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Southern雜交 ，通過用限制性內(nèi)切酶消化基因組或其它來源的 DNA ，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳按大小分離酶切所得的片段，隨后 DNA 在原位發(fā)生變性并從凝膠轉(zhuǎn)移到一固相支持物上（一般是硝酸纖維素膜或尼龍膜）。 DNA 轉(zhuǎn)移至固相支持物的過程中各 DNA 的相對位置保持不變，用一定方法（如放射性同位素）標(biāo)記的 DNA 探針與固著在膜上的 DNA 雜交，經(jīng)X-光片自顯影顯現(xiàn)出與探針 DNA 互補的 DNA 電泳條帶的位置。 實驗一 植物總 DNA 的快速少量抽提（CTAB法）- 返回 -DNA 分子是分子生物學(xué)研究的基本材料，依不同的實驗?zāi)康目刹扇〔煌某樘岱椒ǐ@取數(shù)量和質(zhì)量不等的 DNA 。 實驗?zāi)康模毫私庵参?DNA 抽提的主要方法，掌握 CTAB 法快速抽提水稻 DNA 。 實驗材料及試劑： 水稻葉片， 1.5 CTAB ，氯仿 / 異戊醇 (24:1) ， 95% 乙醇或無水乙醇等 實驗原理：植物 DNA 的抽提常采用兩種方法：（1） SDS 法： 離子去污劑，過程長，純度高；（2） CTAB 法：該方法簡便、快速， DNA 產(chǎn)量高 ( 純度稍次，適用于一般分子生物學(xué)操作 ) 。 CTAB 是一種非離子去污劑，植物材料在 CTAB 的處理下， 結(jié)合 65 水浴使細(xì)胞裂解、蛋白質(zhì)變性、 DNA 被釋放出來 。 CTAB 與核酸形成復(fù)合物，此復(fù)合物在高鹽 （ 0.7mM ） 濃度下可溶，并穩(wěn)定存在，但在低鹽濃度 （ 0.1-0.5mM NaCl ） 下 CTAB - 核酸復(fù)合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白質(zhì)及多糖等仍溶解于溶液中。經(jīng)離心棄上清后， CTAB- 核酸復(fù)合物再用 70 75% 酒精浸泡可洗脫掉 CTAB 。 再經(jīng)過氯仿 / 異戊醇 (24:1) 抽提去除蛋白質(zhì)、多糖、色素等來純化 DNA ，最后經(jīng)異丙醇或乙醇等 DNA 沉淀劑將 DNA 沉淀分離出來。 實驗步驟： 1采集適量幼嫩葉片，用液 N2 研成粉末， 0.4 g 裝入 1.5ml 離心管中（ -20 預(yù)冷）。2預(yù)熱 1.5 CTAB 到 95 ，加 1ml 到裝有葉片粉末的離心管中，混勻（防止凍融）。3立即置于 65 水浴 30min ，每 5 min，上下顛倒 1 次。412000g 離心 5 min。5吸取上清液約 600l ，加入等體積（ 600l ）氯仿 / 異戊醇 (24:1) ，上下顛倒數(shù)次，至下層液相呈深綠色為止。612000g 離心 5 分鐘。7取 450l 上清于一新 1.5ml 離心管，加入 1ml 95% 乙醇和 45l 10M NH4AC ，混勻，室溫放置 10min 。812000 g 離心 10min ，去上清，用 75% EtOH 浸洗沉淀，自然干燥約 30 min 。9加入 50l 1/10 TE 或無菌水（含 20g/RNase ），置于 4 過夜，待 DNA 溶解后，檢測 DNA 濃度及質(zhì)量。 注意事項： 1盡量取材幼嫩葉片，如太老，酚類物質(zhì)多，必須用 10 mM 的 -ME 處理2研缽預(yù)凍，粉末至加 CTAB 前不要融化324:1 的氯仿 / 異戊醇抽提時動作應(yīng)輕柔，轉(zhuǎn)移用的槍頭最好是剪寬了的4所用試劑必需滅菌，手套 思考：（1） DNA 降解的可能原因（2）提高 DNA 產(chǎn)量的措施 實驗二 總 DNA 質(zhì)量檢測及酶切- 返回 -實驗?zāi)康模?了解掌握檢測 DNA 質(zhì)量的方法以及 DNA 定量的方法；了解影響 DNA 在瓊脂糖凝膠中泳動速率的因素；訓(xùn)練 DNA 的瓊脂糖凝膠電泳操作及 DNA 的限制性內(nèi)切酶操作。 實驗原理：參見系列一中實驗二；限制性內(nèi)切酶的特點：見“基因操作原理”。 實驗材料及試劑：水稻總 DNA 或 BAC 克隆 DNA ，瓊脂糖，限制性內(nèi)切酶 Dra I ， EcoRI ， EcoRV ， HindIII 實驗步驟： 1取 10l DNA 于 0.8% 凝膠檢測；2將 DNA 調(diào)節(jié)濃度至 300-400 ng/l；3仔細(xì)閱讀將所用的任何一種酶產(chǎn)品說明書，熟悉反應(yīng)條件及酶切的貯存濃度（ 10U-50U/l ）廠家配套試劑；4計算據(jù)反應(yīng)條件所需要的各種試劑準(zhǔn)確用量：（ 0.5 ml tube 中）DNA(3-5g) 10l10 buffer reaction 1.5lEnzyme (15 U/l) 0.8l （冰上）ddH2O 2.7l混勻，短暫離心；537 溫浴 1-2 hrs ( 純 DNA) 或 10 hrs （粗制 DNA ）；6加入上樣緩沖液終止酶切反應(yīng)，也可 65 加熱 10 min 使酶變性失活；7電泳檢測酶切效率：每個樣品取 1/10 量用瓊脂糖電泳檢測，制膠及點樣方法同上。 結(jié)果分析： 若水稻 DNA 呈現(xiàn)均勻連續(xù)分布的一片，則酶切效果好，否則需重做；DNA 被切爛： DNA 降解，重新提 DNA ；DNA 切不動：雜質(zhì)多（多糖，蛋白質(zhì)，酚類，有機溶劑等），重新純化；若是 BAC 克隆 DNA ，酶切后應(yīng)出現(xiàn)多條很清晰的不同大小 DNA 帶。 思考：什么是酶星活性？如何避免？影響酶切效率的因素？EB 指示劑原理？ 實驗三 電泳、轉(zhuǎn)膜- 返回 -轉(zhuǎn)膜是把 DNA 從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)移到固相支持物（一般是尼龍膜）上固定，是進(jìn)行各種后續(xù)研究（如 RFLP 分析，陽性克隆的篩選驗證等所有涉及分子雜交的研究）的前提。 實驗?zāi)康模?掌握 Southern blotting 的原理及操作步驟 實驗原理： 1轉(zhuǎn)膜的方式：向上的毛細(xì)管轉(zhuǎn)移向下的毛細(xì)管轉(zhuǎn)移同時向兩張膜轉(zhuǎn)移電轉(zhuǎn)移真空轉(zhuǎn)移2固相支持物的種類及選擇：硝酸纖維素膜：非共價結(jié)合，易脆，易丟失 DNA ， 9 ， DNA 不能與膜結(jié)合。4轉(zhuǎn)膜時間（ duration of transfer ）約 12 hrs取決于毛細(xì)管系統(tǒng)， DNA 大小，膠厚度 (5 mm) 及濃度 (1%) 。DNA 分子量大小決定時間長短，部分去嘌呤減小 DNA ，堿轉(zhuǎn)移 2hrs 大部分結(jié)合到膜。DNA 轉(zhuǎn)移的效率較難判斷，只有在轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，通過 EB 染膠，及分子雜交才可以鑒別效率高低，但已無補救措施，因此，每一步應(yīng)嚴(yán)格操作。 實驗材料及試劑： 酶消化好的 DNA 樣品，尼龍膜， 0.2NHCl ， 0.4N NaOH 等 實驗步驟： 10.8% 瓊脂糖電泳制膠：注意瓊脂糖的質(zhì)量，膠的濃度，厚度（3000Ci/mmol ）， 30 溫育 3hrs 以上。3雜交將標(biāo)記好的探針，補加 300l 雜交液， 100 變性（ or 0.4N NaOH 變性），加入雜交袋（盒）中（忌直接加于膜上）。雜交前作標(biāo)記效率測定， 25% 以上可以往下做雜交， 過夜雜交。雜交效率受雜交速率及雜交穩(wěn)定性影響。4洗膜：從低嚴(yán)謹(jǐn)度到高嚴(yán)謹(jǐn)度冼膜液（具體情況而定）：1 SSC/0.1%SDS 洗膜兩次（冷 5min ，熱 65 ， 15min ）檢測信號強度0.5 SSC/0.1%SDS 熱冼 65， 15min依情況可有改動 0.2 SSC/0.1%SDS or 0.1 SSC/0.1%SDS 。5包膜：膜從洗膜液中撈出，在濾紙上晾干，膜表面無可見水膜為止（注意：不能太干，以防探針難以洗脫影響再次使用），用保鮮膜包膜，壓 X- 光片，置于 -20 或 -70 3 7 天（依據(jù)信號強弱掌握曝光時間）6沖洗 X- 光片在暗室紅燈下取出 X- 光片，置入顯影液中至雜交帶顯現(xiàn)出來（顯影時間依據(jù)信號強弱及曝光時間長短可由幾秒鐘到 2min），轉(zhuǎn)入清水中漂洗，然后放入定影液中定影至清亮（約 10min）。自來水沖洗干凈后，晾干，讀片。7膜上探針洗脫再次使用膜前，必須洗去上次探針！(1) 0.1%SDS ， 0.1 SSC 10min(2) 0.1NaOH ， 0.2%SDS 2-3min(3) 0.2M Tris.HCl ， 0.2%SDS ， 0.1 SSC 20min只洗去探針，而不影響膜上的靶 DNA （因為 DNA 與膜是共價鍵結(jié)合，而 DNA 與探針的結(jié)合是氫鍵結(jié)合）。 附注： 1雜交效率的影響因素a.雜交溫度：雙鏈 DNA 分子， T=Tm -2025可達(dá)最大雜交率， DNA-RNA 雜交分子則低于 Tm 值 10-15 。b.離子強度 (1.5M/L NaCl 雜交率最高 )c.雙鏈長度 ( 形成雜交物長度 ) ：雜交率與雙鏈長度成正比d.探針的復(fù)雜程度 ( 重復(fù)性探針可以增加雜交率 )e.pH5.0-9.0 基本無影響。2影響雜交穩(wěn)定性（影響解鏈溫度的）因素a.離子強度在 0.01-0.4M NaCl 之間， 每10 單價陽離子， Tm - 16.6 b.堿基組成 AT500bp 基本無影響3整個實驗過程中應(yīng)注意的事項保證轉(zhuǎn)膜質(zhì)量；操作規(guī)范；提高雜交靈敏度（信號強度）；a.探針量及標(biāo)記量（探針變性）；b.比活（性）度 =108dpm/u(1000bp）過長，高嚴(yán)謹(jǐn)度下難洗脫非完全配對雜交探針。4放射性同位素放射性同位素發(fā)出的射線主要有粒子：外照射，一般能量的粒子穿透能力較弱，射程短，危害性小，稍加防護(hù)即可（如手套）；內(nèi)照射，電離密度大，危害大。粒子：穿透能力比粒子強，外照射危害比粒子大，可引起皮膚的放射損傷。射線：穿透能力很強，外照射時危害性很大，應(yīng)采取切實有效的防護(hù)措施。放射性活度及單位放射性活度 A 是指一定量的放射性核素在時間間隔 dt 內(nèi)發(fā)生自發(fā)核衰變數(shù) dN 與此時間間隔的比值。即 A=dN/dt放射性活度的單位是 Becquerel( 貝克勒而 ) ，簡稱 Bq 。1Bq=1 個衰變 / 秒； 1 居里 =3.7 1010Bq其不表示放射出射線的多少（如 60Co 一個原子衰變防出 1 個粒子和一個光子，而一個 32P 原子只衰變出一個粒子），也不表示射線能量的大小。輻射防護(hù)的目的防止發(fā)生對健康有害的確定性效應(yīng) (接受放射性治療的患者除外)，并將隨機性損害效應(yīng)的發(fā)生降低到被認(rèn)為可以接受的水平，從而保障放射工作人員、公眾及其后代的健康與安全，提高放射防護(hù)措施的效益，促進(jìn)放射工作的發(fā)展。放射防護(hù)的原則a.輻射實踐的正當(dāng)化：生產(chǎn)必須，醫(yī)療必須，科研教學(xué)必須b.輻射防護(hù)的最優(yōu)化：即綜合考慮社會、經(jīng)濟等諸因素之后，使個人劑量的大小、受照人數(shù)的多少和不確定發(fā)生的照射事件的發(fā)生概率可合理達(dá)到的低水平。c.個人劑量限制：為了保證每個人不致受到不合理的危害，必須制定一個個人劑量限制值，放射工作人員的劑量限制：全身均勻照射的年當(dāng)量劑量限值 H全身=50mSv ; 不均勻照射時，有效劑量 E 不應(yīng)超過 H全身。外照射的防護(hù)措施a.距離防護(hù)：人體受到照射的劑量率隨著離開電離輻射源的距離的增大而減少。劑量率與距離的平方成反比。b.時間防護(hù)：在劑量率不變時，劑量與時間成正比，即操作時間越短，人員所受到的照射劑量越小。（ 要求放射性作業(yè)應(yīng)操作熟練、操作步