CN102894467A利用固定化酶制劑結(jié)合醋酸菌發(fā)酵制備煙草提取物的方法

CN102894467A利用固定化酶制劑結(jié)合醋酸菌發(fā)酵制備煙草提取物的方法 (10)申請(qǐng)公布號(hào)102894467A (43)申請(qǐng)公布日xx.01.30102894467A*102894467A* (21)申請(qǐng)?zhí)杧x10399941.8 (22)申請(qǐng)日xx.10.19A24B15/20(xx.01) (71)申請(qǐng)人云南瑞升煙草技術(shù)（集團(tuán)）有限公司地址650106云南省昆明市高新開發(fā)區(qū)海源北路1699號(hào) (72)發(fā)明人畢薇李仙劉煜宇劉麗芬 (74)專利代理機(jī)構(gòu)昆明大百科專利事務(wù)所53106代理人李云 (54)發(fā)明名稱利用固定化酶制劑結(jié)合醋酸菌發(fā)酵制備煙草提取物的方法 (57)摘要利用固定化酶制劑結(jié)合醋酸菌發(fā)酵制備煙草提取物的方法，是用固定化酶制劑處理煙草提取物原料獲得處理產(chǎn)物，再用醋酸菌發(fā)酵處理產(chǎn)物獲得發(fā)酵產(chǎn)物，然后將發(fā)酵產(chǎn)物濃縮處理，即得煙草提取物。 本發(fā)明可以快速有效地降低煙草提取物中淀粉、蛋白質(zhì)、纖維素、木質(zhì)素及果膠質(zhì)的含量并適度提高煙草提取物的酸度，有效提高卷煙的香味和抽吸舒適感，提升煙草提取物的使用范圍。 (51)Int.Cl.權(quán)利要求書1頁(yè)說(shuō)明書4頁(yè) (19)中華人民共和國(guó)國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局 (12)發(fā)明專利申請(qǐng)權(quán)利要求書1頁(yè)說(shuō)明書4頁(yè)1/1頁(yè)21.利用固定化酶制劑結(jié)合醋酸菌發(fā)酵制備煙草提取物的方法，其特征在于，方法如下固定化酶制劑處理煙草提取物原料用淀粉酶、蛋白酶、木質(zhì)素酶、果膠酶、漆酶、酯酶中的一種或多種制成酶液待用；將載體用磷酸鹽緩沖液浸泡0.5-6h后取出，作為酶制劑的固定化載體，再將此載體放入酶液中，20-45浸泡0.5-6h后將載體從酶液中取出即得到固定化酶；將煙草提取物原料加入2-5倍水滅菌后與固定化酶混勻，所加入的固定化酶與煙草提取物原料的質(zhì)量比控制在0.05-10%，混勻后在20-45渥堆處理24-120h獲得處理產(chǎn)物；醋酸菌發(fā)酵培養(yǎng)醋酸菌種子液待用；將獲得的處理產(chǎn)物加入5-20倍水后接入醋酸菌種子液，接入的醋酸菌種子液與處理產(chǎn)物的質(zhì)量比控制在0.5-10%，25-38培養(yǎng)24-120h獲得發(fā)酵產(chǎn)物；濃縮將發(fā)酵產(chǎn)物濃縮處理，即得煙草提取物。 2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用固定化酶制劑結(jié)合醋酸菌發(fā)酵制備煙草提取物的方法，其特征在于，制備酶液是采用淀粉酶、蛋白酶、木質(zhì)素酶、果膠酶、漆酶、酯酶中的一種或多種與水混合配制。 3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用固定化酶制劑結(jié)合醋酸菌發(fā)酵制備煙草提取物的方法，其特征在于，配制酶液時(shí)按質(zhì)量比加入穩(wěn)定劑0.2-10%和/或防腐劑0.01-2%，余量為水。 4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用固定化酶制劑結(jié)合醋酸菌發(fā)酵制備煙草提取物的方法，其特征在于，所述煙草提取物原料是指煙葉、煙葉碎片、煙末、碎煙梗中的一種或幾種。 5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4所述的利用固定化酶制劑結(jié)合醋酸菌發(fā)酵制備煙草提取物的方法，其特征在于，用于制備固定化酶制劑的載體是表面具有微小孔隙的紙樣載體，所述紙樣載體為空氣玻纖濾材、醋酸纖維、濾紙、宣紙、石棉紙中的任意一種，孔隙直徑在1-500m，將載體剪成直徑在0.3-3cm的圓形紙片。 權(quán)利要求書102894467A21/4頁(yè)3利用固定化酶制劑結(jié)合醋酸菌發(fā)酵制備煙草提取物的方法技術(shù)領(lǐng)域0001本發(fā)明涉及煙用香料制備方法技術(shù)領(lǐng)域。 背景技術(shù)0002在煙草制品中，特別注重?zé)煵菹銡夂臀?，常以添加一些煙草提取物作為提升抽吸品質(zhì)、完善產(chǎn)品風(fēng)格特征的手段。 然而，由于煙草提取物的原料通常是一些低次煙葉或煙草廢棄物，從而導(dǎo)致提取物在卷煙應(yīng)用方面存在青雜氣濃重、刺激性較高、煙草本香不突出等問(wèn)題，制約了煙草提取物在卷煙制品中的運(yùn)用。 0003淀粉、蛋白質(zhì)、纖維素、木質(zhì)素及果膠質(zhì)是一些會(huì)帶來(lái)不良抽吸效果的大分子物質(zhì)。 目前，國(guó)內(nèi)外降低卷煙原料中這些物質(zhì)的方法主要通過(guò)在煙葉發(fā)酵陳化階段施加微生物和酶制劑等，所需時(shí)間較長(zhǎng)，效果較為單一。 對(duì)于煙草提取物來(lái)說(shuō)，酸性物質(zhì)的存在能在一定程度上提高其抽吸口感，增加與煙絲的匹配度，調(diào)節(jié)卷煙的協(xié)調(diào)性，使整體韻調(diào)和諧。 然而，目前還沒有一種較好的方法能在快速降低淀粉、蛋白質(zhì)、纖維素、木質(zhì)素、果膠質(zhì)等的同時(shí)還可適度增加煙草提取物的酸度。 0004酶的固定化技術(shù)是用固體材料將酶束縛或限制于一定區(qū)域內(nèi)，酶仍能進(jìn)行其特有的催化反應(yīng)、并可回收及重復(fù)使用的一類技術(shù)。 利用酶的固定化技術(shù)進(jìn)行酶解，相比較常規(guī)酶解，酶活力損失較少，能顯著提高酶的穩(wěn)定性和酶解效率。 關(guān)于酶的固定化技術(shù)，專利xx10026535.1提出了一種采用醋酸纖維固定化復(fù)合酶技術(shù)對(duì)富營(yíng)養(yǎng)化水污染治理的專用固定化復(fù)合酶配方；專利xx10041643.X提出了一種采用固定化酶生產(chǎn)毛蕊花糖苷的方法；馬寧等（馬寧,謝文磊.磁性高分子微球固定化酶的制備及應(yīng)用方法J.現(xiàn)代化工.xx,6:364-366.）提出了磁性高分子微球固定化酶的制備及應(yīng)用方法；這些專利或文章都沒有涉及到利用固定化酶制備煙草提取物，且所述的固定化酶制劑的制備較為復(fù)雜，與煙草提取物的兼容性較差。 0005醋酸菌是一類能使糖類和酒精氧化成醋酸等產(chǎn)物的細(xì)菌。 工業(yè)上可以利用醋酸菌釀醋、制做醋酸和葡萄糖酸等，也可利用醋酸菌進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酸，通過(guò)調(diào)節(jié)醋酸菌的培養(yǎng)條件和發(fā)酵底物，獲得適宜的發(fā)酵產(chǎn)品。 關(guān)于醋酸菌的專利較多，但都集中在食醋、酒等釀造領(lǐng)域；專利xx10130665.0提出一種發(fā)酵型煙用羅漢果浸膏的制備方法，其中提到利用醋酸菌發(fā)酵羅漢果浸膏后作為煙用添加劑使用；但這些專利和文章都沒有提到在煙草提取物中直接利用醋酸菌進(jìn)行發(fā)酵的工藝。 發(fā)明內(nèi)容0006本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用紙樣載體固定化酶制劑結(jié)合醋酸菌發(fā)酵制備煙草提取物的方法，以快速有效地降低煙草提取物中淀粉、蛋白質(zhì)、纖維素、木質(zhì)素及果膠質(zhì)的含量并適度提高煙草提取物的酸度，有效提高卷煙的香味和抽吸舒適感，提升煙草提取物的使用范圍。 0007本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)說(shuō)明書102894467A32/4頁(yè)4利用固定化酶制劑結(jié)合醋酸菌發(fā)酵制備煙草提取物的方法，方法如下固定化酶制劑處理煙草提取物原料用淀粉酶、蛋白酶、木質(zhì)素酶、果膠酶、漆酶、酯酶中的一種或多種制成酶液待用；將紙樣載體用磷酸鹽緩沖液浸泡0.5-6h后取出，作為酶制劑的固定化載體，再將此載體放入酶液中，20-45浸泡0.5-6h后將載體從酶液中取出即得到固定化酶；將煙草提取物原料加入2-5倍水滅菌后與固定化酶混勻，所加入的固定化酶與煙草提取物原料的質(zhì)量比控制在0.05-10%，混勻后在20-45渥堆處理24-120h獲得處理產(chǎn)物；醋酸菌發(fā)酵培養(yǎng)醋酸菌種子液待用；將獲得的處理產(chǎn)物加入5-20倍水后接入醋酸菌種子液，接入的醋酸菌種子液與處理產(chǎn)物的質(zhì)量比控制在0.5-10%，25-38培養(yǎng)24-120h獲得發(fā)酵產(chǎn)物；濃縮將發(fā)酵產(chǎn)物濃縮處理，即得煙草提取物。 0008本發(fā)明制備酶液是采用淀粉酶、蛋白酶、木質(zhì)素酶、果膠酶、漆酶、酯酶中的一種或多種與水混合配制。 配制酶液時(shí)可按質(zhì)量比加入穩(wěn)定劑0.2-10%和/或防腐劑0.01-2%，余量為水。 所述煙草提取物原料是指煙葉、煙葉碎片、煙末、碎煙梗中的一種或幾種。 本發(fā)明用于制備固定化酶制劑的載體是表面具有微小孔隙的紙樣載體，所述紙樣載體為空氣玻纖濾材、醋酸纖維、濾紙、宣紙、石棉紙中的任意一種，孔隙直徑在1-500m，將載體剪成直徑在0.3-3cm的圓形紙片。 本發(fā)明所述固定化酶制劑制備后綜合酶活為2-80U/cm2，這樣的酶活力，能夠保持渥堆狀態(tài)下處理煙草提取物原料中淀粉、蛋白質(zhì)、木質(zhì)素和果膠質(zhì)的能力，且渥堆處理的方式為酶發(fā)揮最佳處理能力創(chuàng)造了極佳的少氧環(huán)境并保持了適宜的溫度，更相似于煙葉自然陳化發(fā)酵的條件，但與之相比大大縮短了時(shí)間。 0009本發(fā)明所述用于發(fā)酵煙草提取物的醋酸菌屬于常見的釀造食醋的醋酸桿菌，其產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，能夠在較短時(shí)間內(nèi)利用煙草原料產(chǎn)生一定量的醋酸，所產(chǎn)生的醋酸創(chuàng)造了微弱的酸性環(huán)境，為煙草提取物提升了香氣質(zhì)、提高了香氣量，擴(kuò)大了運(yùn)用范圍。 0010利用紙樣載體將酶進(jìn)行固定化后制成固定化酶制劑，用于快速酶解煙草提取物原料中的淀粉、蛋白質(zhì)、纖維素、木質(zhì)素及果膠質(zhì)等大分子物質(zhì)，之后結(jié)合醋酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸，能在較短時(shí)間內(nèi)既降低原料中一些會(huì)帶來(lái)不良抽吸效果的大分子物質(zhì)含量，又產(chǎn)生了能提高抽吸舒適度的酸性物質(zhì)。 具體實(shí)施方式0011為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下通過(guò)實(shí)施例及試驗(yàn)數(shù)據(jù)，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。 所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。 0012利用固定化酶制劑結(jié)合醋酸菌發(fā)酵制備煙草提取物的方法，方法如下固定化酶制劑處理煙草提取物原料用淀粉酶、蛋白酶、木質(zhì)素酶、果膠酶、漆酶、酯酶中的一種或多種制成酶液待用；將紙樣載體用磷酸鹽緩沖液浸泡0.5-6h后取出，作為酶制劑的固定化載體，再將此載體放入酶液中，20-45浸泡0.5-6h后將載體從酶液中取出即得到固定化酶；將煙草提取物原料加入2-5倍水滅菌后與固定化酶混勻，所加入的固定化酶與加水滅菌后的煙草提取物原料的質(zhì)量比控制在0.05-10%，混勻后在20-45渥堆處說(shuō)明書102894467A43/4頁(yè)5理24-120h獲得處理產(chǎn)物；醋酸菌發(fā)酵培養(yǎng)醋酸菌種子液待用；將獲得的處理產(chǎn)物加入5-20倍水后接入醋酸菌種子液，接入的醋酸菌種子液與處理產(chǎn)物的質(zhì)量比控制在0.5-10%，25-38培養(yǎng)24-120h獲得發(fā)酵產(chǎn)物；濃縮將發(fā)酵產(chǎn)物濃縮處理，即得煙草提取物。 0013實(shí)施例1固定化酶制劑處理煙草提取物原料按質(zhì)量比用25%淀粉酶、0.2%酶穩(wěn)定劑、0.01%防腐劑和余量的水制成酶液；將空氣玻纖濾材剪成3cm的圓形紙片放入pH7.5磷酸鹽緩沖液中浸泡0.5h后取出，再放入酶液中20浸泡6h制成固定化酶制劑；將200g津巴布韋煙葉碎片加入5倍水滅菌后接入1g固定化酶制劑，混勻后35渥堆處理60h獲得處理產(chǎn)物；醋酸菌發(fā)酵培養(yǎng)醋酸菌種子液待用；將獲得的處理產(chǎn)物加入20倍水后接入醋酸菌種子液，醋酸菌種子液與處理產(chǎn)物的質(zhì)量比為10%，25培養(yǎng)120h獲得發(fā)酵產(chǎn)物；濃縮發(fā)酵產(chǎn)物至密度為1.3即得煙草提取物。 0014實(shí)施例2固定化酶制劑處理煙草提取物原料按質(zhì)量比用將30%蛋白酶、5%酶穩(wěn)定劑和余量的水制成酶液；將濾紙剪成0.3cm的圓形紙片放入pH7.0磷酸鹽緩沖液中浸泡6h后取出，再放入酶液中35浸泡0.5h制成固定化酶制劑；將200g土耳其香料煙煙末加入2倍水滅菌后接入0.1g固定化酶制劑，混勻后45渥堆處理120h獲得處理產(chǎn)物；醋酸菌發(fā)酵培養(yǎng)醋酸菌種子液待用；將獲得的處理產(chǎn)物加入10倍水后接入醋酸菌種子液，醋酸菌種子液與處理產(chǎn)物的質(zhì)量比為0.5%，38培養(yǎng)24h獲得發(fā)酵產(chǎn)物；濃縮發(fā)酵產(chǎn)物至密度為1.5即得煙草提取物。 0015實(shí)施例3固定化酶制劑處理煙草提取物原料按質(zhì)量比用10%木質(zhì)素酶、2%防腐劑和余量的水制成酶液；將石棉紙剪成1.5cm的圓形紙片放入pH6.5磷酸鹽緩沖液中浸泡3h后取出，再放入酶液中30浸泡4h制成固定化酶制劑；將200g巴西粉碎煙梗加入3倍水滅菌后接入6.5g固定化酶制劑，混勻后37渥堆處理24h獲得處理產(chǎn)物。 0016醋酸菌發(fā)酵培養(yǎng)醋酸菌種子液待用；將獲得的處理產(chǎn)物加入5倍水后接入醋酸菌種子液，醋酸菌種子液與處理產(chǎn)物的質(zhì)量比為5%，30培養(yǎng)60h獲得發(fā)酵產(chǎn)物；濃縮發(fā)酵產(chǎn)物至密度為1.2即得煙草提取物。 0017實(shí)施例4固定化酶制劑處理煙草提取物原料按質(zhì)量比用15%果膠酶、1.0%酶穩(wěn)定劑、1.0%防腐劑和余量的水制成酶液；將宣紙剪成0.5cm的圓形紙片放入pH6.5磷酸鹽緩沖液中浸泡2h后取出，再放入酶液中40浸泡5h制成固定化酶制劑；將200g紅花大金元煙葉碎片加入4倍水滅菌后接入2.5g固定化酶制劑，混勻后45渥堆處理24h獲得處理產(chǎn)物；醋酸菌發(fā)酵培養(yǎng)醋酸菌種子液待用；將處理產(chǎn)物加入5倍水后接入醋酸菌種子液，醋酸菌種子液與處理產(chǎn)物的質(zhì)量比為5%，35培養(yǎng)40h獲得發(fā)酵產(chǎn)物；濃縮發(fā)酵產(chǎn)物至密度為1.3即得煙草提取物。 0018實(shí)施例5說(shuō)明書102894467A54/4頁(yè)6固定化酶制劑處理煙草提取物原料按質(zhì)量比用5%漆酶和余量的水制成酶液；將醋酸纖維剪成1.0cm的圓形紙片放入pH6.5磷酸鹽緩沖液中浸泡1.5h后取出，再放入酶液中45浸泡1.5h制成固定化酶制劑；將200g K326煙末加入3倍水滅菌后接入20g固定化酶制劑，混勻后20渥堆處理24h獲得處理產(chǎn)物；醋酸菌發(fā)酵培養(yǎng)醋酸菌種子液待用；將獲得的處理產(chǎn)物加入3.5倍水后接入醋酸菌種子液，醋酸菌種子液與處理產(chǎn)物的質(zhì)量比為3%，25培養(yǎng)80h獲得發(fā)酵產(chǎn)物即發(fā)酵液；濃縮發(fā)酵液至密度為1.1即得煙草提取物。 0019實(shí)施例6固定化酶制劑處理煙草提取物原料按質(zhì)量比用3%酯酶和余量的水制成酶液；將石棉紙剪成2.0cm的圓形紙片放入pH6.5磷酸鹽緩沖液中浸泡5h后取出，再放入酶液中30浸泡0.5h制成固定化酶制劑；將200g云煙87粉碎煙梗加入2倍水滅菌后接入5g固定化酶制劑，混勻后37渥堆處理36h獲得處理產(chǎn)物。 0020醋酸菌發(fā)酵培養(yǎng)醋酸菌種子液待用；將獲得的處理產(chǎn)物加入10倍水后接入醋酸菌種子液，醋酸菌種子液與處理產(chǎn)物的質(zhì)量比為3.5%，36培養(yǎng)30h獲得發(fā)酵液；濃縮發(fā)酵液至密度為1.2即得煙草提取物。 0021實(shí)施例7固定化酶制劑處理煙草提取物原料按質(zhì)量比用10%淀粉