高效液相色譜法操作規(guī)程.doc

文件編號(hào) SOP-QC-602 版號(hào) B 頁碼7/71.目的 建立高效液相色譜法檢測操作規(guī)程。2.適用范圍 本規(guī)程適用于高效液相色譜法試驗(yàn)。3.編制依據(jù) 藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（1998年修訂）國家藥品監(jiān)督管理局（1999）4.責(zé)任4.1 QC質(zhì)檢員對(duì)本規(guī)程的實(shí)施負(fù)責(zé)。4.2 QC主管對(duì)本規(guī)程的有效執(zhí)行承擔(dān)監(jiān)督檢查責(zé)任。5.正文5.1簡述5.1.1高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography,HPLC）是一種現(xiàn)代液相色譜法，其基本方法是用高壓輸液泵將具流動(dòng)相泵入裝有填充劑的色譜柱，注入的供試品被流動(dòng)相帶入柱內(nèi)進(jìn)行分離后，各成分先后進(jìn)入檢測器，用記錄儀或數(shù)據(jù)處理裝置記錄色譜圖并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，得到測定結(jié)果。5.1.2檢測器5.1.2.1紫外檢測器（Ultraviolet detector,UV） 紫外檢測器是液相色譜中使用最廣泛的檢測器，幾乎所有的液相色譜儀都配此類檢測器，是一種選擇性檢測器。5.1.2.2優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高、噪聲低、線性范圍寬、對(duì)流速和溫度的波動(dòng)不靈敏，適用于梯度洗脫及制備色譜。5.1.2.3缺點(diǎn)：只能檢測有紫外吸收的物質(zhì)，流動(dòng)相的選擇有一定限制，流動(dòng)相的截止波長必須小于檢測波長。5.1.2.4適用范圍：大多數(shù)有紫外吸收的化合物。5.2高效液相色譜儀的使用要求5.2.1按國家技術(shù)監(jiān)督局國家計(jì)量檢定規(guī)程匯編中“實(shí)驗(yàn)室液相色譜儀檢定規(guī)程（JJG705-90）”的規(guī)定進(jìn)行定期檢定，應(yīng)符合規(guī)定。5.2.2儀器各部件應(yīng)能正常工作，管路為無死體積連接，流路中無堵塞或漏液，在設(shè)定的檢測器靈敏度條件下，色譜基線噪音和漂移應(yīng)能滿足分析要求。5.2.3具體儀器在使用前應(yīng)詳細(xì)參閱各操作說明書。5.3操作前的準(zhǔn)備5.3.1流動(dòng)相的制備 5.3.1.1用高純度的試劑配制流動(dòng)相，必要時(shí)照紫外分光光度法進(jìn)行溶劑檢查，應(yīng)符合要求；水應(yīng)為新鮮制備的高純水，可用超級(jí)純水器制得或用重蒸餾水。凡規(guī)定pH值的流動(dòng)相，應(yīng)使用精密pH計(jì)進(jìn)行調(diào)節(jié)。配制好的流動(dòng)相應(yīng)通過適宜的0.45m濾膜濾過，用前脫氣。應(yīng)配制足量的流動(dòng)相備用。5.3.2供試溶液的配制5.3.2.1供試品用規(guī)定溶劑配制成供試品溶液。定量測定時(shí)，對(duì)照品溶液和供試品溶液均應(yīng)分別配制2份。供試品溶液在注入色譜儀前，一般應(yīng)經(jīng)適宜的0.45m濾膜濾過。必要時(shí)，在配制供試品溶液前，樣品需經(jīng)預(yù)凈化，以免對(duì)色譜系統(tǒng)產(chǎn)生污染或影響色譜分離。5.3.3檢查上次使用記錄和儀器狀態(tài)5.3.3.1檢查色譜柱是否適用于本次實(shí)驗(yàn)，色譜柱進(jìn)出口位置是否與流動(dòng)相的流向一致，原保存溶劑與現(xiàn)用流動(dòng)能否互溶，流動(dòng)相的pH值與該色譜柱是否相適用，儀器是否完好，儀器的各開關(guān)位置是否處于關(guān)斷的位置。5.4操作5.4.1泵的操作5.4.1.1用流動(dòng)相沖洗濾器，再把濾器浸入流動(dòng)相中，啟動(dòng)泵。5.4.1.2打開泵的排放閥，用專用注射器從閥口抽出流動(dòng)相約20ml，設(shè)置高流速（如9ml/min）或用沖洗鍵PURGE進(jìn)行充泵排氣，觀察出口處流動(dòng)相呈連續(xù)流液后，將流速足部回零或停止（STOP）沖洗，關(guān)閉排放閥。5.4.1.3將流速調(diào)節(jié)至分析用流速，對(duì)色譜柱進(jìn)行平衡，同時(shí)觀察壓力指示應(yīng)穩(wěn)定，用干燥濾紙片的邊緣檢查柱管各連接處應(yīng)無滲漏。初始平衡時(shí)間一般約需30分鐘。如為梯度洗脫，應(yīng)在程序器上設(shè)置梯度狀態(tài)，用初始比例的流動(dòng)相對(duì)色譜柱進(jìn)行平衡。5.4.2進(jìn)樣操作5.4.2.1六通閥式進(jìn)樣器5.4.2.1.1把進(jìn)樣器手柄放在載樣位置（LOAD）。5.4.2.1.2用供試溶液清洗配套的注射器，再抽取適量，用定量環(huán)（LOOP）載樣，則注射器抽取量應(yīng)不少于定量環(huán)容積的5倍，用微量注射器定容進(jìn)樣時(shí)，進(jìn)樣量不得多于環(huán)容積的50%，在排除氣泡后方能向進(jìn)樣器中注入供試品溶液。5.4.2.1.3把注射器的平頭針直插至進(jìn)樣器的底部，注入供試品溶液，除另有規(guī)定外，注射器不應(yīng)取下。5.4.2.1.4把手柄轉(zhuǎn)至注樣位置（INJECT），定量環(huán)內(nèi)供試溶液即被流動(dòng)相帶入流路。5.4.2.2自動(dòng)進(jìn)樣器5.4.2.2.1將供試品溶液經(jīng)適宜的0.45m濾膜濾過，取續(xù)濾液置進(jìn)樣小瓶中，蓋上帶有墊片的瓶蓋，順時(shí)針方向旋緊。為避免進(jìn)樣堵塞以及進(jìn)樣器損傷，一般應(yīng)選擇與自動(dòng)進(jìn)樣器型號(hào)配套的進(jìn)樣小瓶。5.4.2.2.2將進(jìn)樣小瓶依次放入貯樣室內(nèi)，記錄瓶位置號(hào)（VIAL）。如果自動(dòng)進(jìn)樣器有控溫功能，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求和樣品穩(wěn)定性，設(shè)置適宜的溫度。5.4.2.2.3檢查自動(dòng)進(jìn)樣器是否為默認(rèn)位置，設(shè)定自動(dòng)進(jìn)樣器參數(shù)，檢查進(jìn)樣針沖洗系統(tǒng)是否正常，沖洗液是否足夠，管路內(nèi)是否有氣泡等，檢查流動(dòng)相是否有足夠的量能完成整個(gè)程序進(jìn)樣（sequence run）。5.4.2.2.4設(shè)定供試品溶液的自動(dòng)進(jìn)樣的起始位置、終止位置、進(jìn)樣體積、稀釋倍數(shù)、數(shù)據(jù)文件名等，用START開始進(jìn)樣。5.4.3色譜數(shù)據(jù)的收集和處理5.4.3.1注樣的同時(shí)啟動(dòng)數(shù)據(jù)處理機(jī)，開始采集和處理色譜信息，如系記錄儀，則注樣同時(shí)按一下記號(hào)鍵作起始記號(hào)。5.4.3.2最后一峰出完后，應(yīng)繼續(xù)走一段基線，確認(rèn)再無組分流出，方能結(jié)束記錄。5.4.3.3根據(jù)第一張預(yù)試的色譜圖，適當(dāng)調(diào)整衰減、紙速、記錄時(shí)間等參數(shù)，使色譜峰信號(hào)在色譜圖上有一定強(qiáng)度。定量測定中，一般峰頂不得超過記錄滿量程。再進(jìn)行正式分析操作。5.4.3.4含量測定的對(duì)照溶液和樣品供試溶液每份至少注樣2次，由全部注樣結(jié)果（n4）求得平均值，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）一般應(yīng)不大于1.5%。5.4.3.5色譜系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)應(yīng)符合中國藥典的要求。5.5測定結(jié)果處理5.5.1(1)內(nèi)標(biāo)法 用含對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的對(duì)照溶液所得色譜峰響應(yīng)值，按下式計(jì)算校正因子：式中 AS和AR分別為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)和對(duì)照品的峰面積或峰高；CS為加入內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度；CR為對(duì)照品的濃度。再根據(jù)含內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液色譜峰響應(yīng)值，計(jì)算含量：式中AX和AS分別為供試品（或其雜質(zhì)）和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高；CX為供試品（或其雜質(zhì)）的濃度；CS為加入內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度；CR為對(duì)照品的濃度。必要時(shí)，再根據(jù)稀釋倍數(shù)、取樣量和標(biāo)示量折算成為標(biāo)示量的百分含量，或根據(jù)稀釋倍數(shù)和取樣量折算成百分含量。5.5.2外標(biāo)法按各品種項(xiàng)下規(guī)定，精密稱（量）取對(duì)照品和供試品，配制成溶液，分別精密取一定量，注入儀器，記錄色譜圖，測量對(duì)照品和供試品待測成分的峰面積（或峰高），按下式計(jì)算含量：式中各符號(hào)意義同上。式中，為被測含量組分峰面積，為參與計(jì)算的全部峰面積（溶劑峰和其他干擾峰除外）之和。采用本法時(shí)，應(yīng)考慮：（1）最小組分和最大組分的檢查響應(yīng)是否在線性范圍內(nèi)；（2）在所用檢測波長下個(gè)組分響應(yīng)的差別。5.5.3雜質(zhì)檢查法 按藥品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法測定雜質(zhì)的含量或限量使，如雜質(zhì)對(duì)照品已經(jīng)建立，則可按規(guī)定用上述外標(biāo)法進(jìn)行測定；如雜質(zhì)對(duì)照品沒有建立，無法獲得，或雜質(zhì)未知，則可按下法測定。當(dāng)供試品溶液的溶劑干擾供試品溶液的測定時(shí)，應(yīng)去等體積溶劑進(jìn)樣，并將溶劑的背景色譜響應(yīng)，從供試品溶液的色譜響應(yīng)中扣除。5.5.3.1加校正因子的主成分自身對(duì)照法在已知雜質(zhì)在規(guī)定檢測波長下的響應(yīng)因子與主成分不一致的情況下，可采用加校正因子的主成分自身對(duì)照法。在建立方法時(shí)，按各品種項(xiàng)下規(guī)定，精密稱（量）取雜質(zhì)對(duì)照品和待測成分對(duì)照品各適量，配制測定雜質(zhì)校正因子的溶液，進(jìn)樣，記錄色譜圖，按內(nèi)標(biāo)法以主成分為內(nèi)標(biāo)計(jì)算雜質(zhì)的校正因子。此校正因子可直接載入各品種正文中，用于校正雜質(zhì)的實(shí)測峰面積，再按照規(guī)定的方法計(jì)算雜質(zhì)的含量。由于沒有雜質(zhì)對(duì)照品，應(yīng)規(guī)定這類雜質(zhì)峰的位置，如用相對(duì)于主成分的相對(duì)保留時(shí)間表示，還應(yīng)進(jìn)行方法耐用性考察，如采用3根以上不同品牌的色譜柱同法測定各雜質(zhì)的相對(duì)保留時(shí)間，RSD應(yīng)小于5.0%。5.5.3.2不加校正因子的主成分自身對(duì)照法在雜質(zhì)未知或未建立雜質(zhì)對(duì)照品時(shí)，可采用不加校正因子的主成分自身對(duì)照法測定雜質(zhì)的含量或限量。測定雜質(zhì)含量時(shí)，按各品種項(xiàng)下規(guī)定的雜質(zhì)限度，將供試品稀釋成與雜質(zhì)限度相當(dāng)?shù)娜芤鹤鳛閷?duì)照溶液，進(jìn)樣，調(diào)節(jié)檢測靈敏度（以噪音水平可接受為限）或進(jìn)樣量（以柱子不過載為限），使對(duì)照溶液中的主成分色譜峰高約達(dá)滿量程的10%25%或其峰面積能準(zhǔn)確積分（通常，含量低于0.5%的雜質(zhì)，峰面積的RSD應(yīng)小于10%；含量在0.5%2%的雜質(zhì)，峰面積的RSD應(yīng)小于5%；含量大于2%的雜質(zhì)，峰面積的RSD應(yīng)小于2%）。然后，取供試品溶液和對(duì)照品溶液適量，分別進(jìn)樣，供試品溶液的記錄時(shí)間除另有規(guī)定外，應(yīng)為主成分保留時(shí)間的23倍，根據(jù)所得的供試品溶液中各雜質(zhì)峰面積及其總和，按規(guī)定的方法計(jì)算雜質(zhì)含量或限度。5.6清洗和關(guān)機(jī)5.6.1分析完畢后，先關(guān)檢測器和數(shù)據(jù)處理機(jī)，再用經(jīng)濾過和脫氣的適當(dāng)溶劑清洗色譜系統(tǒng)，正相柱一般用正己烷，反相柱如使用過含鹽流動(dòng)相，則先用水，然后用甲醇-水沖洗，沖洗前先按（5.4.1.15.4.1.2）操作，再用分析流速?zèng)_洗，各種沖洗劑2一般沖洗1530分鐘，特殊情況應(yīng)延長沖洗時(shí)間。5.6.2沖洗完畢后，逐步降低流速至0，關(guān)泵，進(jìn)樣器也應(yīng)用相應(yīng)溶劑沖洗，可使用進(jìn)樣器所附的專用沖洗接頭。5.6.3關(guān)斷電源，作好使用登記，內(nèi)容包括日期、檢品、色譜柱、流動(dòng)相、柱壓、使用小時(shí)數(shù)、儀器使用前后狀態(tài)等。5.7注意事項(xiàng)5.7.1色譜柱與進(jìn)樣器及其出口端與檢測器之間應(yīng)為無死體積連接，以免試樣擴(kuò)散影響分離。5.7.2新柱或被污染柱用適當(dāng)溶劑沖洗時(shí)，應(yīng)將其出口端與檢測器脫開，避免污染。5.7.3使用的流動(dòng)相應(yīng)與儀器系統(tǒng)的原保存溶液能互溶，如不互溶，則先取下上次的色譜柱，照（5.4.1.1和5.4.1.2）的方法用異丙醇沖洗過渡，進(jìn)樣器和檢測器的流通池也注入異丙醇進(jìn)行過渡，過渡完畢后，接上相應(yīng)的色譜柱，換上本次使用的流動(dòng)相，再按（5.4.1.1）順序操作。5.7.4壓力表無壓力顯示或壓力波動(dòng)時(shí)不能進(jìn)行分析，應(yīng)檢查泵中氣泡是否已排除，各連接處有無漏液，排除故障后方能進(jìn)行操作。如壓力升高，甚至自動(dòng)停泵，應(yīng)檢查柱端有無污染堵塞。5.7.5發(fā)現(xiàn)記錄基線波動(dòng)，出現(xiàn)毛刺等現(xiàn)象，首先應(yīng)考慮檢測器流通池中是否有氣泡或污染，如不是流通池引起，可等待氘燈穩(wěn)定，同時(shí)檢查儀器的接地是否良好，必要時(shí)，換上新的氘燈，儀器穩(wěn)定后方能進(jìn)行操作。5.7.6進(jìn)樣前，色譜柱應(yīng)用流動(dòng)相充分沖洗平衡，如系統(tǒng)適用性不符合規(guī)定，或填充劑以損壞，則應(yīng)更換新的同類色譜柱進(jìn)行分析，由于同類填充劑的化學(xué)鍵合相的鍵合度及性能等存在一定差異，往往依法操作達(dá)不到預(yù)定的分離時(shí)，可更換另一牌號(hào)的同類色譜柱進(jìn)行試驗(yàn)。5.7.7以硅膠作載體的化學(xué)鍵合相填充劑的穩(wěn)定性受流動(dòng)相pH值影響，使用時(shí)，應(yīng)詳細(xì)參閱色譜柱說明書，在規(guī)定的pH值范圍內(nèi)選用流動(dòng)相，一般的pH值范圍為2.57.5。使用高pH值流動(dòng)相時(shí)，可在泵與進(jìn)樣器之間連接一硅膠短柱，以飽和流動(dòng)相，保護(hù)分析柱，并盡可能縮短在高pH值下的使用時(shí)間，用后立即沖洗。5.7.8各色譜柱的使用應(yīng)予登記，應(yīng)包括本次測