zhangxq711 1 本課程主要介紹生物學(xué)實(shí)驗(yàn)所用的常用儀器及其在生物研究中的應(yīng)用 主要包括 離心技術(shù) 超速和高速 光譜技術(shù) 紫外 原子 熒光 基因芯片技術(shù)顯微技術(shù) confocal etc 定量pcr技術(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)液質(zhì)聯(lián)儀 參考書(shū) 1 周先碗胡曉倩編生物化學(xué)儀器分析與實(shí)驗(yàn)技術(shù)化學(xué)工業(yè)出版社 第三版 2 王立汪正范牟世芬丁曉靜編著色譜分析樣品處理化學(xué)工業(yè)出版社3 師治賢王俊德編著生物大分子的液相色譜分離和制備科學(xué)出版社 第二版 4 5 結(jié)課方式 考試 50 課程論文 50 一 離心技術(shù)二 離心機(jī)的種類三 離心機(jī)和轉(zhuǎn)頭的維護(hù)四 離心機(jī)的事故五 離心技術(shù)在樣品制備中的作用 第一章離心技術(shù) 1 離心機(jī)發(fā)展歷史2 基本概念3 離心分離方法 一 離心技術(shù) 19世紀(jì)手搖離心機(jī)蜂蜜 牛奶20世紀(jì)超速離心機(jī)生物學(xué) 醫(yī)學(xué) 制藥工業(yè)等廣泛應(yīng)用 1 離心機(jī)發(fā)展歷史 1923年瑞典化學(xué)家svedberg第一臺(tái)具有光學(xué)系統(tǒng)的分析超速離心機(jī) 最高轉(zhuǎn)速達(dá)45 000rpm 1926年svedberg測(cè)定馬血紅蛋白分子量 首次證明蛋白質(zhì)為均一的生物大分子 1940年svedberg和同事pederson撰寫(xiě)世界上第一本有關(guān)離心技術(shù)的專著 超速離心技術(shù)發(fā)展階段 1951年brakkemk在差速離心的基礎(chǔ)上發(fā)展了速率區(qū)帶離心法 1955年andersonng發(fā)明了區(qū)帶轉(zhuǎn)頭 并用區(qū)帶離心法首次證明dna雙螺旋結(jié)構(gòu)半保留復(fù)制的假說(shuō) 離心機(jī)制造工藝 區(qū)帶轉(zhuǎn)頭 高強(qiáng)度的鈦合金的應(yīng)用 半導(dǎo)體集成電路 計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展 高頻調(diào)速電機(jī)的使用 1 基本概念 1 離心技術(shù) centrifugetechnique 利用物質(zhì)在離心力作用下 按其沉降系數(shù)不同而分離的一種技術(shù) gt g為重力加速度 980cm s2 物體在沉降過(guò)程中 其下沉的力在某個(gè)時(shí)刻總會(huì)與摩擦力 浮力達(dá)到平衡 使物體的受力為零 此時(shí)物體在做勻速運(yùn)動(dòng) 此時(shí)的速度稱為臨界速度 一個(gè)球型顆粒在具有重力場(chǎng)中的液體介質(zhì)內(nèi) 受到地球引力 溶液浮力和溶液黏滯力的作用 出現(xiàn)不同的運(yùn)動(dòng) 粘滯力和浮力向上 重力向下 重力fg 1 6 d3 pg d為顆粒直徑 為顆粒密度 g為重力加速度 3 顆粒在重力場(chǎng)的運(yùn)動(dòng) 粘滯力ff 3 dv v為顆粒沉降速度 浮力fb 1 6 d3 mg m為介質(zhì)密度 當(dāng)作用在顆粒上的總力為零時(shí) 顆粒做勻速運(yùn)動(dòng) 即達(dá)到臨界速度 作用力的關(guān)系式為 fg fb ff v d2 p m g 18 a 與顆粒直徑d2的大小成正比 顆粒大沉降快 b 與顆粒和介質(zhì)密度差 p m 成正比 密度之差越大 沉降越快 c 當(dāng) p m 顆粒沉降速度為正值 即顆粒在介質(zhì)中往下沉 等于 做不定向運(yùn)動(dòng) 小于 顆粒在介質(zhì)中上浮 v d2 p m g 18 d 與引力g成正比 速度隨著引力的增加而增加 e 與介質(zhì)粘度 成反比 速度隨粘度的增加而降低 4 顆粒在離心場(chǎng)中的沉降 5種力 離心力 向心力 重力 浮力 介質(zhì)摩擦力 從理論上講 只要顆粒的比重大于液體就會(huì)發(fā)生沉降 但是對(duì)于分離生物材料的樣品 如細(xì)胞 細(xì)胞器 細(xì)菌 病毒 蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子來(lái)說(shuō) 由于顆粒非常細(xì)小 依靠自然沉降是不能達(dá)到完全分離的 只能通過(guò)離心力的作用才能使它們沉降下來(lái) 離心力的產(chǎn)生 離心場(chǎng)的受力 g 2r 物體在圍繞轉(zhuǎn)軸以角速度旋轉(zhuǎn)時(shí) 就產(chǎn)生離心場(chǎng) 物體在離心場(chǎng)中受到離心力的作用 電機(jī)的速度以每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù) r min 表示 g 2r 4 2n2r 3600 n為每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù) 單位為r min g的單位是cm s2 正好與重力加速度g的單位一致 在實(shí)踐中 離心力可用重力加速度的倍數(shù)g g來(lái)表示 稱之為相對(duì)離心力 用rcf表示 可將公式寫(xiě)成 rcf g g 4 2n2r 3600 980 1 12 10 5n2rn 1000 rcf 11 2r 1 2 相對(duì)離心力 rcf 因此 超速離心常用重力加速度的倍數(shù) g 來(lái)代替轉(zhuǎn)速 r min 真正反映顆粒在離心管中所受到的離心力 一般 低速離心 轉(zhuǎn)速以r min表示 高速離心 轉(zhuǎn)速以重力加速度g表示 計(jì)算顆粒相對(duì)離心力時(shí) 應(yīng)注意離心管與中心軸間的距離 即離心半徑r的長(zhǎng)度 離心管所處的位置不同 沉降顆粒所承受的離心力也不同 沉降系數(shù) sedimentationcoefficient s 沉降系數(shù)是生物大分子的特征常數(shù) 與顆粒密度 形狀 大小 與介質(zhì)密度 粘度 與溫度 濃度都有關(guān)系 20 以水為介質(zhì)的條件下 測(cè)得s值為標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下的s值 1s 10 13秒 k因子 表示沉降系數(shù)為s的顆粒 在轉(zhuǎn)頭的最大速度下離心時(shí) 顆粒從小半徑沉降到大半徑所需要的時(shí)間 t k s表示從離心管表面沉降到離心管底所需要的時(shí)間 k是轉(zhuǎn)頭的實(shí)際參數(shù) 沉降與相關(guān)因素 t 1013 3600 lnrb lnrm 2srb 軸與離心管間距離rm 軸與管液面間距離 3 離心分離方法 沉淀離心差速離心速率區(qū)帶離心等密度離心淘洗離心連續(xù)流離心 1 沉淀離心常用方法 指介質(zhì)密度約1g ml 選用一種離心速度 使懸浮液中的懸浮顆粒在離心的作用下完全沉淀下來(lái) 這種離心方式稱沉淀離心 沉降速度與離心力和顆粒大小有關(guān) 顆粒沉降離心中的兩個(gè)因素 相對(duì)離心力 g 和時(shí)間 min 沉降某顆粒需10 000g min 凡是利用顆粒在離心場(chǎng)中的沉降系數(shù)差異進(jìn)行逐級(jí)分離的離心方法 稱差速離心 差速離心是建立在顆粒的大小 密度和形狀有明顯的不同 沉降存在較大的差異的基礎(chǔ)上進(jìn)行分離的方法 一般用于粗級(jí)分離 而不用于精細(xì)分離 2 差速分級(jí)離心 3 密度梯度離心凡使用密度梯度介質(zhì)離心的方法稱這密度梯度離心或稱區(qū)帶離心 分辨率比差速離心高 差速離心沉降系數(shù)相差10倍以上 密度梯度離心沉降系數(shù)相差10 20 s的顆?；蝾w?；蛎芏炔钚∮? 01g ml的組分 兩種類型 速率區(qū)帶離心 因顆粒的不同沉降速度而分層 可分離與密度介質(zhì)相當(dāng)?shù)募?xì)胞 細(xì)胞器 dna和蛋白質(zhì) 分離效果只與分離物質(zhì)的的大小有關(guān) 與介質(zhì)的密度無(wú)關(guān) 等密度區(qū)帶離心 因顆粒的不同密度而分層 在等密度介質(zhì)中的密度范圍正好包括所有分離顆粒的密度 樣品可以加在制成的梯度介質(zhì)的上面 也可以與密度介質(zhì)混合在一起 離心后會(huì)形成自成型梯度 顆粒在等密度梯度的介質(zhì)中 經(jīng)過(guò)離心 最終將停留在與其浮力密度相等的區(qū)域內(nèi) 形成一個(gè)區(qū)帶 顆粒密度和介質(zhì)密度達(dá)到平衡時(shí) 所形成的顆粒區(qū)帶就停止運(yùn)動(dòng) 延長(zhǎng)離心時(shí)間對(duì)離心效果無(wú)明顯影響 即此時(shí)與離心時(shí)間無(wú)關(guān) 密度梯度離心的制備 密度梯度溶液 不均一 密度隨著旋轉(zhuǎn)半徑的增加而增加 e g 5 1 018g ml 20 1 077g ml 蔗糖為梯度液 密度梯度材料 氯化鋰 氯化銫 氯化銣 酒石酸鉀 甘油 蔗糖和聚蔗糖等 不能與樣品發(fā)生化學(xué)反應(yīng)ph 滲透壓不能影響所用的測(cè)量技術(shù) e g 蛋白質(zhì) 280nm不能對(duì)轉(zhuǎn)頭有腐蝕 預(yù)成型梯度 線性梯度 不連續(xù)的階梯梯度 指數(shù)梯度自成型梯度 不連續(xù)梯度通過(guò)手工制作梯度界面不能破壞連續(xù)梯度 梯度混合器 用注射器將樣液加在梯度液上面樣品體積和濃度適量注意 離心管內(nèi)的梯度液可承受的樣品的最大濃度為該密度梯度液中最低密度梯度濃度的1 10 等密度加樣 樣液加在密度介質(zhì)的上面或與密度介質(zhì)混合在一起 不要污染樣品不要破壞梯度的穩(wěn)定性在操作過(guò)程中不能使氣泡進(jìn)入梯度中 手工回收 二 離心機(jī)的種類 1 按離心機(jī)的速度 1 低速離心機(jī)最大轉(zhuǎn)速 vmax 一般在6000r min 2 高速離心機(jī)vmax 25000r min 3 超速離心機(jī)vmax 100000r min 一 分類 2 按離心機(jī)的用途 1 小型離心機(jī)小量快速離心 2 制備型大容量低速離心機(jī)vmax 6000r min 最大離心力6000 g 最大容量達(dá)500ml 6 3 高速冷凍離心機(jī)vmax 18000 21000r min 最大離心力在50000 g 適用于細(xì)胞和亞細(xì)胞的分離 4 超速離心機(jī)最大離心力可達(dá)800000 g 可進(jìn)行小量制備 適用于蛋白質(zhì) 核酸和多糖等生物大分子的制備 5 分析型離心機(jī)用于生物大分子定性 定量分析 6 連續(xù)流離心機(jī)處理類似于發(fā)酵液等特大體積 濃度較稀的樣品 最大離心速度與高速離心機(jī)相似 3 按離心機(jī)的驅(qū)動(dòng)系統(tǒng) 1 空氣驅(qū)動(dòng)離心機(jī) 2 油渦輪驅(qū)動(dòng)離心機(jī) 3 電刷電機(jī)驅(qū)動(dòng)離心機(jī) 4 變頻電機(jī)驅(qū)動(dòng)離心機(jī) 二 基本結(jié)構(gòu) 真空系統(tǒng) 1 分類角轉(zhuǎn)頭適用于差速離心 等密度離心 容量大 轉(zhuǎn)頭內(nèi)容納的離心管多 水平轉(zhuǎn)頭離心管組裝在轉(zhuǎn)頭的吊桶內(nèi) 離心機(jī)靜止?fàn)顟B(tài)時(shí)離心管為垂直狀態(tài) 離心時(shí)離心管與軸垂直 適合于區(qū)帶離心和等密度離心 垂直轉(zhuǎn)頭適合于質(zhì)粒dna的純化 不適合于差速離心 近垂直轉(zhuǎn)頭對(duì)質(zhì)粒dna和rna的分離純化特別有效 區(qū)帶轉(zhuǎn)頭連續(xù)流轉(zhuǎn)頭 1 轉(zhuǎn)頭 2 性能鋁合金轉(zhuǎn)頭適合于ph6 8的中性溶液離心用中性溶液洗滌強(qiáng)度不高 易加工 易碰傷 高濃度鹽長(zhǎng)期接觸會(huì)產(chǎn)生內(nèi)結(jié)晶 影響轉(zhuǎn)頭的強(qiáng)度 溫度不得超過(guò)60 更不能用高溫滅菌處理價(jià)格便宜 使用壽命短 不銹鋼轉(zhuǎn)頭耐腐蝕 對(duì)酸 堿 鹽溶液均適宜 機(jī)械強(qiáng)度高 加工難 質(zhì)量大 離心速度不高 使用壽命長(zhǎng) 價(jià)格較便宜 鈦合金轉(zhuǎn)頭耐腐蝕 對(duì)酸 堿 ph3 5 11 溶液均適宜 機(jī)械強(qiáng)度高 加工難 質(zhì)量較大 離心速度高 使用壽命長(zhǎng) 價(jià)格較貴 碳素轉(zhuǎn)頭質(zhì)量輕 有利于提速 耐腐蝕 在偏酸性或偏堿性的溶液中均可使用 機(jī)械強(qiáng)度高 加工容易 使用壽命長(zhǎng) 價(jià)格昂貴 3 轉(zhuǎn)頭的主要參數(shù)最大轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)頭的抗拉強(qiáng)度是有限的 與轉(zhuǎn)頭的類型 構(gòu)造和材料有關(guān)最大離心力最大容量每個(gè)轉(zhuǎn)頭中容納離心管數(shù)乘以離心管的最大體積就是該轉(zhuǎn)頭的最大容量 k因子在最大的轉(zhuǎn)頭速度下 由最小半徑沉降到最大半徑所需要的時(shí)間 k越小 離心能力越大 三 離心機(jī)和轉(zhuǎn)頭 beckmanle 80k optimal系列 轉(zhuǎn)頭 sw28sw55ti90 超速離心機(jī) 植物生理學(xué)與生物化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室儀器室離心機(jī)有的關(guān)配置 落地式超速離心機(jī)2臺(tái)臺(tái)式超速離心機(jī)1 1臺(tái)落地式高速冷凍離心機(jī)2臺(tái)臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)1臺(tái) 超速轉(zhuǎn)頭 rotors 配置 sw2828 000rpm14 1000g sw5555 000rpm368 000g ti9090 000rpm695 000g 臺(tái)式超速離心機(jī) 高速離心機(jī) r22a222 000rpm51 200g50ml 6 300ml r12a312 000rpm23 800g300ml 6 1 800ml r10s10 000rpm16 470g50ml 4 200ml 三 離心機(jī)和轉(zhuǎn)頭的維護(hù) 1 離心機(jī)安全操作 不過(guò)速運(yùn)轉(zhuǎn)平衡運(yùn)轉(zhuǎn)準(zhǔn)確組裝轉(zhuǎn)頭不使用帶傷轉(zhuǎn)頭不使用過(guò)期轉(zhuǎn)頭 2 離心機(jī)的維護(hù)每次用畢 對(duì)于超速離心機(jī) 只需定期清潔離心機(jī)內(nèi)腔 對(duì)于高速離心機(jī) 每次必須將內(nèi)腔擦干 且不能長(zhǎng)期將轉(zhuǎn)頭置于轉(zhuǎn)軸上 以免傳感器受潮失靈 3 轉(zhuǎn)頭的維護(hù)離心機(jī)轉(zhuǎn)頭 如果忽視其設(shè)置的精密程度和嚴(yán)格的使用方法 就會(huì)大大影響它的奉命 事實(shí)上 一個(gè)轉(zhuǎn)頭在承受一百萬(wàn)倍的大氣壓下 一克就相當(dāng)于一噸的重量 若轉(zhuǎn)頭的表面有很細(xì)微的裂縫 對(duì)轉(zhuǎn)頭就會(huì)造成很大的影響 此影響可能會(huì)超過(guò)轉(zhuǎn)頭原本設(shè)置所能承受的范圍 1 維護(hù)轉(zhuǎn)頭壽命的三個(gè)因素 專門(mén)的設(shè)計(jì)和制造使用中的注意事項(xiàng)和合理的操作當(dāng)損壞或因疲勞連續(xù)使用而產(chǎn)生不安全時(shí) 轉(zhuǎn)頭必須停用 轉(zhuǎn)頭的設(shè)計(jì)與制造一般的生產(chǎn)廠家 在制造轉(zhuǎn)頭時(shí) 會(huì)進(jìn)行轉(zhuǎn)頭 馬達(dá)系統(tǒng)的震動(dòng)測(cè)試 它們會(huì)在一個(gè)特殊構(gòu)造的房間里進(jìn)行非破壞性和破壞性試驗(yàn) 來(lái)檢驗(yàn)轉(zhuǎn)頭的壽命 引起離心機(jī)轉(zhuǎn)頭損壞的原因金屬疲勞化學(xué)腐蝕應(yīng)力腐蝕 金屬疲勞轉(zhuǎn)子在加速過(guò)程中 材料內(nèi)部多次重復(fù)受到拉伸或松馳的交變引力的作用 引起材料結(jié)構(gòu)細(xì)微變化 經(jīng)過(guò)一定次數(shù)的交變引力循環(huán) 這些細(xì)微變化導(dǎo)致極細(xì)微的裂紋 化學(xué)腐蝕由于所用的離心管不能承受介質(zhì)的性質(zhì) 或者離心管存放太久 老化后受不了強(qiáng)離心力的緣故 會(huì)造成離心管的破裂 樣品滲漏到轉(zhuǎn)頭內(nèi) 若沒(méi)按規(guī)定程序操作 造成轉(zhuǎn)頭不密封 當(dāng)抽真空時(shí) 轉(zhuǎn)頭內(nèi)腔產(chǎn)生負(fù)壓 也會(huì)樣品滲漏 對(duì)轉(zhuǎn)頭產(chǎn)生化學(xué)腐蝕而嚴(yán)重影響轉(zhuǎn)頭的壽命 應(yīng)力腐蝕應(yīng)力腐蝕是金屬疲勞和化學(xué)腐蝕兩者同時(shí)作用產(chǎn)生的結(jié)果 當(dāng)轉(zhuǎn)頭某部分因受化學(xué)腐蝕或破損后 該部分所承受的引力增大了 此種情況下 轉(zhuǎn)頭便會(huì)很容易毀壞 2 轉(zhuǎn)頭操作的注意事項(xiàng)避免cscl結(jié)晶cscl溫度過(guò)低產(chǎn)生結(jié)晶 沉降就會(huì)脹破離心管 從而損壞轉(zhuǎn)頭 轉(zhuǎn)頭需加蓋由于疏忽大意 勿將轉(zhuǎn)頭蓋蓋緊 或忘記加蓋 當(dāng)轉(zhuǎn)頭運(yùn)行時(shí) 離心腔內(nèi)會(huì)產(chǎn)生空氣旋渦使轉(zhuǎn)頭浮起 轉(zhuǎn)頭離開(kāi)轉(zhuǎn)軸而發(fā)生意外 因此在儀器啟動(dòng)時(shí) 應(yīng)再檢查轉(zhuǎn)頭蓋是否已蓋緊 注意溶液密度對(duì)轉(zhuǎn)頭速度的限額溶液密度大小對(duì)轉(zhuǎn)頭強(qiáng)度受力有很大關(guān)系 在進(jìn)行密度梯度或等密度離心時(shí) 配置的介質(zhì)密度必須低于說(shuō)明書(shū)中標(biāo)記的轉(zhuǎn)頭所能承受的最大密度 若高于該密度 可用下列公式計(jì)算最大速度 當(dāng)采用塑料管戴硬鋁帽 樣品比重大于1 2 新的最大速度 轉(zhuǎn)子最大轉(zhuǎn)速 1 2 新的密度 1 2當(dāng)采用不銹鋼管戴硬鋁帽 樣品比重小于1 2 最大允許轉(zhuǎn)速必須減少設(shè)定速度的15 即最大允許速度 最大設(shè)定轉(zhuǎn)速 1 15 當(dāng)采用不銹鋼管及管帽 樣品比重小于1 2時(shí) 最大設(shè)定轉(zhuǎn)速必須減少25 3 轉(zhuǎn)頭的保養(yǎng)轉(zhuǎn)頭的清潔所有的轉(zhuǎn)頭使用后必須用溫水洗滌并干燥 如果必須使用去污劑 則不應(yīng)使用堿性去污劑 轉(zhuǎn)頭干燥 涂油保養(yǎng)嚴(yán)禁將轉(zhuǎn)頭浸泡在去污劑中 沖凈后的轉(zhuǎn)頭必須干燥 通常在室溫下將轉(zhuǎn)頭倒置自然干燥 轉(zhuǎn)頭外表可稍涂些硅脂保護(hù)表面 轉(zhuǎn)頭內(nèi)壁腔可涂上硅油保護(hù) 密封圈轉(zhuǎn)頭蓋與吊桶內(nèi)壁的密封圈可使轉(zhuǎn)頭和離心管在密封的情況下運(yùn)行 如果密封圈老化 轉(zhuǎn)頭內(nèi)便因離心腔抽真空而形負(fù)壓 使離心管破裂或滲漏損壞轉(zhuǎn)頭 因此 密封圈如有損壞 應(yīng)及時(shí)更換 更換前應(yīng)涂上真空脂 加強(qiáng)保護(hù) 超速盤(pán)的更換為了保證轉(zhuǎn)子的正常運(yùn)行 使用前必須檢測(cè)超速盤(pán)有否磨損 轉(zhuǎn)子使用后 將轉(zhuǎn)子清洗倒放在實(shí)驗(yàn)桌上 當(dāng)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)子底部的超速盤(pán)損壞或磨損 必須立即更換 首先將損壞的超速盤(pán)取下 然后用四氯化碳有機(jī)溶劑清洗干凈 再將備用的超速盤(pán)換上 轉(zhuǎn)頭壽命的折算一般是最大轉(zhuǎn)速的次數(shù) 若轉(zhuǎn)頭動(dòng)作已超過(guò)其壽命保證期 在沒(méi)有任何損傷的情況下 轉(zhuǎn)頭應(yīng)按90 折算后再繼續(xù)使用 四 離心機(jī)的事故 正在旋轉(zhuǎn) 后果 五 離心技術(shù)在樣品制備中的作用 分離活體生物 細(xì)胞 微生物 病毒細(xì)胞器 細(xì)胞核 細(xì)胞膜 線粒體生物大分子 核酸 蛋白質(zhì) 酶 多聚物 植物細(xì)胞膜