慢病毒介導shRNA關(guān)節(jié)腔注射可加重骨關(guān)節(jié)炎的軟骨破壞.doc

www.CRTER.org楊二平，等. 慢病毒介導shRNA沉默關(guān)節(jié)腔注射可加重骨關(guān)節(jié)炎的軟骨破壞慢病毒介導shRNA關(guān)節(jié)腔注射可加重骨關(guān)節(jié)炎的軟骨破壞楊二平1，彭 飛2，梁 杰1，杜遠立1(1三峽大學人民醫(yī)院，宜昌市第一人民醫(yī)院，湖北省宜昌市 443000；2武漢大學人民醫(yī)院，湖北省武漢市 430060)引用本文：楊二平，彭飛，梁杰，杜遠立. 慢病毒介導shRNA關(guān)節(jié)腔注射可加重骨關(guān)節(jié)炎的軟骨破壞J.中國組織工程研究，2016，20(20):2979-2984.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.20.013 ORCID: 0000-0002-8538-3658(楊二平)文章快速閱讀：模型+shLRP1組(關(guān)節(jié)腔注射慢病毒)；骨關(guān)節(jié)炎模型組(關(guān)節(jié)腔注射陰性慢病毒)低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1對軟骨組織的作用陰性對照組；假手術(shù)組；楊二平，男，1972年生，湖北省蘄春縣人，漢族，2015年武漢大學畢業(yè)，博士，主治醫(yī)師，主要從事骨關(guān)節(jié)疾病研究。中圖分類號:R318文獻標識碼:A文章編號:2095-4344(2016)20-02979-06稿件接受：2016-03-09http:/WWW.制作骨關(guān)節(jié)炎模型分4組30 min/d觀察軟骨破壞程度和軟骨組織中基質(zhì)金屬蛋白酶13表達64只500 m每組16只造模2、4及6周處死各小組大鼠造模后5 d跑步結(jié)果說明：慢病毒介導的siRNA關(guān)節(jié)腔注射干擾抑制關(guān)節(jié)軟骨的低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1表達對關(guān)節(jié)軟骨有加重損傷的作用。文題釋義：低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白：能夠與多種結(jié)構(gòu)及功能各異的配體相互作用，不僅可以對血脂的動態(tài)平衡及纖溶功能的穩(wěn)定進行調(diào)節(jié)，而且能參與多種生長因子、細胞激酶生物學效應的發(fā)揮。慢病毒：慢病毒屬是反轉(zhuǎn)錄病毒科下的一個屬，包括8種能夠感染人和脊椎動物的病毒，原發(fā)感染的細胞以淋巴細胞和巨噬細胞為主，感染個體最終發(fā)病，顯著特點是感染個體在出現(xiàn)典型的臨床癥狀之前，大多經(jīng)歷長達數(shù)年的潛伏期之后緩慢發(fā)病，故被稱為慢病毒。摘要背景：最近研究表明低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白除了參與脂質(zhì)代謝外，還參與調(diào)節(jié)炎癥反應。目的：觀察慢病毒介導的低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1-shRNA對大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型軟骨破壞的影響，以及對軟骨組織中基質(zhì)金屬蛋白酶13表達的作用，初步判斷低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1對體內(nèi)實驗骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病進程中的作用。方法：SD大鼠64只分為4組，每組16只。對照組大鼠未做手術(shù)為陰性對照組。假手術(shù)組大鼠顯露關(guān)節(jié)腔后及關(guān)閉切口，不切斷交叉韌帶和半月板。模型+shLRP1組大鼠切斷前交叉韌帶切斷加內(nèi)側(cè)半月板部分切除制作骨關(guān)節(jié)炎模型，造模后2 d用慢病毒介導的siRNA關(guān)節(jié)腔注射，每周1次，連續(xù)2周。骨關(guān)節(jié)炎模型組，造模后關(guān)節(jié)腔注射陰性對照慢病毒。4組大鼠造模后5 d開始在自制的電動跑步機中跑步，每日跑步30 min，里程為500 m。造模2，4及6周處死各小組大鼠，觀察軟骨破壞程度和軟骨組織中基質(zhì)金屬蛋白酶13表達。結(jié)果與結(jié)論：大體和病理切片觀察發(fā)現(xiàn)：行關(guān)節(jié)腔注射慢病毒介導的siRNA抑制關(guān)節(jié)軟骨的低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1表達后，大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型中軟骨破壞加重，加速骨關(guān)節(jié)炎病程。6周時：模型+shLRP1組Mankins評分明顯高于其他3組(P 0.05)，模型+shLRP1組軟骨細胞基質(zhì)金屬蛋白酶13陽性率明顯高于其他3組(P 0.05)。結(jié)果說明：前叉韌帶切斷加內(nèi)側(cè)半月板部分切除并配合跑步機中慢跑鍛煉能再現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎模型。慢病毒介導siRNA關(guān)節(jié)腔注射可干擾抑制關(guān)節(jié)軟骨中的低密度脂3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 蛋白受體相關(guān)蛋白1表達，對關(guān)節(jié)軟骨有加重損傷的作用。關(guān)鍵詞：組織構(gòu)建；軟骨組織工程；骨關(guān)節(jié)炎；低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1；慢病毒；前交叉韌帶；關(guān)節(jié)腔注射；國家自然科學基金主題詞：骨關(guān)節(jié)炎；慢病毒屬；前交叉韌帶；組織工程基金資助：國家青年科學基金(61308110)縮略語：低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白：The lipoprotein receptor low-density lipoprotein receptor-related protein，LRPLentivirus-induced knockdown of low density lipoprotein receptor-related protein 1 aggravates cartilage damage in a rat model of osteoarthritisYang Er-ping1, Peng Fei2, Liang Jie1, Du Yuan-li1 (1Three Gorges University Peoples Hospital, Yichang First Peoples Hospital, Yichang 443000, Hubei Province, China; 2Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, China)AbstractBACKGROUND: Emerging evidence demonstrates that low density lipoprotein receptor-related protein 1 (LRP1) is involved in lipid metabolism and regulation of inflammatory reaction.OBJECTIVE: To explore the effect of lentivirus-induced knockdown of low density lipoprotein receptor-related protein 1 on cartilage damage and matrix metalloproteinase 13 in a rat model of osteoarthritis, so as to assess the role of low density lipoprotein receptor-related protein 1 in the pathogenesis of osteoarthritis.Yang Er-ping, M.D., Attending physician, Three Gorges University Peoples Hospital, Yichang First Peoples Hospital, Yichang 443000, Hubei Province, ChinaMETHODS: Sixty-four Sprague-Dawley rats were included and ramdomly divided into four groups (n=16 for each): negative control group, no surgery; sham-surgery group, only the articular cavity of the knee was exposed; osteoarthritis plus shLRP1 group, rat osteoarthritis models were established by cutting anterior cruciate ligament and removing the medial meniscus partly followed by an intra-articular injection of lentivirus-mediated siRNA at 2 days after surgery, once a week for 2 consecutive weeks; osteoarthritis group, an intra-articular injection of the negative control lentivirus was performed after surgery. Rats in the four groups started running on the self-made electric treadmill from 5 days after modeling, 30 minutes per day, totally 500 meters. Cartilage damage and matrix metalloproteinase 13 expression in cartilage tissues were determined at 2, 4, 6 weeks after surgery.RESULTS AND CONCLUSION: Gross and pathological observations showed that lentivirus-induced knockdown of low density lipoprotein receptor-related protein 1 aggravated cartilage damage in the rat model of osteoarthritis. At 6 weeks after surgery, Mankins score and matrix metalloproteinase 13 expression in the cartilage tissues in osteoarthritis plus shLRP1 group were significantly increased compared with other three groups (P 0.05). These findings indicate that a simulation model of osteoarthritis is developed by cutting anterior cruciate ligament and removing the medial meniscus partly combined with running on the treadmill. Lentivirus-induced knockdown of LRP1 aggravates cartilage damage in a rat model of osteoarthritisSubject headings: Osteoarthritis; Lentivirus; Anterior Cruciate Ligament; Tissue EngineeringFunding: the National Science Foundation for Young Scientists of China, No. 61308110Cite this article: Yang EP, Peng F, Liang J, Du YL. Lentivirus-induced knockdown of low density lipoprotein receptor-related protein 1 aggravates cartilage damage in a rat model of osteoarthritis. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(20):2979-2984.2981ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction目前骨關(guān)節(jié)炎的病因及發(fā)病機制尚未完全明確。研究顯示白細胞介素1和腫瘤壞死因子作用于軟骨細胞干擾軟骨細胞合成和分解代謝平衡，分解代謝增強，軟骨細胞分泌多種基質(zhì)降解酶1。與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的炎癥遞質(zhì)中，腫瘤壞死因子被認為是軟骨退變關(guān)鍵的炎性調(diào)節(jié)因子，腫瘤壞死因子促進滑膜細胞和軟骨細胞表達炎性因子和趨化因子并維持局部炎性因子。最近研究表明低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(The lipoprotein receptor low- density lipoprotein receptor-related protein，LRP)除了參與脂質(zhì)代謝外，還參與調(diào)節(jié)炎癥反應2-3。因此，LRP被認為有可能參與調(diào)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病進程。而骨關(guān)節(jié)炎是機械負荷因素和體內(nèi)細胞環(huán)境因素相互作用下關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的合成和分解代謝不平衡結(jié)果，體外實驗骨關(guān)節(jié)炎動物模型目的是再現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的病理過程，模擬力學因素和生物學因素對軟骨組織的影響。構(gòu)建骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型后，將細胞實驗證明能有效敲低表達LRP1的慢病毒注入造模側(cè)關(guān)節(jié)腔內(nèi)，觀察6周，觀察期內(nèi)每天給予必要的機械負荷刺激并評價大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型軟骨組織的破壞程度，判斷LRP1對軟骨組織的作用。圖1 大鼠在電動跑步機跑步訓練Figure 1 Rats ran on the electric treadmill for exercise圖注：跑步機轉(zhuǎn)速為8.5 m/min，大鼠每日跑步里程為500 m，無不良反應。DCBA圖2 各組大鼠造模后6周關(guān)節(jié)組織蘇木精-伊紅染色(鏡下觀察，100)Figure 2 Hematoxylin and eosin staining of articular cartilage tissue in each group at 6 weeks after surgery (100)圖注： 圖A為對照組；B為假手術(shù)組；C為骨關(guān)節(jié)炎模型組；D為模型+shLRP1組。DCBA圖3 各組大鼠造模后6周關(guān)節(jié)組織番紅固綠染色(鏡下觀，100)Figure 3 Safranin-O and fast green staining of articular cartilage tissue in each group at 6 weeks after surgery (100)圖注：圖A為對照組；B為假手術(shù)組；C為骨關(guān)節(jié)炎模型組；D為模型+shLRP1組。DCBA圖5 各組大鼠造模后2周膝關(guān)節(jié)軟骨組織免疫組織化學病理切片(鏡下觀，200)Figure 5 Matrix metalloproteinase 13 immunoreactivity in articular cartilage tissue in each group at 2 weeks after surgery (200)圖注：圖A為對照組；B為假手術(shù)組；C為骨關(guān)節(jié)炎模型組；D為模型+shLRP1組。對照組骨關(guān)節(jié)炎模型組模型+ shLRP1組a基質(zhì)金屬蛋白酶MMP13(%)806040200a假手術(shù)組Mankins 評分151050a對照組 假手術(shù)組 骨關(guān)節(jié)炎模型組 模型+shLRP1圖6 各組大鼠造模后2周軟骨細胞基質(zhì)金屬蛋白酶13陽性率比較Figure 6 Quantification of matrix metalloproteinase 13 immunoreactivity in articular cartilage tissue in each group at 2 weeks after surgery圖注：取任意方向的3個視野內(nèi)陽性細胞個數(shù)的平均值。模型+shLRP1組軟骨細胞基質(zhì)金屬蛋白酶13陽性率明顯高于其他3組(aP 0.05)。2周 4周 6周圖4 各組大鼠Mankins評分情況Figure 4 Mankins scores in rats in each group圖注：4周時模型+shLRP1組評分高于對照組和假手術(shù)組；6周時模型+shLRP1組明顯高于其他3組(P 0.05)。關(guān)節(jié)腔注射shLRP1會加重軟骨磨損。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 設計 分組對照觀察。1.2 時間及地點 實驗于2014年6至11月在武漢大學人民醫(yī)院動物實驗中心完成。1.3 材料 實驗動物：健康雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠64只，體質(zhì)量150-200 g，由武漢大學實驗動物中心提供，分籠飼養(yǎng)每籠5只，自由飲食。以慢病毒為載體的shRTNA由上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司構(gòu)建。1.4 實驗方法1.4.1 大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型的建立 雄性SD大鼠64只隨機分為4組，每組16只，其中2組制作骨關(guān)節(jié)炎模型將髕骨推向外側(cè)，膝關(guān)節(jié)屈曲位，顯露內(nèi)側(cè)半月板和前交叉韌帶，切斷前交叉韌帶附著點，切除內(nèi)側(cè)半月板前l(fā)/3部分；16只對照組大鼠為未做手術(shù)陰性對照組；16只假手術(shù)組大鼠顯露關(guān)節(jié)腔后及關(guān)閉切口，不切斷交叉韌帶和半月板。16只造模大鼠為模型+shLRP1組術(shù)后2 d用慢病毒介導的siRNA關(guān)節(jié)腔注射(20 L，1108 TU/mL)，每周1次，連續(xù)2周。16只為骨關(guān)節(jié)炎模型組，造模后關(guān)節(jié)腔注射陰性對照慢病毒。4組大鼠術(shù)后5 d開始在自制的電動跑步機中跑步，每日跑步30 min，里程為500 m。1.4.2 關(guān)節(jié)軟骨大體觀和軟骨組織病理學觀察 各組大鼠骨關(guān)節(jié)炎造模后切口愈合良好，造模2，4及6周處死各小組大鼠5只，打開造模側(cè)關(guān)節(jié)腔，觀察造模側(cè)股骨髁及脛骨平臺的病理改變，并行軟骨組織蘇木精-伊紅和番紅快綠染色。按改良Mankin評分標準對各組股骨髁磨損程度評分1，此改良評分結(jié)合大體觀察和鏡下軟骨組織和滑膜組織病變等級評分：0-15分。蘇木 精-伊紅染色和番紅快綠染色檢測軟骨組織膠原蛋白和纖維組織，紅色代表膠原纖維，綠色代表鈣化的炎性纖維組織。軟骨組織病理改變分0-4級(按鈣化炎性纖維組織侵犯程度)：0級為正常；1級為軟骨表面少許纖維增生；2級為表層和中層軟骨組織破壞，伴有纖維組織增生，軟骨細胞排列紊亂，軟骨基質(zhì)破壞；3級為破壞達深層，纖維化組織代替軟骨組織，可見少許軟骨細胞及基質(zhì)；4級為破壞達軟骨下骨伴有鈣化。1.4.3 軟骨組織免疫組織化學染色基質(zhì)金屬蛋白酶13陽性細胞計數(shù) 染色成功后的切片置于正置顯微鏡下(Olympus IX70)觀察拍片,使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析計數(shù)陽性細胞，取任意方向的3個視野內(nèi)陽性細胞個數(shù)的平均值。1.5 主要觀察指標 各組大鼠軟骨組織病理學觀察及評分。軟骨組織免疫組織化學染色基質(zhì)金屬蛋白酶13陽性細胞計數(shù)。1.6 統(tǒng)計學分析 計量實驗數(shù)據(jù)以s表示，采用方差分析進行統(tǒng)計學處理，P 0.05表示差異有顯著性意義。2 結(jié)果 Results2.1 實驗動物數(shù)量分析 實驗選用大鼠64只，分為4組，實驗過程中無脫失，全部進入結(jié)果分析。2.2 大鼠骨關(guān)節(jié)炎生物力學模型的建立 每組大鼠在電動跑步機跑步訓練，跑步機轉(zhuǎn)速為8.5 m/min，大鼠每日跑步里程為500 m。在6周的觀察期內(nèi)各組大鼠均能適應跑步機，完成每天的跑步里程無不良反應(見圖1)。2.3 各組大鼠軟骨組織病理學評分 每組大鼠分別于造模后2，4和6周麻醉處死，對參與關(guān)節(jié)大體觀評分與病理切片鏡下觀察的評估人員采用盲法原則，評分者事先不知道實驗的分組情況。 對照組和假手術(shù)組關(guān)節(jié)軟骨面光滑，色澤明亮無明顯關(guān)節(jié)積液及滑膜增生，關(guān)節(jié)軟骨面光滑，色澤明亮。骨關(guān)節(jié)炎模型組和模型+shLRP1組2周時，2組大鼠的造模關(guān)節(jié)開始出現(xiàn)關(guān)節(jié)積液、輕度滑膜增生，內(nèi)側(cè)髁股骨關(guān)節(jié)軟骨面出現(xiàn)輕微的黃色班點。模型+shLRP1組除了以上表現(xiàn)外，軟骨表面出現(xiàn)斑點狀出血灶和粗糙的纖維增生；4周時，對照組和假手術(shù)組關(guān)節(jié)表面光滑。骨關(guān)節(jié)炎模型組和模型+shLRP1組造模關(guān)節(jié)出現(xiàn)關(guān)節(jié)積液增多和滑膜增生，關(guān)節(jié)面粗糙以股骨內(nèi)側(cè)髁關(guān)節(jié)面為甚，關(guān)節(jié)面有炎性纖維組織覆蓋。骨關(guān)節(jié)炎模型組表層軟骨斑點狀磨損，而模型+shLRP1組磨損波及軟骨中層，磨損軟骨周圍有纖維組織增生；6周時，全部造模關(guān)節(jié)滑膜增生明顯，骨關(guān)節(jié)炎模型組關(guān)節(jié)面磨損波及中層伴有大量纖維增生附著，模型+shLRP1組軟骨磨損可波及深層，嚴重者可見裸露的軟骨下骨，部位仍以內(nèi)側(cè)髁關(guān)節(jié)面為主，在6周時部分伴有骨贅形成。為了觀察敲低LRP1后對骨關(guān)節(jié)炎的病程最終影響，取4組大鼠造模后6周處死后的股骨內(nèi)髁標本行蘇木精-伊紅染色和番紅固綠染色。蘇木精-伊紅染色后的對照組和假手術(shù)組關(guān)節(jié)切片提示兩組軟骨磨損不明顯，骨關(guān)節(jié)炎模型組軟骨磨損波及軟骨組織中層，伴有大量纖維組織增生覆蓋。番紅固綠染色提示軟骨層變薄，表面有大量染成綠色的膠原纖維增生；模型+shLRP1組軟骨組織磨損波及深層，大量炎性纖維組織覆蓋，部分軟骨組織被纖維化，番紅固綠染色提示大量染成綠色的膠原纖維增生和軟骨鈣化表現(xiàn)，部分波及軟骨下骨，軟骨層進一步變薄。Mankins 評分模型+shLRP1組明顯高于其他3組。這些改變提示模型+shLRP1組符合骨關(guān)節(jié)炎晚期表現(xiàn)(見圖2-4)。2.4 軟骨組織免疫組織化學染色基質(zhì)金屬蛋白酶13陽性細胞計數(shù) 4組大鼠造模后2周，膝關(guān)節(jié)軟骨組織免疫化學病理切片鏡下觀，軟骨細胞基質(zhì)金屬蛋白酶13陽性率比較。取任意方向的3個視野內(nèi)陽性細胞個數(shù)的平均值。模型+shLRP1組軟骨細胞基質(zhì)金屬蛋白酶13陽性率明顯高于其他3組，差異有顯著性意義(P 0.05)，見圖5，6。3 討論 Discussion低密度脂蛋白相關(guān)蛋白是已知的具有內(nèi)吞作用的受體之一，它不僅參與識別和內(nèi)吞脂質(zhì)，而且能識別大量非脂質(zhì)體，包括LRP-1通過膠原酶3受體來調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶家族水平，膠原酶3受體為膜受體內(nèi)吞基質(zhì)金屬蛋白酶132。作者假設關(guān)節(jié)軟骨細胞LRP1低表達時會加重骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠的關(guān)節(jié)炎進展。因此，實驗通過關(guān)節(jié)腔注射慢病毒介導的RNAi技術(shù)實現(xiàn)對關(guān)節(jié)軟骨細胞LRP1表達降低，能否加重大鼠骨關(guān)節(jié)炎。為了實現(xiàn)對軟骨細胞的LRP1的降低，利用成功構(gòu)建的含有目的靶點的干擾RNA。用慢病毒為載體的RNAi 技術(shù)以MOI值為20時成功敲低軟骨細胞LRP1的表達。成功轉(zhuǎn)染的軟骨細胞能維持低表達LRP1約14 d3-4。為了維持在本觀察期內(nèi)關(guān)節(jié)軟骨細胞能持續(xù)低表達LRP1，連續(xù)2周用慢病毒注射關(guān)節(jié)腔，每周2次。在觀察期內(nèi)，大鼠未見明顯異常反應。為了進一步闡述LRP1在骨關(guān)節(jié)炎中的作用，作者選擇前叉韌帶切斷加內(nèi)側(cè)半月板前1/3切除誘導大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型。同時，為了每天給予力學因素刺激關(guān)節(jié)軟骨，造模后的大鼠在跑步機中爬行。適當?shù)牧W負荷刺激是調(diào)節(jié)軟骨細胞代謝活動的基本要素，它能維持軟骨細胞外基質(zhì)的正常性能。過度的機械負荷有助于加重軟骨的退變5-7。在實驗中，對照組和假手術(shù)組爬行訓練后的2，4，6周的關(guān)節(jié)大體觀中未見到軟骨表面磨損，且組織切片蘇木精-伊紅染色也未見軟骨組織磨損，因此，在跑步機中每天500 m的爬行距離對于大鼠來說是合適的。經(jīng)過6周的爬行活動后，骨關(guān)節(jié)炎模型組和模型+ shLRP1組蘇木精-伊紅染色提示兩組軟骨組織均有不同程度的磨損，但模型+shLRP1組軟骨組織磨損波及軟骨下骨。對照組和假手術(shù)組大鼠6周的番紅固綠染色未見明顯的軟骨組織成分改變，而骨關(guān)節(jié)炎模型組和模型+shLRP1組提示軟骨層變薄，表面有大量染成綠色的膠原纖維增生，模型+shLRP1組軟骨組織磨損波及深層，大量炎性纖維組織覆蓋，部分軟骨組織被纖維化，大量染成綠色的膠原纖維增生和軟骨鈣化表現(xiàn)，部分波及軟骨下骨，軟骨層進一步變薄。由前叉韌帶切斷術(shù)加內(nèi)側(cè)半月板前1/3切除術(shù)誘導骨關(guān)節(jié)炎模型一般需8周時間8，在實驗中骨關(guān)節(jié)炎模型組在6周時出現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎樣改變，并且模型+shLRP1組在造模后6周出現(xiàn)磨損的軟骨組織表面增生的纖維組織鈣化。實驗結(jié)果提示作為炎癥抑制因子，LRP1在骨關(guān)節(jié)炎早期病變中也許更具有保護作用延緩骨關(guān)節(jié)炎病程。 LRP1調(diào)控細胞生存、炎癥反應，也可以調(diào)控細胞外基質(zhì)蛋白水解，生長因子活性甚至免疫反應9。絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases， MAPKs)是膠原酶降解膠原蛋白機制之一10-14，敲低LRP1會激活絲裂原激活的蛋白激酶途徑，因此，LRP1也許是重要的軟骨代謝調(diào)節(jié)因子。關(guān)節(jié)軟骨組織生長是動態(tài)合成和分解代謝平衡過程，而炎性細胞，滑膜成纖維細胞和軟骨細胞產(chǎn)生的促炎性因子(腫瘤壞死因子和白細胞介素1破壞這種平衡15。在前叉韌帶切斷誘導的大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型中和骨關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)滑液中能檢測到促炎因子水平升高16-18。軟骨細胞是腫瘤壞死因子和白細胞介素1作用的靶細胞，能抑制軟骨細胞的合成代謝及細胞外基質(zhì)的合成和激活分解代謝。模型+shLRP1組在4周時表現(xiàn)出軟骨磨損伴有大量纖維組織增生，在6周時增生的膠原纖維鈣化，很少有活性細胞。細胞外基質(zhì)的降解是伴隨著活性軟骨細胞減少，這符合骨關(guān)節(jié)炎的慢性基質(zhì)重塑的特點19。軟骨細胞合成胞外基質(zhì)蛋白多糖和膠原蛋白維持軟骨的機械強度和韌性，LRP1能抑制腫瘤壞死因子誘導的炎癥反應主要是通過抑制細胞核因子B通路和MAPKs通路20。通過這兩個信號途徑，LRP1能下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶13的表達，基質(zhì)金屬蛋白酶13主要降解軟骨組織型膠原和蛋白多糖。免疫組織化學染色分析提示在2周時的模型+shLRP1組基質(zhì)金屬蛋白酶13表達水平明顯增加。 研究表明，在骨關(guān)節(jié)炎早期的動物模型中，具有抗炎作用的LRP1對骨關(guān)節(jié)炎的軟骨具有保護作用。這一發(fā)現(xiàn)也許為骨關(guān)節(jié)炎臨床治療提供新的思路。作者貢獻：第一作者負責設計和實施，第二作者負責實施及文章的修改。利益沖突：所有作者共同認可文章內(nèi)容不涉及相關(guān)利益沖突。倫理問題：實驗均經(jīng)武漢大學人民醫(yī)院醫(yī)學倫理部門審核并批準。實驗動物在戊巴妥納麻醉下進行所有的手術(shù)，并盡一切努力最大限度地減少其疼痛、痛苦和死亡。文章查重：出版前已經(jīng)過CNKI反剽竊文獻檢測系統(tǒng)進行3次查重。文章外審：文章經(jīng)國內(nèi)小同行外審專家雙盲外審，符合本刊發(fā)稿宗旨。作者聲明：第一作者對研究和撰寫的論文中出現(xiàn)的不端行為承擔責任。論文中涉及的原始圖片、數(shù)據(jù)(包括計算機數(shù)據(jù)庫)記錄及樣本已按照有關(guān)規(guī)定保存、分享和銷毀，可接受核查。文章版權(quán)：文章出版前雜志已與全體作者授權(quán)人簽署了版權(quán)相關(guān)協(xié)議。4 參考文獻 References1 Lee YJ, Park JA, Yang SH, et al. 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