銀屑病與亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)位點A677V關(guān)系的....doc

銀屑病與亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)位點A677V關(guān)系的研究銀屑病與亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)位點A677V關(guān)系的研究中華皮膚科雜志 1999年第2期第32卷 論著作者：楊維玲王曉慧鄭淑云孫智晶王柏秋傅松濱單位：楊維玲王曉慧鄭淑云150001 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院；孫智晶王柏秋傅松濱哈爾濱醫(yī)科大學(xué)生物遺傳學(xué)研究室關(guān)鍵詞：銀屑??；四氫葉酸脫氫酶；聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長度多態(tài)【摘要】目的探討銀屑病與亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)位點A677V的關(guān)系。方法采用聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長度多態(tài)性，檢測了3個銀屑病家系和39例銀屑病患者的亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)位點A677V。結(jié)果銀屑病患者亞甲基四氫葉酸還原酶不耐熱缺陷與正常人有顯著性差異。結(jié)論亞甲基四氫葉酸還原酶A677V突變型與銀屑病發(fā)病相關(guān)。Study on the Relationship Between Psoriasis and the PolymorphicSite A677V of Methylenetetrahydrofolate Reductase GeneYANG Weiling,WANG Xiaohui,ZHENG Shuyun,et al.Department of Dermatology, First Affiliated Hospital of Harbin Medical University , Harbin 150001【Abstract】ObjectiveTo investigate the relationship between polymorphic site A667V of 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) gene and psoriasis .Methods PCR -RFLP method was used to detect the polymorphism of MTHFR gene in 3 psoriasis pedigrees and 39 psoriatics.Results Genotype frequencies of the psoriastics were A/A-20.51, A/V=48.72 and V/V=30.76 ;the allelic frequencies were A=0.4487 and V=0.5513.Conclusion There is a significant difference of MTHFR gene thermolabile defect between the psoriatics and the control, and our results demonstrate MTHFR gene is related to A667V mutant.【Key words】 PsoriasisTetrahydrofolate dehydrogenasePCR-RFLP人亞甲基四氫葉酸還原（methylenetetrahydrofolate reductase， MTHFR)基因定位在1P36.3，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)嚴重的MTHFR缺陷與其不耐熱變化這兩種變異是由基因不同突變引起的，其中不耐熱MTHFR缺陷主要由MTHFR677密碼子中C被T置換引起，這種突變直接影響MTHFR的活性和耐熱性。已有報道腦血管、周圍血管、冠狀血管疾 病與MTHFR的不耐熱變化密切相關(guān)。再者亦有報道，銀屑病患者高血壓和冠心病的相對危險性分別是正常人群的15.4倍和11倍。基于上述，我們以PCRRFLP方法檢測了銀屑病患者的MTHFR基因多態(tài)位點A677V，旨在探討MTHFR基因多態(tài)位點A677V與銀屑病發(fā)病的關(guān)系。材料和方法1.血樣來源和基因組DNA提?。恒y屑病患者及其親屬共48例，其中男27例，女21例，靜脈采血56mL，枸緣酸鈉抗凝。應(yīng)用常規(guī)酚氯仿抽提法，提取外周血基因組DNA。2.MTHFR基因特定片段的擴增及 TapI 酶切反應(yīng)：應(yīng)用提取的患者及正常對照組的基因組DNA為模板，PCR擴增基因組DNA中MTHFR基因。PCR反應(yīng)總體積為30L，其中含模板200ng,TaqDNA聚合酶1.5U ，4dNTP50mol/L,引物各0.2mol/L, MgCl21.5mmol/L,Tris-HCl 20mmol/L(pH8.3),KCl 25mmol/L,0.05吐溫20。應(yīng)用美國PE公司DNA Thermal Cycler進行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件：94預(yù)變性5min；95 30s,62 30s，721min；72延長5min，PCR產(chǎn)物經(jīng)2瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，取10L PCR產(chǎn)物加入2U TaqI酶，10緩沖液2L , ddH2O 7.8L 65酶切15h，引物P1（NCO351）5- GAAGCAGGGAGCTTTGAGGC-3 ; P2(NCO352)5-CCCATGTCGGTGCATGCCTT-3。3.酶切產(chǎn)物電泳及檢測：取10L酶切產(chǎn)物與2L 6加樣緩沖液混合后上樣于12（交聯(lián)比=291）非變性聚丙烯酰胺凝膠，350V恒壓電泳34h后揭膠，AgNO3染色后觀察結(jié)果。結(jié)果1.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測包含MTHFR基因677密碼子的134bp片段PCR擴增產(chǎn)物。2.MTHFR677多態(tài)位點電泳圖譜：含MTHFR677多態(tài)位點的片段酶解后，可分出3種基因型，此位點原有C被T置換后，產(chǎn)生一個TaqI限制性酶切位點，野生型A677/A677序列中無TaqI限制性酶切位點，只見一條電泳帶，為134bp；雜合突變型A677/V677可見3條電泳帶，分別為134bp、75bp、59bp，純合突變型V677/V677可見2條電泳帶，分別為75bp、59bp。表1銀屑病患者亞甲基四氫葉酸還原酶A677V基因型頻與等位基因頻率組別例數(shù)基因型頻率等位基因頻率A/AA/VV/VAV患者一級親屬906333.33%66.67%銀屑病患者398191244.87%55.13%正常對照組7926431060.13%39.87%注：A：野生型，V：突變型銀屑病患者純合突變型（V/V）與正常對照組之間，經(jīng)2檢驗，P0.05，有顯著性差異；其突變型基因頻率（V）與正常對照組之間，經(jīng)t檢驗，P0.05，無顯著性差異?；颊咭患売H屬純合突變型（V/V）與正常對照組之間，經(jīng)2檢驗，P0.05，無顯著性差異；其突變型基因頻率（V）與正常對照組之間，經(jīng)t檢驗，P0.05，無顯著性差異。討論銀屑病是一種以角質(zhì)形成細胞過度增殖，不完全角化和炎癥為特點的慢性皮膚病。目前認為銀屑病是由多種因素（包括遺傳因素、環(huán)境因素、社會心理因素）共同作用引起的病理改變，其確切發(fā)病機制尚不清楚。本文從分子生物學(xué)角度，研究了銀屑病與MTHFR多態(tài)位點A677V的關(guān)系。結(jié)果表明，銀屑病患者存在MTHFR不耐熱缺陷，提示MTHFRA677V突變型與銀屑病發(fā)病有一定相關(guān)。本實驗對銀屑病與MTHFR基因多態(tài)位點A677V的相關(guān)性進行了初步研究，表明銀屑病與MTHFR基因多態(tài)位點A667V有一定的相關(guān)性。黑龍江省科委自然基金資助課題參考文獻1Goyette P, Sumner JS,Milos R, et al.Human methylenetetrahydrofolate reductase:isolation of a cDNA,mapping and mutation identification. Nature Genet,1994,7:195200.2Kang SS,Zhou J,Wong PWK, et al.Intermediate homocysteinemia:a thermolabile variant of methylenetetrahydrofolate reductase.Am J Hum Genet，1998,43 :414421.3Goyette P,Frost P, Rosenblatt DS, et al.Seven novel mutations in the methylenetetrahydrofolate reductase gene and genotype/phenotype correlations in severe methylenetetrahydrofolate reductase deficiency. Am J Hum Genet， 1995,56:10521059.4Kang SS,Wong PW, Susmano A, et al.Thermolabile methylenetetrahydrofolate reductase:an inherited risk factor for coronary artery disease. Am J Hum Genet,1991,48:536545.5Kang SS,Passen EL,Ruggie N,et al.Thermolabile de