高中生物 專題5 DNA和蛋白質(zhì)技術(shù) 課題2 多聚酶鏈式反應擴增DNA片段課件 新人教版選修1.ppt

課題2多聚酶鏈式反應擴增dna片段 課題背景 在刑事偵破案件中常需要對樣品dna進行分析 pcr技術(shù)能快速擴增dna片段 在幾個小時內(nèi)復制出上百萬份的dna拷貝 有效地解決了因為樣品中dna含量太低而難以對樣品進行分析研究的問題 現(xiàn)在pcr技術(shù)已廣泛應用于遺傳病的診斷 刑偵破案 古生物學 基因克隆和基因測序 課題目標 1 理解pcr的原理和反應過程 2 嘗試pcr技術(shù)的基本操作 3 討論pcr技術(shù)的應用 pcr儀 以 dna復制 為背景材料 設(shè)計問題 導入新課 首先回顧dna的結(jié)構(gòu)和復制的有關(guān)知識 然后了解pcr技術(shù)的原理和應用 接著講解pcr技術(shù)的反應過程及具體實驗操作步驟 后以視頻觀看來再次學習實驗的知識點 最后通過課堂檢測完善所學內(nèi)容 通過對pcr反應過程的教學 應以讀圖識圖為主 教材中反應過程圖解詳細的描繪了參與pcr的各種組成成分 每一輪反應的三個基本步驟 變性 復性 延伸 每一步驟的作用 在教學中分析圖形的同時 結(jié)合教科書中的文字說明來加深理解 1 胞內(nèi)dna復制的基本體系 一 基礎(chǔ)知識 打開dna雙鏈 提供dna復制的模板 合成子鏈的原料 催化合成dna子鏈 使dna聚合酶能夠從引物的3 端開始連接脫氧核苷酸 一 pcr原理 2 dna雙鏈方向與復制關(guān)系 2 dna聚合酶只能從3 端延伸dna鏈 故dna復制需要引物 1 dna的羥基 oh 末端稱為3 端 而磷酸基團的末端稱為5 端 dna合成總是從子鏈的5 端向3 端伸 3 端 5 端 3 pcr原理 1 dna的熱變性原理 通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結(jié)合 變性 80 100 c的溫度范圍內(nèi) dna雙螺旋結(jié)構(gòu)解體 雙鏈分開 加熱變性 復性 溫度緩慢降低后 兩條彼此分離的dna鏈重新結(jié)合成雙鏈 緩慢冷卻復性 2 耐高溫的taqdna聚合酶 3 緩沖液為pcr反應提供的物質(zhì) dna模板 分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物 四種脫氧核苷酸 耐熱的dna聚合酶 同時通過控制溫度使dna復制在體外反復進行 方法點撥 細胞內(nèi)復制和pcr不同點 pcr過程需要的引物不是rna 而是人工合成的dna單鏈 其長度通常為20 30個脫氧核苷酸 pcr過程中dna的解旋不依靠解旋酶 而是通過對反應溫度的控制來實現(xiàn)的 二 pcr的反應過程 pcr一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán) 每次循環(huán)分為變性 復性和延伸三步 1 變性 溫度上升到90 以上時 雙鏈dna解旋為單鏈 2 復性 溫度下降到50 左右 兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈dna結(jié)合 溫度上升到72 左右 溶液中的四種脫氧核苷酸 a t c g 在dna聚合酶的作用下 根據(jù)堿基互補配對原則合成新的dna鏈 3 延伸 方法點撥 1 72 左右時 taqdna聚合酶有最大活性 可使dna新鏈由5 端向3 端延伸 2 dna聚合酶只能特異性地復制處于兩個引物之間的dna序列 使該段固定長度的序列呈 指數(shù)式 擴增 標準的pcr過程一般分為變性 復性 延伸三大步 這三大步需要的溫度依次是 a 92 50 72 b 72 50 92 c 50 92 72 d 80 50 72 欄目鏈接 典型例題 a 方法點撥 1 變性 溫度上升到90 90 96 以上時 雙鏈dna解旋為單鏈 2 復性 溫度下降到50 40 60 左右時 兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈dna結(jié)合 3 延伸 溶液中的四種脫氧核苷酸 a t c g 在taqdna聚合酶的作用下 根據(jù)堿基互補配對原則合成新的dna鏈 二 實驗操作 1 pcr儀 一 設(shè)備及用具 一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器 2 微量離心管 一種薄壁塑料管 總?cè)莘e為0 5ml 3 微量移液器 用于定量轉(zhuǎn)移pcr配方中的液體 其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次 1 準備 2 移液 二 實驗操作步驟 按照pcr反應體系的配方將所需用的試劑擺放在實驗桌上 用微量移液器按照pcr反應體系配方往微量離心管里面加入各種試劑 3 混合 過程 蓋嚴微量離心管口的蓋子 用手指輕輕彈擊管壁 注意 a 離心管口的蓋子一定蓋嚴 防止實驗中脫落或液體外溢 b 手指輕輕彈擊微量離心管的管壁 目的是使反應液混合均勻 4 離心 過程 將微量離心管放在離心機上 離心約10s 目的 使反應液體集中在離心管底部 提高反應效果 5 反應 將離心管放入pcr儀上 設(shè)置好pcr儀的循環(huán)程序 注意事項 避免外源dna等因素的污染 隔離操作區(qū) 所用微量離心管 槍頭 緩沖液以及蒸餾水等在使用必須進行高壓滅菌 分裝試劑 簡化操作程序 使用一次性槍頭 在pcr實驗操作中 下列說法不正確的是 a 在微量離心管中添加各種試劑時 只需一個槍頭b 離心管的蓋子一定要蓋嚴 防止液體外溢c 用手輕彈離心管壁的目的是使反應液充分混合d 離心的目的是使反應液集中在離心管部 提高反應效果 變式訓練 欄目鏈接 典型例題 a 3 離心10s的目的是使反應液集中在離心管部 提高反應效果 方法點撥 1 在微量離心管中添加各種試劑時 每吸取一種試劑后 移液器上的槍頭必須更換 以確保實驗的準確性 2 離心管的蓋子一定要蓋嚴 防止實驗中脫落或液體外溢 一 理論上dna擴增數(shù)目的計算 1 一條dna 復制n次 dna為2n 2 a條dna 復制n次 dna為a 2n 二 實驗中dna含量的測定 1 原理 可以通過計算dna含量來評價擴增的效果 dna在260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰 峰值的大小與dna的含量有關(guān) 三 課題成果評價 2 過程 稀釋 2ulpcr反應液 加入98ul蒸餾水 即將樣品進行50倍稀釋 對照調(diào)零 以蒸餾水作為空白對照 在波長260nm處 將紫外分光光度計的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零 計算 取dna稀釋液100ul至比色杯中 測定260nm處的光吸收值 計算 dna含量 g 50 x 260nm的讀數(shù) x稀釋倍數(shù) 50 1 g ml的dna在厚度為1cm比色杯中的吸光值為0 02 紫外分光度計 比色杯 四 課題延伸 pcr技術(shù)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù) 它具有特異 敏感 產(chǎn)率高 快速 簡便 重復性好 易自動化等突出特點 例如 pcr產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍 30輪循環(huán)擴增量達230個拷貝 109拷貝 課堂小結(jié) 一 pcr原理 1 變性 溫度上升到90 90 96 以上時 雙鏈dna解旋為單鏈 2 復性 溫度下降到50 40 60 左右時 兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈dna結(jié)合 3 延伸 溶液中的四種脫氧核苷酸 a t c g 在taqdna聚合酶的作用下 根據(jù)堿基互補配對原則合成新的dna鏈 二 pcr操作 1 準備 2 移液 3 混合 4 離心 5 反應 pcr過程與細胞內(nèi)的dna復制過程相比 主要有兩點不同 它們是 pcr過程需要的引物是人工合成的單鏈dna或rna pcr過程不需要dna聚合酶 pcr