pcr學(xué)習(xí)整理.doc

PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),又稱無細(xì)胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增技術(shù)。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需24分鐘，23小時就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。反應(yīng)體系與反應(yīng)條件標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系： 10擴(kuò)增緩沖液10ul 4種dNTP混合物各200umol/L 引物各10100pmol 模板DNA0.12ug TaqDNA聚合酶2.5u/ul Mg2+1.5mmol/L 加雙或三蒸水至100ul PCR反應(yīng)五要素：參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和緩沖液（其中需要Mg2+)標(biāo)準(zhǔn)的PCR過程分為三步： 1.DNA變性（90-96）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA 2.退火（25-65）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。 3.延伸（70-75）：在Taq酶（在72左右最佳的活性）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5端3 端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。 每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。 現(xiàn)在有些PCR因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時間內(nèi)復(fù)制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60-65間進(jìn)行，以減少一次升降溫過程，提高了反應(yīng)速度。實(shí)時定量PCR定量PCR是在PCR定性技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)。實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)利用熒光信號積累實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。閾值：在熒光的增長曲線上人為地設(shè)定一個值。標(biāo)準(zhǔn)偏差： (Std Dev) -統(tǒng)計(jì)學(xué)名詞。一種量度數(shù)據(jù)分布的分散程度之標(biāo)準(zhǔn)，用以衡量數(shù)據(jù)值偏離算術(shù)平均值的程度。標(biāo)準(zhǔn)偏差越小，這些值偏離平均值就越少，反之亦然。標(biāo)準(zhǔn)偏差的大小可通過標(biāo)準(zhǔn)偏差與平均值的倍率關(guān)系來衡量。標(biāo)準(zhǔn)偏差公式：本底：本底值是指沒有進(jìn)樣時檢測器的信號值.本底值大小和檢測器類型有關(guān)。熒光域值（threshold）：以PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，一般熒光域值定義為3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。Ct值：值得是實(shí)時監(jiān)測擴(kuò)增過程的熒光信號達(dá)到指數(shù)擴(kuò)增是的循環(huán)周期數(shù)。計(jì)算方式是以擴(kuò)增過程前的3到15個循環(huán)的熒光值的10倍標(biāo)準(zhǔn)差為閾值，當(dāng)熒光值超過閾值時的循環(huán)數(shù)則為閾值循環(huán)數(shù)（ct）.Ct值與樣本中的原始拷貝數(shù)成正比關(guān)系。絕對定量：是使用一系列稀釋的已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品與臨床標(biāo)本同時進(jìn)行測定，根據(jù)系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品的ct值與騎士模板（RNA或cDNA）量之間的線性比例關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?？梢缘玫侥硞€樣本中基因的拷貝數(shù)和濃度。相對定量：在相對定量中，標(biāo)本中特定mRNA的測定時建立在外標(biāo)或參比樣本（校準(zhǔn)品）的基礎(chǔ)上的。當(dāng)使用校準(zhǔn)品的時候，定量測定結(jié)果可表示靶RNA/校準(zhǔn)品比值。保準(zhǔn)品（standard）：用來構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線的已知濃度的樣本。Taqman探針是RNA探針。TaqMan 熒光探針是一種寡核苷酸探針，熒光基團(tuán)連接在探針的5末端，而淬滅劑則在3末端。PCR擴(kuò)增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，探針完整時，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時，Taq酶的53外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。常用的熒光基團(tuán)是FAM，TET，VIC，HEX。 而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個體化用藥分析的首選技術(shù)平臺。FAM是常用的熒光基團(tuán)，連接在Taqman探針的5末端TaqDNA聚合酶：從水生棲熱菌 Thermus Aquaticus（ Taq ）中分離出的具有熱穩(wěn)定性的DNA 聚合酶。對于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義，該酶可以耐受90以上的高溫而不失活，不需要每個循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡捷、同時也大大降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床。與一般酶不同,用Taq酶擴(kuò)增DNA時常使片段3端凸出一個A,應(yīng)注意.可在74復(fù)制DNA，在95仍具有酶活力。該酶可在離體條件下，以DNA為模板，延伸引物，合成雙鏈DNA。這個酶只有53DNA聚合酶活性和53的外切酶活性，缺少35的外切酶活性。TaqDNA聚合酶是Mg2+依賴性酶，該酶的催化活性對Mg2+濃度非常敏感.以活性程度 很低的鮭魚精子DNA為模板，dNTP的濃度為0.70.8mmol/L時，用不同濃度Mg2+進(jìn)行 PCR反應(yīng)10min，測定結(jié)果為Mgcl2濃度在2.0mmol/L時該酶催化活性最高，此濃度能最 大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性，Mg2+過高就抑制酶活性，當(dāng)Mgcl2濃度在 10mmol/L時可抑制4050%的酶活性.由于Mg2+能與dNTP結(jié)合而影響PCR反應(yīng)液中游離 的Mg2+濃度，因而Mgcl2的濃度在不同的反應(yīng)體系中應(yīng)適當(dāng)調(diào)整，優(yōu)化濃度.一般反應(yīng) 中Mg2+濃度至少應(yīng)比dNTP總濃度高0.51.0mmol/L.適當(dāng)濃度的KCL能使Taq DNA聚合 酶的催化活性提高5060%，其最適濃度為50mmol/L，高于75mmol/L時明顯抑制該酶 的活性PCR buffer：是PCR反應(yīng)的緩沖液的目的是給Taq DNA聚合酶提供一個最適酶催反應(yīng)條件。一般常用的10*PCR buffer的成分為：Tris-HCl pH8.5100mM、KCl 500nM、MgCl2 15nM質(zhì)粒：質(zhì)粒是細(xì)菌擬核裸露DNA外的遺傳物質(zhì)，為環(huán)形閉合的雙股DNA,存在于細(xì)胞質(zhì)中。質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中，它具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力，能在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù)，并表達(dá)所攜帶的遺傳信息。質(zhì)粒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄要依賴于宿主細(xì)胞編碼的某些酶和蛋白質(zhì)，如離開宿主細(xì)胞則不能存活。F質(zhì)粒(又稱F因子或性質(zhì)粒)、R質(zhì)粒(抗藥性因子)和Col質(zhì)粒(產(chǎn)大腸桿菌素因子)等都是常見的天然質(zhì)粒。陽性對照：找個原來P出來的模板這用來排除體系問題陰性對照：模板換水排除引物問題陽性對照就是加入你以前能克隆的得到條帶的引物和模板，這樣你就能知道你的體系是可以擴(kuò)出來東西的。而陰性對照就不一樣了，你可以不加引物，不加模板，或者不加其他體系中的東東，老看看你的體系有沒有污染，或者來檢測你的體系中哪一個東東污染了。這和內(nèi)參是不一樣的，不是一個概念。內(nèi)參一般是來做對照組，排除干擾的，或者是別的用途。陰性對照如果用水來做的話，別的東西都不加，這樣沒有意義。你的意思如果是體系中更沒有模板，而只有水和其他pcr體系中的東東，那么就可以檢測你的體系終是否存在其他的模板，可以檢測你的體系污染與否，但是這是一個綜合的指標(biāo)。我們一般做的陰性對照就是只加水，不加模板。pcr中內(nèi)參照基因：內(nèi)參就是對照基因，在PCR中，就是肯定能用PCR擴(kuò)增出來的基因，無論你要擴(kuò)增什么生物，比如你做的是真菌，都可以擴(kuò)的出來。陽性對照的目的，有兩個：一個是幫助你判斷你的PCR擴(kuò)增的過程中有沒有出現(xiàn)什么問題，比如說加樣過程中會不會漏加某些試劑，以判定你的PCR體系有沒有問題。另一方面，就是用來檢測你的目的蛋白的表達(dá)量。這個意思是說，內(nèi)參一般選用在很多組織和細(xì)胞中中都是穩(wěn)定表達(dá)的基因，比如actin,tublin，他們在整個生長過程中表達(dá)穩(wěn)定，因此，以他們作為參照，看你的目的蛋白表達(dá)量的多少。也就是說，條帶濃度低比內(nèi)參低，就是表達(dá)比內(nèi)參低，是一種半定量的標(biāo)準(zhǔn)。影響PCR的主要因素：溫度1.模板變性溫度是決定PCR反應(yīng)中雙鏈DNA解鏈的溫度，達(dá)不到變性溫度就不會產(chǎn)生單鏈DNA模板，PCR也就不會啟動。 2.引物退火溫度決定PCR特異性與產(chǎn)量；溫度高特異性強(qiáng)，過高引物不能與模板牢固結(jié)合，擴(kuò)增效率下降；溫度低產(chǎn)量高，過低可造成引物與模板錯配，非特異性產(chǎn)物增加。 3.引物延伸溫度溫度的選擇取決于Taq DNA聚合酶的最適溫度。循環(huán)次數(shù)常規(guī)PCR一般為2540個周期。 引物1.引物長度根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算，長約17個堿基的寡核苷酸序列在人的基因組中可能出現(xiàn)的機(jī)率的為1次。2.引物之間不應(yīng)發(fā)生互補(bǔ)，特別是在引物3端，即使無法避免，其3端互補(bǔ)堿基也不應(yīng)大于2個堿基，否則易生成“引物二聚體”或“引物二倍體”。 3.引物3端配對DNA聚合酶是在引物3端添加單核苷酸，所以，引物3端56個堿基與靶DNA的配對要求必須精確和嚴(yán)格，這樣才能保證PCR有效擴(kuò)增。 DNA聚合酶 1.引物3端配對DNA聚合酶是在引物3端添加單核苷酸，所以，引物3端56個堿基與靶DNA的配對要求必須精確和嚴(yán)格，這樣才能保證PCR有效擴(kuò)增。 2.影響酶活力的因素Taq酶的活力受Mg2+離子的影響。第二代耐熱DNA聚合酶Stoffel片段 。 3.RTth逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)展很快，所以對耐熱的依賴于RNA的DNA多聚酶的研究也有進(jìn)展。 單位換算：1摩爾（mol）1000毫摩爾(mmol)1毫摩爾(mmol)1000微摩爾(mol) 1微摩爾(mol) = 1000納摩爾（nmol）1納摩爾（nmol）=1000皮摩爾（pmol）引物在PCR反應(yīng)中的濃度一般在0.11mol/L之間。濃度過高易形成引物二聚體且產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。一般來說用低濃度引物經(jīng)濟(jì)、特異，但濃度過低，不足以完成30個循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)，則會降低PCR的產(chǎn)率。三磷酸腺苷（ATP）：ATP的立體結(jié)構(gòu)ATP可通過多種細(xì)胞途徑產(chǎn)生，最典型的如在線粒體中通過氧化磷酸化由ATP合成酶合成，或者在植物的葉綠體中通過光合作用合成。ATP合成的主要能源為葡萄糖和脂肪酸。每分子葡萄糖先在胞液中產(chǎn)生2分子丙酮酸同時產(chǎn)生2分子ATP，最終在線粒體中通過三羧酸循環(huán)產(chǎn)生最多36分子ATP。磷酸化：生物分子結(jié)合磷酸基團(tuán)的過程。磷酸化是將磷酸基團(tuán)加在中間代謝產(chǎn)物上或加在蛋白質(zhì)（protein）上的過程。磷酸基團(tuán)的添加或除去（去磷酸化）對許多反應(yīng)起著生物“開/關(guān)”作用。磷酸基團(tuán)的添加或除去能使酶（enzyme）活化或失活，控制諸如細(xì)胞分裂這樣的過程。 添加磷酸基團(tuán)的酶稱為激酶（kinases）；除去磷酸基團(tuán)的酶稱為磷酸酶。 磷酸化就是通過磷酸轉(zhuǎn)移酶在底物上加上一個磷酸基團(tuán)。 在生物方面： 磷酸化（英語：Phosphorylation）或稱磷酸化作用，是指在蛋白質(zhì)或其他類型分子上，加入一個磷酸（PO4）基團(tuán)，也可定義成“將一個磷酸基團(tuán)導(dǎo)入一個有機(jī)分子”。此作用在生物化學(xué)中占有重要地位。 蛋白質(zhì)磷酸化可發(fā)生在許多種類的氨基酸（蛋白質(zhì)的主要單位）上，其中以絲氨酸為多，接著是蘇氨酸。而酪氨酸則相對較少磷酸化的發(fā)生，不過由于經(jīng)過磷酸化之后的酪氨酸較容易利用抗體來純化，因此酪氨酸的磷酸化作用位置也較廣為了解。 除了蛋白質(zhì)以外，部分核苷酸，如三磷酸腺苷（ATP）或三磷酸鳥苷（GTP）的形成，也是經(jīng)由二磷酸腺苷和二磷酸鳥苷的磷酸化而來，此過程稱為氧化磷酸化。另外在許多糖類的生化反應(yīng)中（如糖解作用），也有一些步驟存在氧化磷酸化作用。受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase, RTKs) ：細(xì)胞表面一類具有細(xì)胞外受體結(jié)構(gòu)域、可使酪氨酸磷酸化的穿膜受體蛋白。具有細(xì)胞外受體結(jié)構(gòu)域的酪氨酸激酶，膜外信號物質(zhì)結(jié)合受體部分后激活其細(xì)胞內(nèi)的激酶活性域，從而對底物的酪氨酸殘基進(jìn)行磷酸化。在細(xì)胞信號的穿膜轉(zhuǎn)導(dǎo)中起作用。 各類受體酪氨酸激酶RTKs是最大的一類酶聯(lián)受體， 它既是受體，又是酶， 能夠同配體結(jié)合，并將靶蛋白的酪氨酸殘基磷酸化。所有的RTKs都是由三個部分組成的：含有配體結(jié)合位點(diǎn)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、單次跨膜的疏水螺旋區(qū)、含有酪氨酸蛋白激酶（RTK）活性的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。 已發(fā)現(xiàn)50多種不同的RTKs,主要的幾種類型包括： 表皮生長因子（epidermal growth factor, EGF） 受體； 血小板生長因子（platelet-derived growth factor, PDGF） 受體和巨噬細(xì)胞集落刺激生長因子（macrophage colony stimulating factor, M-CSF）； 胰島素和胰島素樣生長因子-1 （insulin and insulin-like growth factor-1, IGF-1） 受體； 神經(jīng)生長因子（nerve growth factor, NGF） 受體； 成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor, FGF） 受體； 血管內(nèi)皮生長因子（vascularendothelial growth factor, VEGF）受體和肝細(xì)胞生長因子 （hepatocyte growth factor, HGF） 受體等。 受體酪氨酸激酶在沒有同信號分子結(jié)合時是以單體存在的，并且沒有活性；一旦有信號分子與受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合，兩個單體受體分子在膜上形成二聚體，兩個受體的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的尾部相互接觸，激活它們的蛋白激酶的功能，結(jié)果使尾部的酪氨酸殘基磷酸化。磷酸化導(dǎo)致受體細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的尾部裝配成一個信號復(fù)合物（signaling complex）。剛剛磷酸化的酪氨酸部位立即成為細(xì)胞內(nèi)信號蛋白（signaling protein）的結(jié)合位點(diǎn)，可能有1020種不同的細(xì)胞內(nèi)信號蛋白同受體尾部磷酸化部位結(jié)合后被激活。信號復(fù)合物通過幾種不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，擴(kuò)大信息，激活細(xì)胞內(nèi)一系列的生化反應(yīng)；或者將不同的信息綜合起來引起細(xì)胞的綜合性應(yīng)答（如細(xì)胞增殖）。HER2：HER2是一種位于乳腺和乳腺癌細(xì)胞表面的受體，能夠控制癌細(xì)胞的生長、浸潤和癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，大約20的乳腺癌病例中HER2基因和/或蛋白水平增加，這些HER2陽性的腫瘤是一種高危腫瘤，對某些常規(guī)的化療和激素治療反應(yīng)性差，通常預(yù)后不好。為此，多種阻斷HER2的抗癌藥物相繼問世，其中目前最為常用并經(jīng)FDA批準(zhǔn)的此類藥物是曲妥珠單抗(赫賽汀)，適用于治療HER2過度表達(dá)的乳腺癌。由于這種藥物只有針對HER2基因擴(kuò)增和蛋白過度表達(dá)的病人才有效，因此準(zhǔn)確評價HER2基因和蛋白水平是至關(guān)