神經(jīng)干細胞的研究現(xiàn)狀與應用前景(1).ppt

神經(jīng)干細胞的研究現(xiàn)狀與應用前景 龍躍生2008年9月26日 主要內容 基本知識神經(jīng)干細胞的定義 特點 標志 分布及分化因素等基本知識成年神經(jīng)干細胞的研究現(xiàn)狀研究方法神經(jīng)干細胞的來源 分離 培養(yǎng)及鑒定方法應用前景神經(jīng)干細胞技術在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中的應用神經(jīng)干細胞與神經(jīng)心理學 基本知識 干細胞 Stemcell SC 是一類具有自我更新 self renewing 能力的多潛能細胞 即干細胞保持未定向分化狀態(tài)和具有增殖能力 在合適的條件或給予合適的信號 它可以分化成多種功能細胞或組織器官 醫(yī)學界稱其為 萬用細胞 也有人通俗而形象地稱其為 干什么都行的細胞 干細胞來源于胚胎 胎兒組織和成年組織如骨髓 臍帶等 干細胞技術最顯著的作用就是 能再造一種全新的 正常的甚至更年輕的細胞 組織或器官 干細胞技術是近年現(xiàn)代生物科技繼克隆技術 基因工程之后的第三大科學成就 它不僅促使人們重新熟悉細胞生長與分化的基本生命原理 也為多種難治性疾病的治療帶來了劃時代的革命 21世紀是生命科學的時代 也是為人類的健康長壽創(chuàng)造世界奇跡的時代 干細胞的應用將有廣闊前景 干細胞的概念 神經(jīng)干細胞的定義 1989年 Temple等從13天大鼠胚胎腦隔區(qū)取出細胞進行培養(yǎng) 發(fā)現(xiàn)這些細胞發(fā)育成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞 其后從成年鼠紋狀體 海馬齒狀回等處分離出能在體外不斷增殖 并具有向神經(jīng)元和星形膠質細胞分化潛能的細胞群 20世紀90年代后 許多實驗都證實 人腦內也同樣存在神經(jīng)干細胞 目前得到普遍認可的神經(jīng)干細胞的概念是由Mckay在1997年提出的 神經(jīng)干細胞 neuralstemcell NSC 是指具有分化為神經(jīng)元 星形膠質細胞和少突膠質細胞的能力 能自我更新并能提供大量腦組織細胞的細胞群 Okanoetal 2002 神經(jīng)干細胞的分化 增殖及其影響因素 1 生長因子 FGF 2 堿性成纖維細胞生長因子 2 在胚胎早期維持神經(jīng)祖細胞的的生存 促進其增殖 ECG 神經(jīng)表皮生長因子 在發(fā)育較晚期促使神經(jīng)祖細胞增殖和分化 BDNF 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 及IGF1 胰島素樣生長因子1 主要促進祖細胞向神經(jīng)元方向分化 2 細胞因子 紅細胞生成素 集落刺激因子 白介素家族等影響神經(jīng)元的發(fā)育 BMP 骨架多型性蛋白 促進神經(jīng)干細胞向星形膠質細胞方向分化 3 移植區(qū)域的信號 一是選擇性調控 即信號只能調節(jié)干細胞的存活和增殖而不能影響其分化方向 二是指導性作用 指特異性指導神經(jīng)干細胞 祖細胞向特定譜系分化 4 神經(jīng)干細胞和神經(jīng)祖細胞自身產(chǎn)生多種調控信號 5 Nestin基因和Notch基因 人nestin基因第二個內含子中存在一個 400bp區(qū)域 對神經(jīng)干細胞起增強作用 這個增強子也對早期神經(jīng)干細胞其他基因表達起作用 包括Notch基因 Notch基因是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中確定神經(jīng)元數(shù)量的重要調控基因 神經(jīng)干細胞的形態(tài) 神經(jīng)干細胞的特征 有增殖能力 有自我維持和自我更新能力 對稱分裂后形成的兩個子細胞為干細胞 不對稱分裂后形成的兩個子細胞中的一個為干細胞 另一個為祖細胞 祖細胞在特定條件下可分化為多種神經(jīng)細胞 具有多向分化潛能 在不同因子下 可以分化成不同類型的神經(jīng)細胞 損傷或疾病可以刺激神經(jīng)干細胞分化 自我更新能力和多向分化潛能是神經(jīng)干細胞的兩個基本特征 神經(jīng)干細胞的分類 神經(jīng)管上皮細胞 1 根據(jù)分化潛能及產(chǎn)生子細胞種類不同分為 放射狀膠質神經(jīng)元 神經(jīng)母細胞 大腦中皮質及神經(jīng)核等的基本神經(jīng)組織細胞 神經(jīng)前體細胞 各類神經(jīng)膠質細胞 神經(jīng)元 各類神經(jīng)細胞的前體細胞 胚胎期 幼年期 成年期 2 根據(jù)部位分類主要有兩類 神經(jīng)嵴干細胞 neuralcreststemcell NC SC 和中樞神經(jīng)干細胞 CNS SC NCSC為外周神經(jīng)干細胞 PNS SC 既可發(fā)育為外周神經(jīng)細胞 神經(jīng)內分泌細胞和Schwann氏細胞 也能分化為色素細胞 pigmentedcell 和平滑肌細胞等 NSC一般是指存在于腦部的中樞神經(jīng)干細胞 CNS SC 其子代細胞能分化成為神經(jīng)系統(tǒng)的大部分細胞 胚胎期 神經(jīng)干細胞主要分布在大腦的皮層 紋狀體 海馬 室管膜下層和中腦等區(qū)域 成年期 中樞神經(jīng)系統(tǒng)仍有神經(jīng)干細胞存在 只不過這些細胞平時處于靜止狀態(tài) 成年腦區(qū)神經(jīng)干細胞主要局限在海馬齒狀回 紋狀體和環(huán)繞側腦室的室腦膜下層 神經(jīng)干細胞的分布 海馬齒狀回 側腦室的室腦膜下層 尾狀核 豆狀核 背側丘腦 皮質 髓質 基底核 側腦室 尾狀核與豆狀核合稱紋狀體 成年神經(jīng)干細胞的研究現(xiàn)狀 以前的觀點認為成年大腦中的神經(jīng)元數(shù)量是穩(wěn)定不變的 由這些神經(jīng)元構成的神經(jīng)網(wǎng)絡結構是相對穩(wěn)定的 神經(jīng)結構上的可塑性僅發(fā)生在樹突 軸突和突觸等部位 而目前對神經(jīng)再生和成年神經(jīng)干細胞的研究增加了新的認識 成年神經(jīng)干細胞的功能 小結 成年海馬的神經(jīng)再生與海馬功能有著密切關系 學習或奔跑可以改變動物海馬細胞存活或細胞增殖水平 從而增加海馬的新生神經(jīng)元的數(shù)目 緊張 濫用鴉片和癲癇發(fā)作等都可以影響到成年海馬齒狀回新生神經(jīng)元的增殖和分化水平 人為減少海馬顆粒樣神經(jīng)元的數(shù)目 經(jīng)過處理后的動物其海馬依賴的記憶功能受到損害 成年海馬神經(jīng)干細胞產(chǎn)生的新生神經(jīng)元不僅在形態(tài)上與成熟海馬神經(jīng)元相同 而且對突觸刺激有動作電位反應 并且可以有效地整合到神經(jīng)環(huán)路中去 人們推測 這些由神經(jīng)干細胞產(chǎn)生的新生神經(jīng)元是參與其所在海馬區(qū)域的正常功能 神經(jīng)干細胞和學習記憶關系的研究是復雜的 盡管海馬具有記憶的存儲功能 但這種記憶的存儲是短暫的 只是為皮層區(qū)域的長時程記憶做時空上的準備 成年神經(jīng)干細胞對腦損傷的修復作用 control kindled ExamplesofBrdUpositivenucleiinhippocampalsectionsfromcontrol 正常情況下 成年嚙齒類動物大腦中有大量的新生神經(jīng)元不斷產(chǎn)生 顯然這些細胞是來補充已經(jīng)缺失的神經(jīng)元 這樣成年大腦神經(jīng)元數(shù)目才能保持相對穩(wěn)定 研究表明在成年大腦神經(jīng)再生區(qū)域里存在著普遍的神經(jīng)元凋亡現(xiàn)象 神經(jīng)再生活躍區(qū)域的死亡細胞數(shù)倍于大腦其他部位 因而干細胞增殖 祖細胞遷徙并且分化成神經(jīng)元從而替代死亡的神經(jīng)元 有人推測 中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病形成的原因就是由于內源性神經(jīng)干細胞不能對這些疾病產(chǎn)生的信號起反應 內源性神經(jīng)干細胞不能替代變性的神經(jīng)元 而最終導致老年性疾呆 癲癇 精神分裂癥等神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的發(fā)生 成年神經(jīng)干細胞導常可能導致疾病發(fā)生 1 成年神經(jīng)再生和早期發(fā)育中的神經(jīng)生成有哪些不同 2 為什么神經(jīng)再生只存在于成年大腦的某些特定的區(qū)域 3 這些區(qū)域的局部微環(huán)境對成年神經(jīng)干細胞的遷徙和分化有些什么影響 4 成年大腦的神經(jīng)可塑性的功能意義 5 神經(jīng)干細胞和認知等高級功能神經(jīng)活動的關系 成年神經(jīng)干細胞研究面臨的問題 研究方法 來源于神經(jīng)組織 目前從哺乳動物胚胎期大部分腦區(qū) 成年期的腦室下區(qū) 海馬回的顆粒下層 脊髓等部位均成功分離出神經(jīng)干細胞來源于胚胎 胚胎干細胞 embryonicstemcells ESCs 胚胎生殖細胞 embryonicgermcells EGCs 等細胞的定向誘導分化而來 來源于血液系統(tǒng) 骨髓間質干細胞 bonemarrowmesenchymalstemcells MSCs 成年多能祖細胞 multipotentadultprogenitorcells MAPCs 10 及臍血細胞 umbilicalcordblood 11 來源于永生化細胞系 C17 2細胞系 12 MHP36細胞系 13 NT2細胞系 體核細胞轉移技術獲得神經(jīng)干細胞 將體細胞核植入去核的卵母細胞漿中 再程序化后形成治療性克隆 讓其發(fā)育到一定階段后在相應部位獲得神經(jīng)干細胞 可重建組織相容性 神經(jīng)干細胞的來源 1 反復傳代法 取3 4個月齡的人胚胎紋狀體或孕14 16天小鼠 大鼠胚胎大腦 機械分離制作單細胞懸液 在含多種神經(jīng)因子的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng) 實現(xiàn)NSC的體外穩(wěn)定有效擴增 經(jīng)過長期培養(yǎng)反復傳代可使NSC得到純化 2 流式細胞術 Sasaki等采用流式細胞儀對約60種細胞表面抗原進行篩選 結果發(fā)現(xiàn)分選出的具有CD133 CE34 CD45 細胞表面抗原 的細胞為NSC 3 基因轉導 Keyoung等利用腺病毒為載體 將置于歸巢素和Msi1增強子和啟動子控制下的綠色熒光蛋白基因導入人胚胎細胞 然后對胚胎細胞進行體外培養(yǎng) 只有NSC能特異性地出現(xiàn)綠色熒光蛋白 再利用流式細胞儀進行熒光篩選 能進一步將NSC收集起來 4 免疫磁珠細胞分選法 利用磁珠表面的特異性抗體與NSC表面抗原結合 在磁場作用下使結合磁珠的NSC與其他細胞分離 從而得到較純化的NSC 神經(jīng)干細胞的分離與純化 神經(jīng)干細胞的鑒定 1990年 Lendahl的實驗證實 神經(jīng)干細胞的標志蛋白是神經(jīng)上皮干細胞蛋白 nestin Nestin在神經(jīng)胚形成時開始表達 隨著神經(jīng)細胞的遷移和分化的完成 Nestin的表達量逐漸下降甚至完全停止 目前 Nestin已被用于神經(jīng)干細胞的鑒定 培養(yǎng)的小鼠神經(jīng)干細胞胚胎小鼠腦側室胚胎小鼠紋狀體 Sakakibara等人鑒定出一種RNA結合蛋白即Musashi 可作為NSC的標志物 Sakakibaraetal 1996 E10 E14 Ventricularzoneofspinalcord m Msi 1 nestin Sakakibaraetal 1996 對分離培養(yǎng)得到的NSC進行標記時發(fā)現(xiàn) Nestin和Musashi呈雙重陽性 且隨著NSC分化成為神經(jīng)元 二者的標記作用也消失 說明Musashi具有與Nestin相似的特異性和種間保守性 Nestin和Musashi作為早期原始神經(jīng)細胞的標志物已被廣泛地應用于NSC的鑒定 應用前景 NSC原位誘導內源性NSC的自身激活 理論依據(jù) 大量體外和在體實驗已經(jīng)證實成年腦中存在NSC 研究影響NSC增殖和分化的信號作用的實驗證實 腦室管膜下區(qū)等部位的NSC在腦損傷發(fā)生后能夠增殖 并遷移到受損部位并分化成新的神經(jīng)細胞 取代受損腦組織細胞 存在困難 在大多數(shù)情況下 僅由內源性干細胞產(chǎn)生的神經(jīng)組織可能不足以替代損傷后缺失的神經(jīng)組織 尤其在脊髓 紋狀體等神經(jīng)組織發(fā)生很少的部位 可能原因 1 原位誘導出功能特異的神經(jīng)元可能需要多種刺激和特定細胞因子的作用 2 患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)的干細胞缺陷或無法激活 異體神經(jīng)干細胞移植 依據(jù) 臨床試驗表明 移植胎兒腦組織治療神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病可以明顯改善癥狀 在體外培養(yǎng)擴增的NSC移植到腦疾病動物模型腦內的實驗表明 體外培養(yǎng)的NSC移植到腦內后能夠遷移分化為特定部位的神經(jīng)細胞 其分化方向與所處的微環(huán)境密切相關 問題 但胎腦的來源有限 受倫理和法律上的束縛 限制研究的發(fā)展 在研究細胞移植治療帕金森病時發(fā)現(xiàn) 在體外實驗中沒有必需的因素干預下 NSC自然分化為多巴胺能神經(jīng)元的比例只占細胞總數(shù)的0 5 5 因此 誘導NSC向修復所需的神經(jīng)功能 目的 細胞分化成為研究的核心問題 基因治療 基因治療是通過特定載體相關外源基因導入體內 使其獲得表達 達到治療由于某種基因缺陷或突變引起的疾病 目前神經(jīng)系統(tǒng)基因治療常用的靶細胞有 1 成纖維細胞 來自間充質 能在體外分裂增殖 具有較高的病毒感染率但植入腦后不能與宿主整合 2 永生化神經(jīng)祖細胞 體外容易進行基因轉導和能與宿主整合等優(yōu)點 但存在致癌的危險 3 NSC來源于神經(jīng)組織 比永生化NSC更能保持原有的生物學特性 具有分化能力和更好的組織相容性 可以整合到宿主腦組織并向周圍遷移 不形成腫瘤等 NSC具有穩(wěn)定的生物學性狀 建系以后可以獲得均一的遺傳背景 具有組織和種屬特異性 可作為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物篩選平臺 利用NSC的多向分化潛能 可篩選出控制和促進NSC向終末細胞分化的藥物 神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物篩選平臺 神經(jīng)干細胞用于治療的可能機理 患病部位組織損傷后釋放各種趨化因子 可以吸引神經(jīng)干細胞聚集到損傷部位 并在局部微環(huán)境的作用下分化為不同種類的細胞 修復及補充損傷的神經(jīng)細胞 由于缺血 缺氧導致的血管內皮細胞 膠質細胞的損傷 使局部通透性增加 另外在多種黏附分子的作用下 神經(jīng)干細胞可以透過血腦屏障 高濃度的聚集在損傷部位 神經(jīng)干細胞可以分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子 促進損傷細胞的修復 神經(jīng)干細胞可以增強神經(jīng)突觸之間的聯(lián)系 建立新的神經(jīng)環(huán)路 傳統(tǒng)的藥物治療效果不令人滿意 吃藥只可暫時性的控制疾病 一旦停藥 病癥復現(xiàn)甚至更嚴重 常年服藥不僅讓患者痛苦不已 而且對身體造成極大的危害 導致其他嚴重疾病的并發(fā) 藥物不具備激活腦神經(jīng)細胞的功能是根本原因 所以要想從根本上治療腦病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病 借助外界移植神經(jīng)干細胞是唯一有效的方法 科學研究證明了神經(jīng)干細胞的定向分化性 使修復和替代死亡的神經(jīng)細胞成為現(xiàn)實 為了減少神經(jīng)損傷的后遺癥 延緩或抑止疾病的進一步發(fā)展 取得更好的恢復效果 從根本上修復和激活死亡神經(jīng)細胞是十分必要的 神經(jīng)干細胞治療疾病的意義 神經(jīng)干細胞移植后神經(jīng)是否存在有免疫反應 神經(jīng)干細胞移植是否有產(chǎn)生腫瘤的可能 神經(jīng)干細胞腦內移植的最佳時機是什么 雖然神經(jīng)干細胞在取得一定進展 但大多是在動物實驗上 應用于臨床還需一段時間 目前 神經(jīng)干細胞的增殖 分化及定向 遠距離遷移的調控機制還不清楚 移植用細胞類型是選擇神經(jīng)干細胞還是定向誘導后的成熟細胞或介于兩者之間的祖細胞 還沒有系統(tǒng)的比較研究 神經(jīng)干細胞的建系及神經(jīng)干細胞作為轉基因載體治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的療效和安全性等問題均有待解決 存在問題 神經(jīng)干細胞與神經(jīng)心理學