【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）Asia-Ⅰ型口蹄疫病毒P1-2A和3CD基因及IL-18基因重組腺病毒載體的構(gòu)建預(yù)防獸醫(yī)學(xué)碩士論文

I 密級(jí) ： 論文編號(hào)： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩士學(xué)位論文 型口蹄疫病毒 3因 及因重組腺病毒 載體 的構(gòu)建 1 1文縮略詞 英文縮寫 英文名稱 中文名稱 性磷酸酶 芐青霉素 禽成髓細(xì)胞瘤病毒 鼠腎細(xì)胞系 bp 堿基對(duì) 牛血清白蛋白 互補(bǔ) 細(xì)胞病變效應(yīng) d 天 碳酸二乙酯 脫氧核糖核酸 氧核糖核苷三磷酸 硫蘇糖醇 溴化乙錠 二胺四乙酸 聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 口蹄疫 口蹄疫病毒 h 小時(shí) 根過氧化物酶 0% 半數(shù)感染量 免疫球蛋白 G 異丙基硫代 卡那霉素 堿基 道爾頓 養(yǎng)基 毫升 子量 苷酸 光密度 放閱讀框架 丙烯酰胺凝膠電泳 酸鹽緩沖液 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) pH pH 核糖核酸 核糖核酸酶 核糖核酸酶抑制劑 分鐘轉(zhuǎn)速 轉(zhuǎn)錄 二烷基硫酸鈉 0% 數(shù)組織培養(yǎng)感染量 沖液 三羥甲基氨基甲烷 U 位 微升 非翻譯區(qū) 5 543 要 口蹄疫（ 世界性重大 動(dòng)物 疫病之一，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織和我國政府列為 A 類和一類傳染病之首。為了給 防控 提供更安全 、 高效的防控產(chǎn)品，本研究通過細(xì)菌內(nèi)同源重組法將 13因以及白介素基因（ 復(fù)制缺陷型人 5 型腺病毒載體重組，成功構(gòu)建了重組腺病毒載體。為 口蹄疫病毒腺病 毒活載體疫苗的研究 積累了基礎(chǔ)數(shù)據(jù) 。 1）克隆了 口蹄疫病毒 3因。 序列測(cè)定表明： 2247碼749 個(gè)氨基酸； 3 2052括終止子 編碼 683 個(gè)氨基酸。經(jīng)與其它 毒株與 云南寶山毒株 的序列同源性相對(duì)較高， 因 核苷酸 序列 同源性分別為 與 株屬于同一基因亞型。 2） 將目的基因 和 穿梭載體用相應(yīng)的內(nèi)切酶 酶切后 連接，將陽性的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒用 酶切線性化后與腺病毒骨架載體在 胞中進(jìn)行同源重組，將鑒定為陽性的重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 用于轉(zhuǎn)化 293 細(xì)胞包裝成熟重組腺病毒。 正確的重組有二種方式即左右臂之間同源重組和起始點(diǎn)與右臂同源重組 ， 酶切可以切出 35 大片段和 b 小片段。本實(shí)驗(yàn)中切出 35 條帶，為起始點(diǎn)與右臂同源重組。 3） 用 線性化的重組腺病毒轉(zhuǎn)染 293 細(xì)胞，獲得基因組結(jié)構(gòu)均一的重組腺病毒。 將鑒定陽性的重組腺病毒 質(zhì)粒 用 93細(xì)胞， 7天左右包裝成成熟的重組腺病毒。用此重組腺病毒再次感染 293 細(xì)胞， 2后可見細(xì)胞病變（ 病變細(xì)胞漲大變圓、聚集，產(chǎn)生典型的腺病毒葡萄樣病變。測(cè)定第 10 代 重組腺病毒的 毒價(jià)為 ）將重組腺病毒在豚鼠中進(jìn)行 了 初步 免疫 效力試驗(yàn)。 將傳代穩(wěn)定，毒價(jià)高的重組腺病毒處理后用于免疫 豚鼠，定期采血，用 間接 測(cè)定血清抗體，結(jié)果表明在豚鼠體內(nèi)有 體產(chǎn)生，但滴度不是很高， 用同型口蹄疫病毒攻擊作保護(hù)性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果 重組腺病毒免疫組的 3 只豚鼠中有 2 只得到了完全保護(hù)。 關(guān)鍵詞 ： 口蹄疫 ，口蹄疫病毒 ， 白介素 病毒載體，同源重組，疫苗 V is of a It is as by IE we a CD MD as 1) We 1CD we 1247 49 3CD 052bp 83 we a to 2） we On of we we we is NA by a is it is in 3) d NA is to , to in PE be PE 4of A be 0th 4) we we to we to by we of 錄 第一章 序言 . 1 研究背景 . 1 蹄疫與口蹄疫病毒 . 1 口蹄疫疫苗的研究概況 . 1 腺病毒載體發(fā)展與應(yīng)用 . 5 生物活性 . 6 研究的目的、意義 . 6 研究內(nèi)容 . 6 第二章 1 3因的克隆 . 7 材料和方法 . 7 病毒樣品 . 7 質(zhì)粒和菌株 . 7 主要試劑 . 7 主要儀器 . 8 1 粒的構(gòu)建 . 8 果與分析 . 12 物的電泳結(jié)果 . 12 重組質(zhì)粒的 酶切鑒定結(jié)果 . 12 重組質(zhì)粒的序列分析 . 13 討論 . 13 第三章 組腺病毒載體的構(gòu)建 . 14 材料和方法 . 14 質(zhì)粒和菌株 . 14 工具酶和其它試劑盒 . 14 儀器與設(shè)備 . 14 重組腺病毒穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建 . 15 重組腺病毒穿梭載體與腺病毒骨架載體的同源重組 . 18 結(jié)果 . 19 重組穿梭載體的 定 . 19 重組穿梭載體的酶切鑒定 . 19 重組腺病毒的 定 . 20 重組腺病毒的酶切鑒定 . 20 重組腺病毒的 測(cè)序 鑒定 . 21 討論 . 22 第四章 轉(zhuǎn)染 293 細(xì)胞包裝腺病毒 . 23 材料 . 23 細(xì)胞 . 23 試劑 . 23 培養(yǎng)液 . 23 方法 . 23 293 細(xì)胞的培養(yǎng) . 23 脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染 . 24 重組病毒的傳代 . 24 測(cè)重組腺病毒 . 24 重組腺病毒的穩(wěn)定性和滴度測(cè)定 . 24 結(jié)果 . 25 重組腺病毒轉(zhuǎn)染的結(jié)果 . 25 測(cè)重組腺病毒 . 25 重組腺病毒的穩(wěn)定性和滴度測(cè)定 . 25 討論 . 26 第五章 重組腺病毒的豚鼠免疫試驗(yàn) . 27 材料與方法 . 27 驗(yàn)動(dòng)物及 分組 . 27 組腺病毒疫苗及滅活苗 . 27 毒用毒株 . 27 鼠免疫 . 27 清抗體的監(jiān)測(cè) . 27 毒試驗(yàn) . 27 果與分析 . 28 接 測(cè)定血清抗體 . 28 鼠免疫試驗(yàn) . 28 論 . 29 第六章 全文結(jié)論 . 30 參考文獻(xiàn) . 31 附錄 . 31 致謝 . 48 作者簡歷 . 49 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 序言 1 第一章 序言 研究背景 蹄疫與口蹄疫病毒 口蹄疫（ 由口蹄疫病毒（ 起的牛、豬、羊等偶蹄動(dòng)物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。它不僅可使動(dòng)物生產(chǎn)性能下降，造成巨大的直 接經(jīng)濟(jì)損失，而且還限制動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品的國際貿(mào)易，因此所造成的間接損失更大，同時(shí)還會(huì)影響一個(gè)國家的國際形象，素有 政治經(jīng)濟(jì)病 之稱，被 為 16 種 A 類動(dòng)物疫病的第一位。目前，國際上防控口蹄疫的模式主要有兩種：經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)的國家大多采用以撲殺為主的根除措施，發(fā)展中國家則均采取免疫接種與撲殺相結(jié)合，再輔以封鎖、隔離、消毒、疫苗檢測(cè)等綜合措施。在口蹄疫疫苗的研發(fā)歷程中，傳統(tǒng)的滅活疫苗在口蹄疫的防控中發(fā)揮了巨大的作用，目前也是國內(nèi)外防控口蹄疫的主要措施之一。但傳統(tǒng)的病毒滅活疫苗存在很多缺點(diǎn)：如熱不穩(wěn)定性，免疫持續(xù)期短 等，一個(gè)特別嚴(yán)重的問題是，歐洲幾次 爆發(fā)就是由于病毒滅活不完全或是由于活病毒從生產(chǎn)場(chǎng)地逃逸而造成的。因此，已經(jīng)消滅了疫情的發(fā)達(dá)國家已限制使用滅活苗來預(yù)防、控制口蹄疫。因此，生產(chǎn)一種可產(chǎn)生與滅活苗具有相似的免疫保護(hù)性，且更加安全可靠的新型疫苗是人們共同的期望。 近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展， 因工程疫苗不斷涌現(xiàn)，如亞單位疫苗、合成 肽疫苗、蛋白質(zhì)載體疫苗、基因缺失疫苗、活載體疫苗、核酸疫苗等。這些疫苗安全性好、生產(chǎn)成本低，而且可以根據(jù)需要制備同一病毒多個(gè)成分或多價(jià)病毒疫苗，因此具有廣闊的發(fā)展前景 。特別是活載體疫苗具有較多優(yōu)勢(shì)，如免疫劑量較小，可在宿主體內(nèi)復(fù)制并長期存在，可持續(xù)刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)抗體，大大延長免疫期限等。另外，活載體疫苗是將抗原蛋白的基因整合入載體基因組中改造成的，因此不存在散毒的危險(xiǎn)。 口蹄疫病毒（ 于小 毒科，口蹄疫病毒屬，該病毒有七個(gè)血清型，各型之間無交叉保護(hù)反應(yīng)。 因組 長約 8500次為 5 3成，其中 5約 1300有 級(jí)結(jié)構(gòu)、 C）區(qū)段和內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)等； 6500 L 基因、 構(gòu)蛋白基因、 結(jié)構(gòu)蛋白基因以及起始密碼子和終止密碼子組成，其中 構(gòu)蛋白基因編碼 4 種主要的衣殼蛋白，既 成衣殼蛋白亞單位， 于病毒顆粒內(nèi)部； 3約 172 A）以及A）和 之間的堿基組成。 口蹄疫 新型 疫苗的研究概況 1）亞單位疫苗 亞單位疫苗是將編碼病原微生物的抗原基因?qū)胧荏w菌或細(xì)胞，使其在受體中高效表達(dá)保護(hù)性中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 序言 2 抗原，以此抗原蛋白 制成的一類疫苗。由于亞單位疫苗只含有病原體的一部分，不會(huì)引起病原體所導(dǎo)致的動(dòng)物發(fā)病，在安全性方面大大提高。早在 1979 年，研究者就發(fā)現(xiàn)抗空衣殼血清與抗病毒血清在中和試驗(yàn)中有相同的血清型特異性，而且 衣殼在豚鼠體內(nèi)的免疫原性與完整病毒粒子相同。這說明病毒衣殼蛋白能夠作為保護(hù)性抗原誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。據(jù)此，美國的 于 1981年首次克隆了 因，將其插入到原核表達(dá)載體 動(dòng)子的下游，實(shí)現(xiàn) 因的原核表達(dá)，并通過間接 放射免疫試驗(yàn)證實(shí)了其表達(dá)產(chǎn)物具有抗原性，從而為 因工程亞單位疫苗的研制提供了理論依據(jù)。隨后各國研究者相繼研制口蹄疫亞單位疫苗。從而開創(chuàng)了研制新型疫苗的嶄新階段?？谔阋邅唵挝灰呙缃?jīng)歷了一個(gè)從原核表達(dá)系統(tǒng)到真核表達(dá)系統(tǒng)的發(fā)展過程。最初，研究者們主要把注意力集中在 白的主要抗原位點(diǎn)上，后來發(fā)現(xiàn) 白碳末端的基因帶有其主要抗原位點(diǎn)、受體結(jié)合位點(diǎn)及型特異性序列。將連接有 因的、能夠快速產(chǎn)生不同嵌合蛋白的酵母表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染酵母后發(fā)現(xiàn) 原表位能夠在細(xì)胞表面提取，將此表達(dá)蛋白單劑量注入豚鼠后可誘導(dǎo)有效的中和抗體。利用包含有 構(gòu)蛋 白前體基因或 3C 基因的表達(dá)載體，使其分別在大腸桿菌和 蟲細(xì)胞中表達(dá)，它們表達(dá)的 白都能與同一特異單抗反應(yīng)，但只有在昆蟲中表達(dá)的 刺激豚鼠產(chǎn)生中和單抗。但由于昆蟲細(xì)胞對(duì)溶液中存在的大量的蛋白比較敏感 ;需要高溶氧量維持生長；機(jī)械攪拌合氣體沖擊對(duì)細(xì)胞的損傷較大等缺點(diǎn)，限制了其工業(yè)化生產(chǎn)。 2）基因缺失疫苗 運(yùn)用基因工程手段克隆 長 建感染性克隆，在 平上通過缺失與病毒力相關(guān)的基因，減弱其毒力但不喪失其免疫原性。基因缺失疫苗以其安全、毒力不易反強(qiáng)、可誘導(dǎo)對(duì)病毒多種抗原 的免疫應(yīng)答、免疫力堅(jiān)實(shí)、免疫期長等優(yōu)點(diǎn)，受到許多研究者的青睞，而且研究證實(shí)，在使用基因缺失疫苗的同時(shí)，可以將缺失基因的表達(dá)產(chǎn)物制備成診斷試劑，從而把自然感染合疫苗免疫區(qū)分開。 毒同屬小 毒，人們已通過 組技術(shù)，將 C）片段縮短，構(gòu)成突變體，這種突變體對(duì)小鼠無害，而且在小鼠體內(nèi)能產(chǎn)生高水平的抗體，保護(hù)小鼠免受強(qiáng)毒的攻擊，因而研究人員試圖借鑒 毒的經(jīng)驗(yàn)，將 C）片段縮短，雖然縮短了 C）片段的 變體的毒力沒有減弱 ，但這給人們某種啟發(fā)，對(duì) 因組特定位點(diǎn)的缺失，極有可能構(gòu)建 毒株。 X 射線晶體分析發(fā)現(xiàn)， 有一定立體構(gòu)象，其表面由 成，在 一個(gè)高度可變區(qū)域內(nèi)，有一高度保守的 環(huán)狀（ ）氨基酸序列暴露于病毒粒子的表面，其中包含精氨酸 天門冬氨酸（ 列，構(gòu)成病毒的細(xì)胞吸附位點(diǎn)。 人研究 因片段的主要抗原位點(diǎn) 合成肽晶體結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn)，針對(duì) 抗可以產(chǎn)生一定程序的病毒凝集和很強(qiáng)的抑制病毒與細(xì)胞吸附作用。 也發(fā)現(xiàn)含有 列的感染性的 隆，制備 失或突變的病毒粒子就成為可能。 過取代病毒 列內(nèi)的氨基酸構(gòu)建 變株，使病毒不能吸附和感染細(xì)胞。以上的研究均證實(shí) 列是病毒吸附宿主細(xì)胞所必需的， 用 列取代野生型 碼序列，構(gòu)建了 失病毒。這種缺失 列的病毒粒子不吸附和感染細(xì)胞。利用該缺失病毒進(jìn)行小鼠和豬的動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，野生型病毒對(duì)照組出現(xiàn)典型的 狀，試驗(yàn)組無任何癥狀。通過免疫沉淀監(jiān)測(cè)了這些動(dòng)物在接種 28d 后的 血樣，其中對(duì)照組顯示很強(qiáng)的結(jié)構(gòu)蛋白活性，沒有測(cè)到非結(jié)構(gòu)蛋白活性，證明了野生病毒在動(dòng)物中能復(fù)制，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 序言 3 而所構(gòu)建的病毒不能復(fù)制。用海福特牛對(duì)這種病毒所做的油苗作比較，證明在產(chǎn)生血清中和抗體、刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答、動(dòng)物保護(hù)等方面與滅活疫苗一致，有些優(yōu)于滅活疫苗。 3）核酸疫苗 核酸疫苗又稱基因疫苗，是將編碼病原體免疫保護(hù)性抗原蛋白基因置于真表達(dá)元件的控制下，并將其導(dǎo)入動(dòng)物機(jī)體內(nèi)，通過宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成抗原蛋白，從而誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對(duì)抗原蛋白的免疫應(yīng)答。最早有關(guān)核酸疫苗的研究是 1990 年將質(zhì)粒接種小鼠肌肉開始 的。最初構(gòu)建的口蹄疫核酸疫苗是一個(gè)包含有 長的基因組的質(zhì)粒。但由于全長基因有一定的危險(xiǎn)性，以后的研究者們開始著力于只表達(dá) 原表位的核酸疫苗的研究，但研究發(fā)現(xiàn)病毒表位誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)較弱而且持續(xù)時(shí)間短，因此，研究者們開始嘗試將衣殼蛋白編碼區(qū)于一些非編碼區(qū)基因共同構(gòu)建于同一載體中，以圖誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫反應(yīng)。 整的結(jié)構(gòu)基因 非結(jié)構(gòu)基因 2A、 3聯(lián)起來，同時(shí)加入腦心肌炎病毒（ 部核糖體進(jìn)入 (并通過免疫熒光和免疫斑點(diǎn)技術(shù)檢 測(cè)到豬皮膚中，部分豬獲得抵抗 毒的攻擊。 了克服亞單位疫苗不能產(chǎn)生持久的免疫保護(hù)，通過基因免疫和亞單位疫苗聯(lián)合免疫來增強(qiáng)其免疫效果，首先用含有 要免疫原性 質(zhì)粒免疫鼠，接下來 肽偶合物（ 激，免疫的鼠產(chǎn)生高效價(jià)的抗體，并具有中和 性。 （ 2001）構(gòu)建了一個(gè)含有 13C， 3D 的質(zhì)粒 此質(zhì)粒免疫豬后同時(shí)出現(xiàn)了抗 3續(xù)三次免疫后，動(dòng)物體內(nèi)可檢測(cè)到中和抗體，且這些動(dòng)物能夠免受病毒攻擊。 除此之外，許多研究者還致力于核酸疫苗和共刺激因子協(xié)同作用的研究，如 （ 2001）構(gòu)建了一株編碼 個(gè)抗原表位和宿主免疫球蛋白恒定區(qū)的質(zhì)粒 果很好。 4）合成肽苗 合成肽苗即用根據(jù)免疫抗原表位的氨基酸序列合成的抗原決定基小肽制作的疫苗。一般是從蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)并結(jié)合單克隆抗體的分析，推導(dǎo)出蛋白質(zhì)免疫主要抗原表位的氨基酸順序，然后合成或基因工程表達(dá)這一段肽作為抗原。 合成 毒 41 200段氨基酸組成的 40 個(gè)氨基酸肽（半胱氨酸 酸 脯氨酸 141半胱氨酸 在其中間加上兩個(gè)脯氨酸和一個(gè)絲氨酸，使多肽折成立體構(gòu)型，達(dá)到提高了單段肽（ 141半胱氨酸 豚鼠中的應(yīng)答水平，并提出了 胱氨酸 提高保護(hù)應(yīng)答的重要性。 用化學(xué)法合成了 因編碼的 14000肽段基因片段，并在大腸桿菌體內(nèi)得到了表達(dá)，用其免疫牛、豬等都獲得了較好的免疫力。 別用 A、 O、 C 血清型 列的 141 200段組成的 40 個(gè) 成肽，用牛和豚鼠進(jìn)行了試驗(yàn)，結(jié)果每個(gè)肽都產(chǎn)生了特異性高水平抗病毒中和抗體，在豚鼠中 O、A 型肽可抗各自病毒的攻擊并獲得完全保護(hù)， C 型較差。 5）蛋白質(zhì)載體疫苗 細(xì)胞內(nèi)增殖，其免疫應(yīng)答依賴于 T 細(xì)胞，因而細(xì)胞因子免疫性在抗病毒防御方面起著特別重要的作用。鑒于此，人們利用載體基因蛋白或類病毒粒子的抗原提呈作用，刺激 T 細(xì)胞，增殖機(jī)體細(xì)胞免疫反應(yīng)。 據(jù) 1 型 基酸序列，化合合成 140氨基酸肽與載體蛋白偶聯(lián)，能誘導(dǎo)保護(hù)豚鼠 的中和抗體。 半乳糖苷酶 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 序言 4 因的 B 細(xì)胞和 T 細(xì)胞抗原表位單拷貝或多拷貝分子，用表達(dá)的融合蛋白接種豚鼠，能誘導(dǎo)高水平的中和抗體，刺激 T 細(xì)胞，產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答，抵抗強(qiáng)毒的攻擊。同年 用乙型肝炎病毒核心蛋白能自我包裝成類病毒粒子，將 B 細(xì)胞和 T 細(xì)胞抗原表位連接到其蛋白的 在痘病毒中表達(dá)，其表達(dá)的融合 N 蛋白在豚鼠和豬中都可誘導(dǎo)高水平的中和抗體。 141 200聯(lián)起來與豬 重鏈基因的末端融合， 用其表達(dá)產(chǎn)物免疫的豬，可以抵抗 50 攻擊。由于蛋白質(zhì)載體疫苗安全性高，免疫原性好，故具有誘人的應(yīng)用潛力。 6）病毒活載體疫苗 利用基因操作技術(shù)將 保護(hù)性基因（ 入到另一種病毒基因組中的某些部位，使之高效表達(dá)重組蛋白。由于外源性基因 成為載體的一部分，并隨著載體病毒增殖而不停地表達(dá)，因而這種活載體疫苗在機(jī)體不但不能產(chǎn)生針對(duì)載體的抗體，而且可以產(chǎn)生針對(duì)抗體，從而達(dá)到 一針防兩病 的目的。另外，針對(duì) 血清型，而且型間無交叉保護(hù)作用，因而可將不同型 因插入到同一病毒活載體中，從而組成多價(jià)基因工程疫苗來預(yù)防、控制 其他相關(guān)疾病。 許多研究者試圖利用不同活載體病毒的優(yōu)勢(shì)，研制有利于口蹄疫防制的新型疫苗。目前用于活載體疫苗中的活載體病毒有痘苗病毒，人的腺病毒，皰疹病毒，傳染性牛鼻氣管炎病毒。其中人的腺病毒是表達(dá)外源基因常用的載體，它可表達(dá)和提取外源蛋白，并能刺激有效的體液免疫和細(xì)胞免疫；外源基因的表達(dá)量較高；病毒的基因組以附著體的形式存在幾個(gè)月，在此期間插入的外源基因可以很好的表達(dá)，從而達(dá)到免疫時(shí)間長的效果；腺病毒也可誘發(fā)粘膜免疫 ，從而阻礙病毒在家畜的呼吸道的復(fù)制，因此可通過粘膜來獲得免疫保護(hù)。復(fù)制缺陷型的腺病毒不可能在動(dòng)物個(gè)體間傳播，從而保證不會(huì)出現(xiàn)傳統(tǒng)疫苗存在的安全隱患。作為真核基因調(diào)控研究的模式系統(tǒng)之一，人類對(duì)腺病毒在分子水平上已有相當(dāng)?shù)恼J(rèn)識(shí)；腺病毒又中等大小的基因組。適合用最少的病毒序列構(gòu)建高容量載體；腺病毒可感染的宿主細(xì)胞廣泛，并可感染非復(fù)制細(xì)胞；腺病毒相對(duì)穩(wěn)定且易達(dá)到很高的滴度；在 苗研究中 將 構(gòu)蛋白 因插入人的 復(fù)制缺陷型腺病毒，將此種疫苗對(duì)牛進(jìn)行兩次免疫，取得部分保護(hù)， 但未檢測(cè)到中和抗體的產(chǎn)生。 將流行毒株 A(12)構(gòu)基因和實(shí)驗(yàn)室毒株 A(24)3C 非結(jié)構(gòu)基因同時(shí)插入腺病毒載體，通過在哺乳動(dòng)物細(xì)胞種實(shí)現(xiàn)了同源重組從而獲得重組體。一次免疫動(dòng)物，免疫后 7、 14 和 42d 進(jìn)行攻毒，檢測(cè)到了中和抗體的產(chǎn)生并獲得了全保護(hù)率。 （ 1999）構(gòu)建了含有 殼蛋白和 3C 蛋白酶編碼區(qū)的復(fù)制缺陷型 5 型腺病毒載體。分離了兩個(gè)克隆一個(gè)是 有野生型 3C 蛋白酶編碼區(qū)。此酶能將衣殼多聚蛋白前體加工成成熟的衣殼蛋白，另一種是 有一個(gè)點(diǎn)突變的 3C 蛋白酶編碼區(qū)，可抑制前體蛋白的加工，用這兩種病毒感染 293 細(xì)胞，都合成了 殼多聚蛋白前體，但只在 3染細(xì)胞中蛋白前體才被加工成結(jié)構(gòu)蛋白，只有 生了中和抗體反應(yīng)。加強(qiáng)免疫接種后可部分或完全保護(hù)病毒攻擊。 構(gòu)建表達(dá) 因的重組痘病毒，用該重組病毒接種豚鼠，產(chǎn)生針對(duì) B 細(xì)胞和 T 細(xì)胞的免疫反應(yīng)， 2000 年， 構(gòu)建了表達(dá)3 5 毒株的 因重組痘病毒，用該重組 痘病毒接種 c 小鼠，用 測(cè)出高效價(jià)的抗 體，同時(shí)能保護(hù)同源病毒強(qiáng)毒的攻擊；偽狂犬病病毒與牛傳染性鼻氣管炎病毒屬于皰疹病毒，基因組約 150有許多病毒增殖和復(fù)制所非必需的基因，能容納的外源基因中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 序言 5 多，是一種很好的病毒載體。 成功地將豬瘟病毒膜蛋白 因插入 因中得到表達(dá)，制成的疫苗使免疫豬獲得了較好的免疫力，并可抵抗 毒和豬瘟 強(qiáng)毒 的攻擊。 雖然，在新型疫苗的研究上有了很大的進(jìn)展，但應(yīng)用到實(shí)際中還需作很多的工作，希望一種高效、安全、低廉的新疫苗早日能 應(yīng)用到口蹄疫的防治中。 腺病毒載體 的 發(fā)展與應(yīng)用 迄今腺病毒載體已發(fā)展到了第三代。第一代腺病毒載體，去除了 3 基因表達(dá)盒，可以插入長達(dá) 6.5 外源 除 后的腺病毒復(fù)制缺陷，阻止了依賴 和 功能蛋白的轉(zhuǎn)錄與隨后病毒 復(fù)制及病毒外殼蛋白的產(chǎn)生。 缺失的腺病毒 只能 在 反式提供 基因蛋白的細(xì)胞中 增殖，如需繁殖就必須依賴包裝細(xì)胞系，目前己建立的腺病毒包裝細(xì)胞系 有胞， 911 細(xì)胞， 胞。 不是病毒復(fù)制必須區(qū)，所以 的 去除 對(duì)病毒載體轉(zhuǎn) 染基本無影響 ，但卻加大了插入外源基因的容量。 在基因轉(zhuǎn)染時(shí)去除了的 將由帶有增強(qiáng)子和啟動(dòng)子的外源基因代替。第二代腺病毒載體是在 失的基礎(chǔ)上進(jìn)一步去除了 和 (或 )，減弱病毒蛋白的表達(dá)。第一代和第二代腺病毒載體的 缺失增強(qiáng)了病毒 復(fù)制、晚期結(jié)構(gòu)蛋白的合成和可復(fù)制腺病毒 （ 的產(chǎn)生，在使用時(shí)會(huì)產(chǎn)生針對(duì)病毒包殼和轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物的免疫反應(yīng)，基因表達(dá)受到抑制，表現(xiàn)為感染組織的炎癥反應(yīng)和外源基因表達(dá)消失 ， 在二次應(yīng)用 時(shí)，強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)會(huì)使外源基因的表達(dá)迅速消失。這使腺病毒的應(yīng)用受到很大的限制。更為 復(fù)雜 的腺病毒載體就是第三代腺病毒載體 ,在其構(gòu)建時(shí)去除了某些病毒基因 ， 甚至是去除了全部的病毒基因 ， 所謂的 空殼 載體起先只保留了 包裝信號(hào)，且在產(chǎn)生中需要輔助病毒和合適的互補(bǔ)包裝細(xì)胞，更需要進(jìn)一步的純化。第三代腺病毒載體不僅繼承了前述腺病毒載體的優(yōu)點(diǎn)，還具有前兩代載體沒有的優(yōu)點(diǎn)，如外源 裝載容量大大提高，可達(dá) 37